Seleção de biocompostos antimicrobianos produzidos por bactérias lácticas

Resumo: O setor agroindustrial de produção de carne suína e de frango representa uma importante atividade econômica no Brasil, conta com tendências de crescimento visando suprir a crescente demanda mundial por alimentos e, ao mesmo tempo, sofre com restrições legais quanto ao uso de antibióticos durante o manejo dos animais, resultado de um mercado consumidor mais exigente. Dessa forma, este estudo teve por objetivo selecionar linhagens a partir de isolados bacterianos e leveduras com potencial para a produção de compostos inibitórios ao desenvolvimento das bactérias patogênicas Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, tipicamente responsáveis por infecções gastrointestinais em saúde animal. Fazendo uso da técnica de microdiluição em caldo, o potencial antimicrobiano foi observado inicialmente nos extratos brutos de 39 bactérias ácido-lácticas (BAL), a partir de um total de 272 linhagens avaliadas. Avaliações subseqüentes revelaram que dentre estas, dez linhagens apresentavam maior regularidade na síntese dos compostos antimicrobianos e, assim, foram selecionadas. Estudos de indução de produção envolvendo as 10 linhagens selecionadas revelaram que o isolado BAL 027 detinha os maiores percentuais inibitórios, superiores a 50% de inibição para as cinco bactérias indicadoras, e que a produção foi especialmente favorecida na fermentação em co-cultivo utilizando cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 como cultura indutora. A cinética de produção de compostos antimicrobianos revelou maior atividade ao final da fase exponencial e na fase estacionária de crescimento da cepa produtora. Foram realizados estudos complementares de caracterização da natureza e sensibilidade dos compostos ativos, que apresentaram estrutura essencialmente protéica e supostamente composta por cadeias laterais glicídicas e lipídicas, fundamentais à ação biológica. A estabilidade da biomolécula foi mantida sob pH ácido até 2,0, e parcialmente perdida sob pH alcalino (8,0 – 12,0), bem como houve perda parcial de atividade pela ação da temperatura, em valores acima de 60ºC. O tamanho molecular estimado da biomolécula foi próximo a 3,0 kDa, o que representaria um peptídeo com ação antimicrobiana. A caracterização molecular de isolados selecionados foi conduzida através da análise dos fragmentos de restrição do gene 16S(ARDRA) e reações de seqüenciamento genético. A análise dos fragmentos de restrição com a enzima HaeIII permitiu observar polimorfismo diante das 10 linhagens de BAL avaliadas, que foram divididas em dois grupos. Através do seqüenciamento genético os gêneros Lactobacillus spp. e Pediococcus spp. foram reconhecidos, sendo uma linhagem de L. plantarum correspondente a cepa BAL 027 de maior interesse nesta pesquisa

Nisina na bioconservação de vinhos de mesa Bordô (Ives) e Niágarade Santa Catarina, Brasil

The searches for new antimicrobial compounds to control the lactic acid bacteria in winemaking are based in the increasing global concern about the chemical preservatives restrictions and the development of super-resistant strains continuously exposed to sulfites in wineries for decades. The antimicrobial activity of the nisin as a biopreservative was studied for Bordô (Ives) and Niágara grape wines from Santa Catarina, Brazil. Measurements of antimicrobial activity were made by well-diffusion assays. From the eleven previously assessed strains of nisinsusceptible lactic bacteria (nisin concentration 1000 IU ml-1), four were selected for definitive assays with nisin (100 IU ml-1) dissolved in the wines. Positive results for inhibition were obtained for the four strains selected. Next, the direct inhibitory action was assessed in wines artificially inoculated and then treated with nisin. After 60 days of storage, there was reduction in the total bacterial population as compared to control, especially in Bordô (Ives) wine, while the physic-chemical parameters were not influenced by the nisin treatment. The inhibitory activity of nisin was not affected when it was dissolved in wine in the antimicrobial assays, and its potential utilization as biopreservative should be able to aid on the control of autochthonous microbiota, but further studies are required to conclude more precisely the nisin effects at long term in wines.As buscas por novos compostos antimicrobianos capazes de inibir a proliferação de bactérias ácido-lácticas na vinificação são motivadas pela crescente preocupação global com as restrições do uso de conservantes químicos, e ainda pelo risco de desenvolvimento de linhagens super-resistentes continuadamente expostas aos sulfitos durante décadas nas vinícolas. A atividade antimicrobiana da nisina como bioconservante foi estudada para vinhos Bordô e Niágara de Santa Catarina. Os ensaios de atividade inibitória foram realizados pela técnica de difusão em poços, inicialmente para 11 bactérias lácticas que se mostraram susceptíveis sob a concentração de 1000 UI mL-1. Dentre estas, quatro foram selecionadas para os ensaios definitivos de nisina dissolvida em vinho sob a concentração de 100 UI mL-1. Foram obtidos resultados positivos para as quatro linhagens. Em seguida, a ação inibitória foi diretamente avaliada em vinhos artificialmente inoculados com as mesmas quatro linhagens e depois tratados com nisina. Depois de 60 dias de estocagem, houve uma redução na população bacteriana total quando comparada ao controle, especialmente para amostra de vinho Bordô (Ives), ao mesmo tempo, os parâmetros físico-químicos do vinho não foram alterados pelo tratamento com nisina. O potencial inibitório da bacteriocina não foi perdido quando dissolvido em vinho, durante os ensaios antimicrobianos em ágar, e seu potencial de utilização como bioconservante poderia contribuir no controle da microbiota autóctone, sendo necessáriosoutros estudos para concluir precisamente os efeitos da nisina nos vinhos em longo prazo

