Genetic adaptation of methylotrophic bacteria for industrial production of chemical compounds

Ce projet a pour objectif l'amélioration de souches châssis méthylotrophes capables de convertir le méthanol fourni comme source de carbone et d'énergie en biomasse et, à terme, en composés chimiques dans les conditions de production industrielle. Le méthanol est une alternative aux glucides en tant que matière première pour les fermentations industrielles, car son utilisation n'entre pas en concurrence avec les denrées alimentaires et il peut être produit par réduction chimique du CO2.Une condition préalable à la production efficace à grande échelle de composés d'intérêt est la stabilité de la souche méthylotrophe productrice dans des concentrations élevées de méthanol. À cette fin, deux souches méthylotrophes apparentées, Methylobacterium extorquens AM1 et TK 0001, qui croissent de façon optimale avec 1% de méthanol, ont été adaptées en culture continue à la prolifération en présence de concentrations de méthanol allant jusqu'à 10%. Ces adaptations ont été réalisées à l'aide des automates de culture GM3, qui permettent de maintenir des populations de microorganismes en croissance à long terme dans des conditions contrôlées.Les courbes de croissance enregistrées pour des isolats issus de populations évoluées ont montré une prolifération accrue en présence de 5 % de méthanol en comparaison avec les cellules non évoluées. Les isolats croissent de façon comparable mais non identique, ce qui suggère une hétérogénéité des cellules adaptées dans une même population.Le séquençage génomique de clones isolés à différentes étapes de l'évolution en concentration croissante de méthanol a révélé des profils mutationnels variés. En revanche, le gène metY codant pour la O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase est muté dans tous les isolats. L'enzyme codée catalyse une réaction secondaire en présence de méthanol produisant la méthoxinine, analogue de la méthionine, connue pour sa toxicité par son incorporation dans les protéines. Les résultats des tests enzymatiques réalisés sur les protéines MetY mutées montrent une perte de fonction presque complète avec le méthanol ainsi qu'avec les substrats naturels, suggérant la participation de MetY dans la toxicité du méthanol.Une analyse transcriptomique a été entreprise afin d'étudier l'expression génique de la souche évoluée G4105 de M. extorquens TK 0001 en réponse à une exposition brève ou prolongée à une concentration élevée de méthanol en comparaison avec la réponse de la souche sauvage. Les gènes impliqués dans la division cellulaire, la structure des ribosomes et des flagelles, la stabilité des protéines et l'absorption du fer montrent une différence d'expression entre les deux souches.Les variantes de M. extorquens TK 0001 adaptées à une concentration élevée de méthanol produisent plus de biomasse à partir de méthanol que les cellules de type sauvage. On peut supposer qu'un composé synthétisé via une voie dérivant du métabolisme central par des cellules adaptées pourrait être produit à partir de méthanol avec un rendement supérieur à celui atteint par des cellules de type sauvage. La production de D-lactate a été testée dans les souches sauvage et évoluée sur-exprimant la lactate déshydrogénase endogène. Les cellules évoluées produisent plus de lactate que la souche contrôle, confirmant ainsi l'intérêt de cette adaptation au méthanol.The objective of this project was the development of enhanced methylotrophic chassis strains capable of converting methanol as carbon and energy source into biomass and ultimately into commodity chemicals under industrial conditions. Methanol is an alternative to carbohydrates as feedstock in industrial biotechnology as its use does not interfere with food supply and its production can start from CO2.A prerequisite for an efficient and large scale industrial fermentation is stable growth of the methylotrophic producer strain on high methanol concentrations. For this purpose, two closely related methylotrophic strains, Methylobacterium extorquens AM1 and TK 0001, which both have a growth optimum at about 1% methanol, were adapted in continuous culture to proliferate stably in the presence of methanol of up to 10% (v/v). The adaptations were conducted using GM3 devices enabling automated long term cultivation of microorganisms.Growth curves recorded for isolates obtained from evolved populations showed enhanced proliferation in the presence of methanol at 5% as compared with wild type cells. The isolates showed comparable albeit not identical growth pointing to heterogeneity among the adapted cells in the population.Genomic sequencing of isolated clones at different steps of the adaptation revealed differences in their mutation profiles. The gene metY coding for O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase was found to be mutated in all isolates. This enzyme undergoes a side reaction with methanol leading to the production of the methionine analogue methoxinine known to be toxic through incorporation into proteins.Enzymatic tests conducted with these mutants showed an almost complete loss of activity even with their natural substrates, validating the involvement of MetY in methanol toxicity.Transcriptomic analysis was performed to study the gene expression response of an evolved derivative of M. extorquens TK 0001 to short and long term exposure to high methanol and compared with the response of the ancestor strain. Genes implicated in cell division, ribosomal and flagellar structures, protein stability and iron uptake showed differences in expression patterns between the strains.The M. extorquens TK 0001 cells adapted to high methanol produced more biomass from methanol than the wildtype cells. This suggests that a compound synthesized through a pathway branching from the central metabolism would be produced in higher yield from methanol by the adapted cells compared to the wildtype cells. The production of D-lactate was tested for wildtype and evolved cells both overexpressing native lactate dehydrogenase. The evolved cells produced more lactate than the control cells, confirming the interest of this methanol adaptation

