Regulation der Aufnahme und Synthese des kompatiblen Soluts Glycinbetain durch GbsR-Typ Regulatoren

Zum Schutz vor osmotischem Stress akkumuliert Bacillus subtilis kompatible Solute um den Zellturgor aufrecht zu erhalten. Eines dieser kompatiblen Solute ist Glycinbetain, das entweder durch die Opu-Transporter aus der Umwelt aufgenommen werden kann, oder ausgehend von dem zuvor importierten Vorläufer Cholin durch die Dehydrogenasen GbsB und GbsA synthetisiert werden kann. Stromaufwärts des gbsAB Operons ist das Gen gbsR lokalisiert, das für einen Cholin-abhängigen MarR-Typ Repressor kodiert, der sowohl die Expression des gbsAB Operons als auch das Gencluster des Cholin-spezifischen ABC-Transporters OpuB kontrolliert (Nau-Wagner et al., 2012). Dieser Regulator vermittelt die Repression seiner Zielgene durch einen “Road-Block” Mechanismus, wofür ein „inverted repeat“ stromabwärts des gbsAB und opuB Transkriptionsstarts gebunden wird. Eine Mutagenesestudie auf Basis eines Homologiemodels des dimeren GbsR Proteins zeigte, dass Cholin durch eine aromatische Ligundenbindetasche in GbsR gebunden wird. Diese ähnelt den Bindetaschen aus Substratbindeproteinen, die mit ABC-Transportern für kompatible Solute assoziiert sind. Umfangreiche bioinformatische Analysen zeigten, dass GbsR den Prototyp für eine neue Sub-Familie der MarR-Typ Regulatoren darstellt. Diese beinhaltet Regulatoren, die mit der Glycinbetain Synthese, Aufnahmesystemen für kompatible Solute und Sauerstoff Reduktasen des Cytochrom bd-Typs assoziiert sind. Die Regulatoren sind innerhalb der Bacteria und Archae weit verbreitet. In B. subtilis sind Gene für GbsR-Typ Regulatoren mit den nahe verwundten Operonen opuB (YvaV) und opuC (OpcR) assoziiert (Nau-Wagner et al., 2012; Lee et al., 2013). Die beiden Gencluster zeigen ein sehr unterschiedliches Expressionsmuster in Antwort auf verschiedene extrazelluläre Salinitäten. Jedoch teilen sie die Regulation durch den GbsR-Typ Repressor OpcR, der in die Reetablierung der opuC Repression unter Hochsalzbedingungen involviert ist. Diese Funktion steht im Einklang mit der osmotischen Induktion des opcR Gens. Die Expression des opuB und opuC Operons ist zudem, durch den Regulator RemA, der als Aktivator der Biofilmmatrix Synthese agiert, mit der Biofilmbildung verknüpft (Winkelman et al., 2013). In B. subtilis ist kein GbsR-Typ Regulator mit dem opuA Operon assoziiert. Dies ist jedoch der Fall in dem marinen Bakterium Bacillus infantis. OpuAR wird durch ein Gen in direkter Nachbarschaft des opuA Genclusters kodiert und agiert als Cholin- und Glycinbetain-abhängiger Repressor der opuA Expression. Im Gegensatzt zu zuvor untersuchten Aufnahmesystemen für kompatible Solute zum Zweck der Osmoprotektion wird die opuA Transkription nicht durch erhöhte Osmolaritäten induziert. Stattdessen findet eine Induktion in Gegenwart der Substrate des Transporters statt. Zusammenfassend demonstrieren die Argebnisse der vorliegenden Arbeit die hochgradig komplexe Regulation von Bakteriellen Anpassungsmechanismen, die das Überleben der Zelle unter osmotisch ungünstigen Bedingungen sicherstellen

The GbsR Family of Transcriptional Regulators: Functional Characterization of the OpuAR Repressor

