Sondas fluorescentes: um avanço na avaliação da integridade estrutural e funcional de espermatozoides

The semen quality is a determining factor for obtaining good results with reproductive biotechnologies, such as artificial insemination (AI). Thus, the evaluation of sperm parameters is essential to determine the fertility of gametes. Assessment techniques that best predict in vitro fertility of sperm have been relentlessly pursued with the purpose of ensuring better results after AI. However, until now, no evaluation methodology alone was efficient for this purpose. Then it is recommended to associate the use of these techniques to better predict the fertilizing ability of spermatozoa. In recent years a great number of new strategies were developed for semen evaluation, with the highlighted use of fluorescent probes. These techniques have limited use due to unfamiliarity with their employment. The aim of this paper is to review the advances on semen evaluation and prediction of their fertilising ability, with emphasis on those based on fluorescent probes.A qualidade do sêmen é um fator determinante para se obter bons resultados com a utilização de biotécnicas reprodutivas como a inseminação artificial (IA). Desta forma, torna-se essencial a avaliação dos parâmetros espermáticos que determinem a fertilidade destes gametas. Técnicas de avaliação que melhor predigam a fertilidade in vitro dos espermatozoides têm sido buscadas incessantemente, a fim de garantir melhores resultados após IA. Entretanto, até o momento, nenhuma metodologia de avaliação mostrouse efi ciente para este fim, quando utilizada isoladamente, sendo recomendado o emprego conjunto destas técnicas para a melhor predição da capacidade fertilizante dos espermatozoides. Nos últimos anos uma série de novas estratégias foram desenvolvidas para avaliação de sêmen, dentre as quais se destaca o emprego das sondas fluorescentes. Estas técnicas são utilizadas com limitações em função do desconhecimento de seu emprego. Esta revisão tem como objetivo abordar os avanços na avaliação do sêmen e a predição de sua capacidade fertilizante, com ênfase nas que se baseiam no uso de sondas fluorescentes

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DA SEXAGEM ESPERMÁTICA NA PRODUÇÃO ANIMAL

The predetermination of progeny sex is a desire among breeders, since it allows the sexing of born animals according the purpose of the production system. With the discovery of the sex chromosomes X and Y, the sex pre-selection studies followed a scientific direction, in order to develop techniques for the separation of sperm populations with these chromosomes. For this purpose it was developed and improved the flow cytometer separation method, which is highly accurate, although presenting a high cost and causing sperm injuries. Therefore, alternative protocols have been sought to enable sperm sexing, without major structural and functional damage to gametes, with emphasis on Percoll® density gradients. Due to the biotechnological potential of sperm sexing, in order to maximize the animal production, it was objectified in this review expose the positive and negative points of the two main techniques used for this purpose.A predeterminação do sexo da progênie é um desejo entre os criadores, uma vez que permite o direcionamento do sexo dos animais nascidos, segundo a finalidade do sistema de produção. Com a descoberta dos cromossomos sexuais X e Y, estudos para a pré-seleção do sexo seguiram um direcionamento científico, a fim de desenvolver técnicas para a separação das populações de espermatozoides portadores destes cromossomos. Com esta finalidade foi desenvolvido e aprimorado o método de separação em citômetro de fluxo, que é de alta precisão, embora apresente custo elevado e cause injúrias aos espermatozoides. Por conseguinte, protocolos alternativos vêm sendo buscados para viabilizar a sexagem espermática, sem maiores prejuízos estruturais e funcionais aos gametas, no que se destacam os gradientes de densidade de Percoll®. Em decorrência do potencial biotecnológico da sexagem espermática, visando maximizar a produção animal, foi objetivado com esta revisão expor os pontos positivos e negativos das duas principais técnicas usadas para este fim