Adaptation génétique des bactéries methylotrophes à la production industrielle des composés chimiques

The objective of this project was the development of enhanced methylotrophic chassis strains capable of converting methanol as carbon and energy source into biomass and ultimately into commodity chemicals under industrial conditions. Methanol is an alternative to carbohydrates as feedstock in industrial biotechnology as its use does not interfere with food supply and its production can start from CO2.A prerequisite for an efficient and large scale industrial fermentation is stable growth of the methylotrophic producer strain on high methanol concentrations. For this purpose, two closely related methylotrophic strains, Methylobacterium extorquens AM1 and TK 0001, which both have a growth optimum at about 1% methanol, were adapted in continuous culture to proliferate stably in the presence of methanol of up to 10% (v/v). The adaptations were conducted using GM3 devices enabling automated long term cultivation of microorganisms.Growth curves recorded for isolates obtained from evolved populations showed enhanced proliferation in the presence of methanol at 5% as compared with wild type cells. The isolates showed comparable albeit not identical growth pointing to heterogeneity among the adapted cells in the population.Genomic sequencing of isolated clones at different steps of the adaptation revealed differences in their mutation profiles. The gene metY coding for O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase was found to be mutated in all isolates. This enzyme undergoes a side reaction with methanol leading to the production of the methionine analogue methoxinine known to be toxic through incorporation into proteins.Enzymatic tests conducted with these mutants showed an almost complete loss of activity even with their natural substrates, validating the involvement of MetY in methanol toxicity.Transcriptomic analysis was performed to study the gene expression response of an evolved derivative of M. extorquens TK 0001 to short and long term exposure to high methanol and compared with the response of the ancestor strain. Genes implicated in cell division, ribosomal and flagellar structures, protein stability and iron uptake showed differences in expression patterns between the strains.The M. extorquens TK 0001 cells adapted to high methanol produced more biomass from methanol than the wildtype cells. This suggests that a compound synthesized through a pathway branching from the central metabolism would be produced in higher yield from methanol by the adapted cells compared to the wildtype cells. The production of D-lactate was tested for wildtype and evolved cells both overexpressing native lactate dehydrogenase. The evolved cells produced more lactate than the control cells, confirming the interest of this methanol adaptation.Ce projet a pour objectif l'amélioration de souches châssis méthylotrophes capables de convertir le méthanol fourni comme source de carbone et d'énergie en biomasse et, à terme, en composés chimiques dans les conditions de production industrielle. Le méthanol est une alternative aux glucides en tant que matière première pour les fermentations industrielles, car son utilisation n'entre pas en concurrence avec les denrées alimentaires et il peut être produit par réduction chimique du CO2.Une condition préalable à la production efficace à grande échelle de composés d'intérêt est la stabilité de la souche méthylotrophe productrice dans des concentrations élevées de méthanol. À cette fin, deux souches méthylotrophes apparentées, Methylobacterium extorquens AM1 et TK 0001, qui croissent de façon optimale avec 1% de méthanol, ont été adaptées en culture continue à la prolifération en présence de concentrations de méthanol allant jusqu'à 10%. Ces adaptations ont été réalisées à l'aide des automates de culture GM3, qui permettent de maintenir des populations de microorganismes en croissance à long terme dans des conditions contrôlées.Les courbes de croissance enregistrées pour des isolats issus de populations évoluées ont montré une prolifération accrue en présence de 5 % de méthanol en comparaison avec les cellules non évoluées. Les isolats croissent de façon comparable mais non identique, ce qui suggère une hétérogénéité des cellules adaptées dans une même population.Le séquençage génomique de clones isolés à différentes étapes de l'évolution en concentration croissante de méthanol a révélé des profils mutationnels variés. En revanche, le gène metY codant pour la O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase est muté dans tous les isolats. L'enzyme codée catalyse une réaction secondaire en présence de méthanol produisant la méthoxinine, analogue de la méthionine, connue pour sa toxicité par son incorporation dans les protéines. Les résultats des tests enzymatiques réalisés sur les protéines MetY mutées montrent une perte de fonction presque complète avec le méthanol ainsi qu'avec les substrats naturels, suggérant la participation de MetY dans la toxicité du méthanol.Une analyse transcriptomique a été entreprise afin d'étudier l'expression génique de la souche évoluée G4105 de M. extorquens TK 0001 en réponse à une exposition brève ou prolongée à une concentration élevée de méthanol en comparaison avec la réponse de la souche sauvage. Les gènes impliqués dans la division cellulaire, la structure des ribosomes et des flagelles, la stabilité des protéines et l'absorption du fer montrent une différence d'expression entre les deux souches.Les variantes de M. extorquens TK 0001 adaptées à une concentration élevée de méthanol produisent plus de biomasse à partir de méthanol que les cellules de type sauvage. On peut supposer qu'un composé synthétisé via une voie dérivant du métabolisme central par des cellules adaptées pourrait être produit à partir de méthanol avec un rendement supérieur à celui atteint par des cellules de type sauvage. La production de D-lactate a été testée dans les souches sauvage et évoluée sur-exprimant la lactate déshydrogénase endogène. Les cellules évoluées produisent plus de lactate que la souche contrôle, confirmant ainsi l'intérêt de cette adaptation au méthanol