Accumulation of compatible solutes is a common stress response of microorganisms challenged by high osmolarity; it can be achieved either through synthesis or import. These processes have been intensively studied in Bacillus subtilis, where systems for the production of the compatible solutes proline and glycine betaine have been identified, and in which five transporters for osmostress protectants (Opu) have been characterized. Glycine betaine synthesis relies on the import of choline via the substrate-restricted OpuB system and the promiscuous OpuC transporter and its subsequent oxidation by the GbsAB enzymes. Transcription of the opuB and gbsAB operons is under control of the MarR-type regulator GbsR, which acts as an intracellular choline-responsive repressor. Modeling studies using the X-ray structure of the Mj223 protein from Methanocaldococcus jannaschii as the template suggest that GbsR is a homo-dimer with an N-terminal DNA-reading head and C-terminal dimerization domain; a flexible linker connects these two domains. In the vicinity of the linker region, an aromatic cage is predicted as the inducer-binding site, whose envisioned architecture resembles that present in choline and glycine betaine substrate-binding proteins of ABC transporters. We used bioinformatics to assess the phylogenomics of GbsR-type proteins and found that they are widely distributed among Bacteria and Archaea. Alignments of GbsR proteins and analysis of the genetic context of the corresponding structural genes allowed their assignment into four sub-groups. In one of these sub-groups of GbsR-type proteins, gbsR-type genes are associated either with OpuA-, OpuB-, or OpuC-type osmostress protectants uptake systems. We focus here on GbsR-type proteins, named OpuAR by us, that control the expression of opuA-type gene clusters. Using such a system from the marine bacterium Bacillus infantis, we show that OpuAR acts as a repressor of opuA transcription, where several compatible solutes (e.g., choline, glycine betaine, proline betaine) serve as its inducers. Site-directed mutagenesis studies allowed a rational improvement of the putative inducer-binding site in OpuAR with respect to the affinity of choline and glycine betaine binding. Collectively, our data characterize GbsR-/OpuAR-type proteins as an extended sub-group within the MarR-superfamily of transcriptional regulators and identify a novel type of substrate-inducible import system for osmostress protectants

Regulation der Aufnahme und Synthese des kompatiblen Soluts Glycinbetain durch GbsR-Typ Regulatoren

Zum Schutz vor osmotischem Stress akkumuliert Bacillus subtilis kompatible Solute um den Zellturgor aufrecht zu erhalten. Eines dieser kompatiblen Solute ist Glycinbetain, das entweder durch die Opu-Transporter aus der Umwelt aufgenommen werden kann, oder ausgehend von dem zuvor importierten Vorläufer Cholin durch die Dehydrogenasen GbsB und GbsA synthetisiert werden kann. Stromaufwärts des gbsAB Operons ist das Gen gbsR lokalisiert, das für einen Cholin-abhängigen MarR-Typ Repressor kodiert, der sowohl die Expression des gbsAB Operons als auch das Gencluster des Cholin-spezifischen ABC-Transporters OpuB kontrolliert (Nau-Wagner et al., 2012). Dieser Regulator vermittelt die Repression seiner Zielgene durch einen “Road-Block” Mechanismus, wofür ein „inverted repeat“ stromabwärts des gbsAB und opuB Transkriptionsstarts gebunden wird. Eine Mutagenesestudie auf Basis eines Homologiemodels des dimeren GbsR Proteins zeigte, dass Cholin durch eine aromatische Ligundenbindetasche in GbsR gebunden wird. Diese ähnelt den Bindetaschen aus Substratbindeproteinen, die mit ABC-Transportern für kompatible Solute assoziiert sind. Umfangreiche bioinformatische Analysen zeigten, dass GbsR den Prototyp für eine neue Sub-Familie der MarR-Typ Regulatoren darstellt. Diese beinhaltet Regulatoren, die mit der Glycinbetain Synthese, Aufnahmesystemen für kompatible Solute und Sauerstoff Reduktasen des Cytochrom bd-Typs assoziiert sind. Die Regulatoren sind innerhalb der Bacteria und Archae weit verbreitet. In B. subtilis sind Gene für GbsR-Typ Regulatoren mit den nahe verwundten Operonen opuB (YvaV) und opuC (OpcR) assoziiert (Nau-Wagner et al., 2012; Lee et al., 2013). Die beiden Gencluster zeigen ein sehr unterschiedliches Expressionsmuster in Antwort auf verschiedene extrazelluläre Salinitäten. Jedoch teilen sie die Regulation durch den GbsR-Typ Repressor OpcR, der in die Reetablierung der opuC Repression unter Hochsalzbedingungen involviert ist. Diese Funktion steht im Einklang mit der osmotischen Induktion des opcR Gens. Die Expression des opuB und opuC Operons ist zudem, durch den Regulator RemA, der als Aktivator der Biofilmmatrix Synthese agiert, mit der Biofilmbildung verknüpft (Winkelman et al., 2013). In B. subtilis ist kein GbsR-Typ Regulator mit dem opuA Operon assoziiert. Dies ist jedoch der Fall in dem marinen Bakterium Bacillus infantis. OpuAR wird durch ein Gen in direkter Nachbarschaft des opuA Genclusters kodiert und agiert als Cholin- und Glycinbetain-abhängiger Repressor der opuA Expression. Im Gegensatzt zu zuvor untersuchten Aufnahmesystemen für kompatible Solute zum Zweck der Osmoprotektion wird die opuA Transkription nicht durch erhöhte Osmolaritäten induziert. Stattdessen findet eine Induktion in Gegenwart der Substrate des Transporters statt. Zusammenfassend demonstrieren die Argebnisse der vorliegenden Arbeit die hochgradig komplexe Regulation von Bakteriellen Anpassungsmechanismen, die das Überleben der Zelle unter osmotisch ungünstigen Bedingungen sicherstellen