Congelação de sêmen caprino: : as duas faces da moeda

Although the niche market for goat breeding products is on the rise, this activity is still carried out in family and disorganized systems. Thus, technification of this sector is necessary, including the introduction of reproduction biotechnology, such as semen cryopreservation and artificial insemination (AI). Semen freezing enables the breeder to improve the genetic quality of their herds at a lower cost, increasing the male potential without limit of time or space, and facilitating breeding management when in association with AI. As a consequence, the productivity and profitability of this sector is elevated, which could favor the transition from a livestock subsistence system to an industrial one. Nevertheless, the use of frozen semen of goats still presents some limitations, since the extender and procedures used for this biotechnology subject the gametes to numerous structural and functional injuries, both lethal and sublethal. These factors are reflected in the fertility rates, which are reduced after AI with frozen goat semen. In this perspective, the objective of the current review work is to report the positive and negative aspects of semen freezing biotechnology, with emphasis on the goat species.O nicho consumidor de produtos da caprinocultura se encontra em plena ascensão. Apesar disso, tal atividade pecuária ainda é realizada em sistema familiar e de forma desorganizada. Deste modo, a tecnificação do setor é necessária, inclusive pela introdução de biotécnicas da reprodução, como a criopreservação de sêmen e a inseminação artificial (IA). O uso do sêmen congelado possibilita ao produtor melhorar a qualidade genética de seu rebanho a um menor custo, ampliar o potencial do reprodutor sem limite de tempo ou espaço e facilitar o manejo das criações, quando em associação a IA. Como consequência, são elevadas a produtividade e lucratividade do setor, o que inclusive favorece a transição de um sistema pecuário de subsistência para o industrial. Contudo, a congelação do sêmen caprino e o seu uso ainda apresenta certas limitações, visto que os diluidores e procedimentos empregados para esta biotécnica submetem os gametas à inúmeras injúrias estruturais e funcionais, letais e subletais. Tais fatos se refletem nas taxas de fertilidades, as quais se mostram reduzidas após a IA com sêmen congelado caprino. Diante dessa perspectiva, foi objetivado com este trabalho de revisão expor os pontos positivos e negativos da biotécnica da congelação de sêmen, com ênfase para a espécie caprina

Mandibulectomy in feline with bacterial fibrosing osteomyelitis

Background: Fibrosing osteomyelitis is a chronic inflammatory process caused by infectious agents that lead to the destruction and replacement of bone tissue by fibroblasts. The diagnosis is based especially on histopathological and bacterial culture. In cases where extensive and irreversible injuries are observed, surgical treatment may be indicated. The objective of this work is to report the clinical, radiographic, histopathological, and microbiological aspects of a cat presenting fibrosing osteomyelitis.Case: A 10-year-old male feline, no defined breed, weighing 3.9 kg was referred to one Private Veterinary Clinic of Fortaleza, CE, Brazil with a history of left mandibular enlargement, presenting dysphagia, sialorrhea, an increase in firm consistency along of the left mandibular body, temporomandibular arthralgia and decreased joint motion range. On cranium radiograph, signs of proliferative osteopathy of irregular contours were observed in the branch and body of the left mandible and extending to the rostral region of the right mandible, suggesting a neoplastic process. After anesthesia, for better assessment of the oral cavity, a sample was collected by incisional biopsy, however, the histopathological result was nonspecific. In view of the inconclusive condition, it was decided to perform left hemimandibulectomy combined with right partial mandibulectomy. Tissue samples were obtained and sent for microbiological and histopathological analyses. The last test revealed an inflammatory reaction consisting of neutrophils and plasma cells, associated with a large amount of fibrous connective tissue, multifocal bacterial aggregates, necrosis and bone resorption. Based on the findings, the diagnosis of chronic bacterial osteomyelitis was concluded. The microbiological culture demonstrated the growth of the bacterium Pseudomonas aeruginosa, with sensitivity to cefovecin, which was administered to the treatment in doses of 8 mg/kg/SC, every 15 days, for 60 days. After 10 days of the surgery, the patient was able to start the process of swallowing and seizing pasty food.Discussion: Although radiography is a diagnostic method of choice to assess the extent of bone involvement, it hardly allows the distinction between neoplastic processes and osteomyelitis. Thus, in addition to the cranium radiographic examination, that revealed signs of proliferative osteopathy with irregular contours in branch and body topography of the left mandible were required biopsy and bacterial culture. After mandibulectomy, difficulty in retracting the tongue and anorexia were observed in the first days. Despite that, from the 12th day on, there was an improvement in food seizure, with the return to voluntary feeding. Mandibulectomy is indicated in cases where extensive and irreversible lesions are observed, although excision of the caudal mandible to the third or fourth premolar tooth is not recommended, because it compromises the sublingual musculature, with fall of the tongue and loss of function apprehension. In the present case, the caudal portion of the right mandibular branch was maintained, which facilitated the return of spontaneous feeding. The tissue removed was necessary to perform a microbiological culture with antibiogram, essential to determine the possible etiologic agent and choosing antimicrobial drugs. For the treatment of P. aeruginosa infection, cefovecin was prescribed due to the dosage and route of administration that collaborate with the mandibular surgery, once that the oral treatment is more difficult. Post-surgical complications related to mandibular resection, such as anorexia and difficulty in grasping food, are common. However, in the present case, the patient had an adequate reestablish after 15 days. Therefore, hemimandibulectomy is effective in treating fibrosing osteomyelitis, with maintenance of the patient's ingestive function.