Complete Genome Sequence of the Facultative Methylotroph Methylobacterium extorquens TK 0001 Isolated from Soil in Poland

ABSTRACT Methylobacterium extorquens TK 0001 (DSM 1337, ATCC 43645) is an aerobic pink-pigmented facultative methylotrophic alphaproteobacterium isolated from soil in Poland. Here, we report the whole-genome sequence and annotation of this organism, which consists of a single 5.71-Mb chromosome

Complete Genome Sequence of the Facultative Methylotroph Methylobacterium extorquens

International audienceABSTRACT Methylobacterium extorquens TK 0001 (DSM 1337, ATCC 43645) is an aerobic pink-pigmented facultative methylotrophic alphaproteobacterium isolated from soil in Poland. Here, we report the whole-genome sequence and annotation of this organism, which consists of a single 5.71-Mb chromosome

NADPH-Auxotrophic E-coil: A Sensor Strain for Testing in Vivo Regeneration of NADPH

International audienceInsufficient rate of NADPH regeneration often limits the activity of biosynthetic pathways. Expression of NADPH-regenerating enzymes is commonly used to address this problem and increase cofactor availability. Here, we construct an Escherichia coli NADPH-auxotroph strain, which is deleted in all reactions that produce NADPH with the exception of 6-phosphogluconate dehydrogenase. This strain grows on a minimal medium only if gluconate is added as NADPH source. When gluconate is omitted, the strain serves as a "biosensor" for the capability of enzymes to regenerate NADPH in vivo. We show that the NADPH-auxotroph strain can be used to quantitatively assess different NADPH-regenerating enzymes and provide essential information on expression levels and concentrations of reduced substrates required to support optimal NADPH production rate. The NADPH-auxotroph strain thus serves as an effective metabolic platform for evaluating NADPH regeneration within the cellular context