Inibição do crescimento de bactérias Gram-negativas em microdiluição por tratamento com Nisina e EDTA

The outer membrane composition of Gram-negative bacteria provides more resistance against the action of antimicrobial agents from the class of bacteriocins, in comparison to Gram-positive bacteria, naturally more susceptible. Aiming the control of proliferation Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella Typhimurium, antimicrobial assays were performed with nisin as biocidal agent (concentrations 123 to 1,111 AU mL-1) and EDTA as chelating agent, compared to a Gram-positive (Staphylococcus aureus ATCC25923). The susceptibility evaluations were performed in broth microdilution with Mueller-Hinton medium and inoculum with 106 CFU mL-1 of indicator bacterium, and the results were obtained by optical density readings (630 nm) at regular intervals during the incubation period. It was observed that EDTA is capable of reducing cell viability of P. aeruginosa. The bacteriocin nisin demonstrated effective antimicrobial action to four indicator bacteria, under different concentrations. The combined treatments of nisin+EDTA obtained high inhibition rates, and the presence of EDTA was significant only to Gram-negative bacteria. Thus, treatments accounted effective strategies to promote inhibition of cell growth during microdilution broth assays.A composição da membrana externa das bactérias Gram-negativas fornece mais resistência à ação dos agentes antimicrobianos da classe das bacteriocinas, em comparação às bactérias Gram-positivas, naturalmente mais suscetíveis. Com o objetivo de controlar a proliferação de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella Typhimurium, foram realizados ensaios antimicrobianos com nisina como agente biocida (concentrações 123 a 1.111 AU mL-1) e EDTA como agente quelante, comparado a um Gram-positivo (Staphylococcus aureus ATCC25923) . As avaliações de suscetibilidade foram realizadas em microdiluição em caldo com meio Mueller-Hinton e inóculo com 106 UFC-1 de bactéria indicadora, e os resultados foram obtidos por leituras de densidade óptica (630 nm) em intervalos regulares durante o período de incubação. Observou-se que o EDTA é capaz de reduzir a viabilidade celular de P. aeruginosa. A bacteriocina nisina demonstrou ação antimicrobiana eficaz para quatro bactérias indicadoras, sob diferentes concentrações. Os tratamentos combinados de nisina + EDTA obtiveram altas taxas de inibição e a presença de EDTA foi significativa apenas para bactérias Gram-negativas. Assim, os tratamentos representaram estratégias eficazes para promover a inibição do crescimento celular durante ensaios de caldo de microdiluição

Seleção de biocompostos antimicrobianos produzidos por bactérias lácticas

Resumo: O setor agroindustrial de produção de carne suína e de frango representa uma importante atividade econômica no Brasil, conta com tendências de crescimento visando suprir a crescente demanda mundial por alimentos e, ao mesmo tempo, sofre com restrições legais quanto ao uso de antibióticos durante o manejo dos animais, resultado de um mercado consumidor mais exigente. Dessa forma, este estudo teve por objetivo selecionar linhagens a partir de isolados bacterianos e leveduras com potencial para a produção de compostos inibitórios ao desenvolvimento das bactérias patogênicas Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, tipicamente responsáveis por infecções gastrointestinais em saúde animal. Fazendo uso da técnica de microdiluição em caldo, o potencial antimicrobiano foi observado inicialmente nos extratos brutos de 39 bactérias ácido-lácticas (BAL), a partir de um total de 272 linhagens avaliadas. Avaliações subseqüentes revelaram que dentre estas, dez linhagens apresentavam maior regularidade na síntese dos compostos antimicrobianos e, assim, foram selecionadas. Estudos de indução de produção envolvendo as 10 linhagens selecionadas revelaram que o isolado BAL 027 detinha os maiores percentuais inibitórios, superiores a 50% de inibição para as cinco bactérias indicadoras, e que a produção foi especialmente favorecida na fermentação em co-cultivo utilizando cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 como cultura indutora. A cinética de produção de compostos antimicrobianos revelou maior atividade ao final da fase exponencial e na fase estacionária de crescimento da cepa produtora. Foram realizados estudos complementares de caracterização da natureza e sensibilidade dos compostos ativos, que apresentaram estrutura essencialmente protéica e supostamente composta por cadeias laterais glicídicas e lipídicas, fundamentais à ação biológica. A estabilidade da biomolécula foi mantida sob pH ácido até 2,0, e parcialmente perdida sob pH alcalino (8,0 – 12,0), bem como houve perda parcial de atividade pela ação da temperatura, em valores acima de 60ºC. O tamanho molecular estimado da biomolécula foi próximo a 3,0 kDa, o que representaria um peptídeo com ação antimicrobiana. A caracterização molecular de isolados selecionados foi conduzida através da análise dos fragmentos de restrição do gene 16S(ARDRA) e reações de seqüenciamento genético. A análise dos fragmentos de restrição com a enzima HaeIII permitiu observar polimorfismo diante das 10 linhagens de BAL avaliadas, que foram divididas em dois grupos. Através do seqüenciamento genético os gêneros Lactobacillus spp. e Pediococcus spp. foram reconhecidos, sendo uma linhagem de L. plantarum correspondente a cepa BAL 027 de maior interesse nesta pesquisa