Influência da temperatura sobre a função testicular

As células da linhagem germinativa são sensíveis a ação do calor, sendo a termorregulação um fator determinante para o sucesso reprodutivo. O aumento da temperatura testicular pode ocorrer devido a fatores internos ou externos e contribui para o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, induzindo, assim, a degeneração testicular e perda de células germinativas. Em adição, mudanças nos níveis de testosterona e de corticosteroides em animais submetidos ao estresse térmico podem ser observadas e interferem na capacidade reprodutiva dos mesmos. Por outro lado, em resposta ao calor e com finalidade protetora, há o aumento da síntese de proteínas de choque térmico (HSP). Desta forma, a quantidade e qualidade do sêmen e, consequentemente, a fertilidade são comprometidas pelo estresse térmico testicular, o que torna a realização de estudos que aprofundem o conhecimento sobre as alterações causadas indispensáveis, inclusive para a busca de terapias que preservem e reparem as funções testiculares.

Soybean lecithin-based extender as an alternative for goat sperm cryopreservation

AbstractThe aim of this study was to evaluate the effect of different concentrations of soybean lecithin (SL) in extenders for sperm goat cryopreservation. Sexually mature male Saanen goats (n=4) were used, and the ejaculates were obtained using an artificial vagina method. The semen samples were pooled and diluted in a skim milk-based extender (control group; CG) or Tris extender supplemented with SL at different concentrations (G1=0.04%, SL G2=0.08% SL and G3=0.16%) for a final concentration of 240×106spermatozoa/mL. The semen samples were packed in straws (0.25mL), frozen using an automated system and stored in liquid nitrogen (−196°C). After thawing (37°C/30s), the samples were evaluated for sperm quality parameters, including sperm motility, membrane integrity, acrosome integrity and mitochondrial activity. No significant difference was observed among the experimental and control groups for all of the parameters (P>0.05). However, even though the control group presented a significantly lower mitochondrial membrane potential compared to fresh semen (P<0.05), the same did not occur for the extender supplemented with soybean lecithin, that is, it did not differ from fresh sperm (P>0.05). The extender containing soybean lecithin at different concentrations preserved the sperm quality parameters in a manner similar to the conventional skim milk-based extender. Thus, it is concluded that an extender containing soybean lecithin as the lipoprotein source can be used for freezing goat semen