Continuous Culture Adaptation of Methylobacterium extorquens AM1 and TK 0001 to Very High Methanol Concentrations

International audienceThe bio-economy relies on microbial strains optimized for efficient large scale production of chemicals and fuels from inexpensive and renewable feedstocks under industrial conditions. The reduced one carbon compound methanol, whose production does not involve carbohydrates needed for the feed and food sector, can be used as sole carbon and energy source by methylotrophic bacteria like Methylobacterium extorquens AM1. This strain has already been engineered to produce various commodity and high value chemicals from methanol. The toxic effect of methanol limits its concentration as feedstock to 1% v/v. We obtained M. extorquens chassis strains tolerant to high methanol via adaptive directed evolution using the GM3 technology of automated continuous culture. Turbidostat and conditional medium swap regimes were employed for the parallel evolution of the recently characterized strain TK 0001 and the reference strain AM1 and enabled the isolation of derivatives of both strains capable of stable growth with 10% methanol. The isolates produced more biomass at 1% methanol than the ancestor strains. Genome sequencing identified the gene metY coding for an O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase as common target of mutation. We showed that the wildtype enzyme uses methanol as substrate at elevated concentrations. This side reaction produces methoxine, a toxic homolog of methionine incorporated in polypeptides during translation. All mutated metY alleles isolated from the evolved populations coded for inactive enzymes, designating O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase as a major vector of methanol toxicity. A whole cell transcriptomic analysis revealed that genes coding for chaperones and proteases were upregulated in the evolved cells as compared with the wildtype, suggesting that the cells had to cope with aberrant proteins formed during the adaptation to increasing methanol exposure. In addition, the expression of ribosomal proteins and enzymes related to energy production from methanol like formate dehydrogenases and ATP synthases was boosted in the evolved cells upon a short-term methanol stress. D-lactate production Frontiers in Microbiology | www.frontiersin.org

Toehold switch based biosensors for sensing the highly trafficked rosewood Dalbergia maritima

International audienceNucleic acid sensing is a 3 decades old but still challenging area of application for different biological subdomains, from pathogen detection to single cell transcriptomics analysis. The many applications of nucleic acid detection and identification are mostly carried out by PCR techniques, sequencing, and their derivatives used at large scale. However, these methods' limitations on speed, cost, complexity and specificity have motivated the development of innovative detection methods among which nucleic acid biosensing technologies seem promising. Toehold switches are a particular class of RNA sensing devices relying on a conformational switch of secondary structure induced by the pairing of the detected trigger RNA with a de novo designed synthetic sensing mRNA molecule. Here we describe a streamlined methodology enabling the development of such a sensor for the RNA-mediated detection of an endangered plant species in a cell-free reaction system. We applied this methodology to help identify the rosewood Dalbergia maritima, a highly trafficked wood, whose protection is limited by the capacity of the authorities to distinguish protected logs from other unprotected but related species. The streamlined pipeline presented in this work is a versatile framework enabling cheap and rapid development of new sensors for custom RNA detection

Reproducibility of fluorescent expression from engineered biological constructs in E. coli

We present results of the first large-scale interlaboratory study carried out in synthetic biology, as part of the 2014 and 2015 International Genetically Engineered Machine (iGEM) competitions. Participants at 88 institutions around the world measured fluorescence from three engineered constitutive constructs in E. coli. Few participants were able to measure absolute fluorescence, so data was analyzed in terms of ratios. Precision was strongly related to fluorescent strength, ranging from 1.54-fold standard deviation for the ratio between strong promoters to 5.75-fold for the ratio between the strongest and weakest promoter, and while host strain did not affect expression ratios, choice of instrument did. This result shows that high quantitative precision and reproducibility of results is possible, while at the same time indicating areas needing improved laboratory practices.Peer reviewe