THYROIDECTOMY ASSOCIATED WITH CHEMOTHERAPY IN A DOG PRESENTING CARCINOMA IN THE THYROID GLAND

This study aimed to describe a case of compact thyroid carcinoma in a dog, emphasizing the diagnosis, treatment, and clinical evolution. An 11-year-old mixed-breed male canine was attended at a private clinic, complaining of swelling in the ventral cervical region and difficulty breathing. A mass close to the thyroid gland was observed in the cervical ultrasound and a mixed tumor was identified by cytology. Based on follow-up exams, the therapeutic approach to be adopted was determined: total surgical resection of the right portion of the thyroid gland, together with the parathyroid glands, followed by chemotherapy with doxorubicin. The histopathology of the tissue removed confirmed the compact thyroid carcinoma. After thyroid removal, signs of hypothyroidism were confirmed by the hormonal dosage and the canine received hormone replacement with Levothyroxine as treatment, ceasing the symptoms. During routine follow-up, the presence of miliary pulmonary metastases was identified. The patient continued with the chemotherapy sessions, presenting a stable condition for almost 6 months after starting the treatment. However, clinical signs of dyspnea were manifested, resulting in a gradual worsening. Thus, the tutors chose to euthanize the animal after 9 months of treatment. According to the case described, thyroidectomy is an option of treatment for cases of thyroid carcinoma with wide dimensions. However, the technique’s success depends on the effective and complete removal of the affected tissue due to the high frequency of metastases and the possible occurrence of secondary hypothyroidism.Objetivou-se, neste trabalho, descrever um caso de carcinoma compacto de tireoide em cão, enfatizando o diagnóstico, o tratamento e a evolução clínica. O paciente foi atendido em uma clínica particular, sendo um canino macho, sem raça definida, de 11 anos, com queixa de edema cervical ventral e dificuldade respiratória. Pela ultrassonografia cervical, foi observada uma massa próxima à glândula tireoide e pela citologia, um tumor misto. A partir dos exames de acompanhamento, foi determinada a conduta terapêutica a ser adotada: ressecção cirúrgica total da porção direita da glândula tireoide, junto às paratireoides, seguida de quimioterapia com doxorrubicina. A histopatologia do tecido removido confirmou o carcinoma compacto da tireoide. Após a remoção da tireoide, sinais de hipotireoidismo foram confirmados pela dosagem hormonal, sendo feita reposição hormonal com Levotiroxina, cessando os sintomas. Durante o acompanhamento de rotina, foi identificada a presença de metástase pulmonar miliar. O paciente continuou suas sessões de quimioterapia, mantendo um quadro estável por quase seis meses após o início do tratamento. No entanto, sinais clínicos de dispneia foram manifestados, com piora gradativa do quadro, tendo os tutores optado pela eutanásia do animal após nove meses do início do tratamento. De acordo com o exposto, conclui-se que a tireoidectomia é um tratamento de escolha para os casos de carcinoma de tireoide com amplas dimensões. Entretanto, o sucesso da técnica depende da remoção efetiva e completa do tecido afetado, devido à alta frequência de metástases, além de poder ser acompanhada por um quadro de hipotireoidismo secundário

Efeito da adição de antioxidantes ao gradiente contínuo de densidade de percoll e ao diluidor de congelação sobre os espermatozoides caprinos selecionados e congelados

Objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações de antioxidantes fenólicos sobre a congelabilidade de espermatozoides caprinos, bem como a ação destes durante a centrifugação em gradientes contínuos de densidade de Percoll e após congelação do sêmen selecionado. Foram utilizados seis pools de sêmen caprino por experimento. Nos dois primeiros experimentos cada pool de sêmen foi processado e diluído em meio à base de leite desnatado (7% glicerol), acrescido ou não de antioxidantes, de acordo com o experimento e o grupo experimental [Experimento 1: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100 μM de catequina ou de epigalocatequina galato (EGCG); Experimento 2: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100 μM de resveratrol ou de quercetina]. No terceiro experimento, cada pool de sêmen foi centrifugado em gradiente contínuo de densidade de Percoll e congelado, de acordo com o grupo experimental (NS=não selecionado; S=selecionado; SC75=selecionado com 75 μM de catequina; SE100=selecionado com 100 μM de EGCG; SQ25=selecionado com 25 μM de quercetina; SR25=selecionado com 25 μM de resveratrol; SR75=selecionado com 75 μM de resveratrol). No Experimento 1, imediatamente após a descongelação, as velocidades linear progressiva (VSL) e média da trajetória (VAP) foram superiores (P<0,05) no grupo tratado com 15 μM de catequina do que com 50 e 100 μM; a oscilação (WOB) foi maior (P<0,05) com 0, 15 e 25 μM de catequina do que com 100 μM; e o batimento flagelar cruzado (BCF) foi maior (P<0,05) com 75 e 100 μM de catequina do que com 0 μM. A motilidade progressiva (MP) foi maior (P<0,05) com 0 e 15 μM de EGCG do que com 50 e 75 μM e a linearidade (LIN) foi maior (P<0,05) com 0 μM de EGCG do que com 100 μM. No Experimento 2, a WOB foi maior (P<0,05) com 0 e 25 μM de resveratrol ou 0 μM de quercetina do que com 100 μM, imediatamente após a descongelação. Para o Experimento 3, a MP, LIN, retilinearidade (STR) e WOB dos grupos selecionados em gradientes de Percoll foram maiores (P<0,05) do que as do NS; nos grupos SC75, SR25 e SR75 a VSL foi maior (P<0,05) do que no NS; a amplitude de deslocamento lateral de cabeça (ALH) foi maior (P<0,05) no grupo NS do que nos demais e o SQ25 reduziu (P<0,05) o potencial de membrana mitocondrial, em relação aos demais grupos. Após descongelação do sêmen, a MP, LIN, WOB, VSL e VAP foram maiores (P<0,05) nos grupos selecionados do que no NS, com exceção do SE100 e SQ25; o SC75 teve maior (P<0,05) STR do que o NS; a ALH foi menor (P<0,05) nos grupos S, SC75, SR25 e SR75 do que no NS; e o BCF foi menor no S do que no NS. A integridade de membrana plasmática foi maior (P<0,5) nos grupos selecionados do que no NS, com exceção do SE100; a porcentagem de células intactas e de não mortas foi maior (P<0,05) nos grupos selecionados do que no NS. Conclui-se que altas concentrações (50 a 100 μM) de catequina e EGCG inibem a cinética de espermatozoides congelados de caprinos, em caráter transitório, e que o resveratrol e a quercetina não têm qualquer influência sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Por outro lado, a seleção de espermatozoides em gradientes contínuos de densidade de Percoll é uma metodologia viável para a espécie caprina e compatível com o processo de congelação; independente da terapian antioxidante usada.It was aim to evaluate the effect of different concentrations of phenolic antioxidants on freezability of goats sperm, as well as their action during centrifugation in continuous Percoll density gradients and after selected semen freezing. Six goat semen pools were used for each of the three experiments. In the first two experiments, each semen pool was processed and diluted in the skimmed milk based extender (7 % glycerol), with or without antioxidants, according to experiment and experimental group [1 Experiment: 0, 15, 25, 50, 75 or 100 μM catechin or epigallocatechin gallate (EGCG); Experiment 2: 0, 15, 25, 50, 75 or 100 μM resveratrol or quercetin]. In Experiment 3, each semen pool was centrifugated in continuous Percoll density gradients and frozen (with or without antioxidants) according to experimental groups (NS=non selected; S= selected; SC75= selected with 75 μM catechin; SE100= selected with 100 μM EGCG; SQ25=selected with 25 μM quercetin; SR25=selected with 25 μM resveratrol; SR75=selected with 75 μM resveratrol). In Experiment 1, immediately after thawing, the straight linear velocity (VSL) and average path velocity (VAP) were greater (P<0.05) in 15 μM catechin than in 50 and 100 μM; wobble (WOB) was higher (P<0.05) in catechin 0, 15 and 25 μM than in 100 μM; beat cross frequency (BCF) was higher (P<0.05) in 75 and 100 μM catechin than in 0 μM. Progressive motility (PM) was greater (P<0.05) with 0 and 15 μM EGCG than with 50 and 75 μM; and linearity (LIN) was higher with 0 μM EGCG than with 100 μM. In Experiment 2 WOB was higher (P<0.05) in 0 and 25 μM resveratrol or 0 μM quercetin than 100 μM, immediately after thawing. In Experiment 3, immediately after sexing, PM, LIN, straightness (STR) and WOB from sexed groups were higher (P<0.05) than those from NS; SC75, VSL was higher (P<0.05) in SR25 and SR75 than in NS; amplitude of lateral movement of the head (ALH) was higher (P<0.05) in the NS than in other groups. SQ25 reduced (P<0.05) the mitochondrial membrane potential, compared to other groups. After thawing, PM, LIN, WOB, VSL and VAP were higher (P<0.05) in sexed groups than in NS, except to SE100 and SQ25; SC75 had greater (P<0.05) STR than NS; ALH was lower (P<0.05) in S, SC75, SR25 and SR75 than in NS; BCF was lower (P<0.05) in S than in NS; plasma membrane integrity was higher (P<0.05) in sexed groups than in NS, except to SE100; the percentage of intact and not dead cells was greater (P<0.05) in sexed groups than in NS. We concluded that, under the experimental conditions used, high concentrations (50 to 100 μM) of catechin inhibit the kinematics of frozen goat sperm in transitory way, and that resveratrol does not have any influence on goat semen freezability. Moreover, sex selection in continuous Percoll density gradients is feasible methodology to goats and compatible with freezing process; independent of antioxidant therapy used.Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPqCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPE

Efeito da adição de diferentes crioprotetores e antioxidantes na criopreservação do sêmen de ovinos da raça Santa Inês

Objetivando-se avaliar o efeito da adição de diferentes crioprotetores (glicerol, etileno glicol ou acetamida) e antioxidantes (resveratrol – R e quercetina – Q) na viabilidade in vitro de amostras congeladas de sêmen ovino, foram utilizados quatro reprodutores adultos, mestiços da raça Santa Inês. Após colheita com vagina artificial, alíquotas de sêmen foram avaliadas macroscópica e microscopicamente e o pool de sêmen foi subdividido e diluído em Tris-gema, de acordo com os experimentos e grupos experimentais. No Experimento I, no qual foram avaliados os crioprotetores, os grupos experimentais foram classificados como: G1 = Tris-gema + 5% de glicerol; G2 = Tris-gema + 3% de etileno glicol; G3 = Tris-gema + 5% etileno glicol; G4 = Tris-gema + 2% de acetamida; e G5 = Tris-gema + 7% de acetamida. Em contrapartida, o Experimento II, no qual foram utilizados os tratamentos com antioxidantes, foi dividido em três subexperimentos: Exp. 1 [resveratrol (0, 5, 10, 15 e 20 μg/mL, respectivamente, R0, R5, R10, R15 e R20)]; Exp. 2 [quercetina (0, 5, 10, 15 e 20 μg/mL, respectivamente, Q0, Q5, Q10, Q15 e Q20)]; e Exp. 3 [sem antioxidante (RQ0), 10 μg/mL de resveratrol (R10), 5 μg de quercetina/mL (Q5), e 10 μg/mL de resveratrol + 5 μg/mL de quercetina (R10Q5)]. As alíquotas de sêmen, devidamente diluidas, foram então envasadas em palhetas (0,25 mL) e congeladas (-196 oC), sendo avaliadas após descongelação (37 oC/30 segundos) quanto a motilidade progressiva (MP), vigor, integridade de membrana plasmática (iMP), potencial de membrana mitocondrial (PMM) e integridade do acrossoma (iAC). Constatou-se que no Experimento I, o G1 apresentou MP superior (P0,05) para PMM e iAC. No Experimento II, não se verificou diferença significativa (P>0,05) entre os grupos para os parâmetros MP, vigor, iMP e iAC. O PMM apresentou diferença significativa (P0.05) among groups on the MMP and ACi parameters. In Experiment II, there was no difference among groups on the PM, vigor, PMi and ACi. MMP had significant difference (P<0.05) among experimental groups of their three sub experiments. So, in Exp 1, R0 group (36.67±8.01%) was higher than R20 (22.33±6.16%); in Exp 2, Q0 group (36.25±8.12%) was higher (P<0.05) than Q10 (9.33±6.54%), Q15 (6.25±5.98%) and Q20 (5.17±5.08%), and the Q5 (20.58±12.05%) was higher (P<0.05) than Q15 (6.25±5.98%) and Q20(5.17±5.08%) groups; and in Exp 3, RQ0 group (39.00±16.79%) was higher (P<0.05) than Q5 (18.00±13.76%) and R10Q5 (14.42±7.47%) groups. It can be concluded that glycerol (5%) is more effective in protecting ram spermatozoa submitted to deleterious effects of freezing than ethylene glycol (3 and 5%) and acetamide (2 and 7%); the addition of resveratrol and quercetin phenolic antioxidants, alone or in combination, reduces mitochondrial membrane potential of sperm frozen ram; and other studies should be performed to evaluate different concentrations and the effect of the addition on the fertility rate of ewes inseminated artificially