Differential microRNA expression profile between stimulated PBMCs from HIV-1 infected elite controllers and viremic progressors

BACKGROUND: The emerging relationship between microRNAs (miRNA) and viral-control is a topic of interest in the field of HIV. Host-genome might play an important role in the control of viremia. The aim of this study was to assess the specific miRNA profile that could contribute to the control of HIV replication in Elite Controllers. RESULTS: After adequate normalization, expression profile of 286 human miRNAs (hsa-miR) was evaluated in phytohaemagglutinin-stimulated PBMCs from 29 individuals classified in 4 groups: 8 elite controllers (EC; viral load 5000 cp/ml without treatment), 8 patients under antiretroviral treatment (ART; VL<200 cp/ml) and 5 uninfected individuals (HIV-) through TaqMan Array Human microRNA Cards v3.0. A differential expression pattern consisting of 23 miRNAs became significantly different when comparing EC and VP. Profiling analysis segregated the population in two different blocks: while EC and HIV- clustered together in the same block (EC/HIV-_block 1), VP and ART individuals clustered together in a second block (VP/ART_block 2). Two inversely expressed miRNA patterns were determined within those two blocks: a set of 4 miRNAs (hsa-miR-221, -27a, -27b and -29b) was up-expressed in EC/HIV-_block and down-expressed in VP/ART_block while 19 miRNAs were down-expressed in block 1 and up-expressed in block 2. Differential miRNAs were successfully validated through individual RT-qPCR assays. CONCLUSIONS: Profile in EC resembled HIV- and differentially clusters with VP and ART. Therefore, differential clustering does not rely on undetectable viremia

Use of RT-defective HIV virions: new tool to evaluate specific response in chronic asymptomatic HIV-infected individuals

Background Generation of new reagents that can be used to screen or monitor HIV-1-specific responses constituted an interesting field in the development of HIV vaccines to improve their efficacy. Methods We have evaluated the specific T cell response against different types of NL4-3 virions (including NL4-3 aldrithiol-2 treated, NL4-3/ΔRT and R5 envelopes: NL4-3/ΔRT/ΔEnv[AC10] and NL4-3/ΔRT/ΔEnv[Bal]) and against pools of overlapping peptides (15 mer) encompassing the HIV-1 Gag and Nef regions. Cryopreserved PBMC from a subset of 69 chronic asymptomatic HIV positive individuals have been employed using different techniques including IFN-γ ELISPOT assay, surface activation markers and intracellular cytokine staining (ICS) by flow cytometry. Results The differential response obtained against NL4-3 aldrithiol-2 treated and NL4-3/ΔRT virions (25% vs 55%, respectively) allow us to divide the population in three groups: "full-responders" (positive response against both viral particles), "partial-responders" (positive response only against NL4-3/ΔRT virions) and "non-responders" (negative responses). There was no difference between X4 and R5 envelopes. The magnitude of the total responses was higher against NL4-3/ΔRT and was positively correlated with gender and inverse correlated with viral load. On the contrary CD4+ T cell count was not associated with this response. In any case responses to the viruses tended to be lower in magnitude than those detected by the overlapping peptides tested. Finally we have found an increased frequency of HLA-B27 allele (23% vs 9%) and a significant reduction in some activation markers (CD69 and CD38) on T cells surface in responders vs non-responders individuals. Conclusions In summary these virions could be considered as alternative and useful reagents for screening HIV-1-specific T cell responses in HIV exposed uninfected people, HIV infected patients and to assess immunogenicity of new prototypes both in vitro and in vaccine trials, by a feasible, simply, effective and low cost assay

Nanopartículas y Células Dendríticas: Estudio de nuevas estrategias en inmunoterapia frente al VIH

[spa] De entre las vacunas de ácidos nucleicos, las basadas en ARNm autoreplicativos (replicones) o ARNm convencionales unidos a diferentes nanopartículas (NPs) como: oro (Au-NP), nanocápsulas (NCs), ácido poliláctico (PLA), PLA con corona lipídica (LP-PLA) y liposomas (LS), están siendo muy prometedoras por sus perfiles de seguridad e inmunogenicidad. El principal éxito de estas vacunas radica en la captación y administración de estos candidatos por parte de las células dendríticas (CDs) que son claves para la eficacia de la vacuna. El objetivo de esta tesis consistió en comparar y seleccionar la mejor formulación de ARNm a partir del modelo in-vitro de CDs humanas para evaluar la capacidad inmunogénica de DREP/RREP-gp140 y ARNm Gag/NPs (Au-NP, NCs, PLA, LP-PLA, LS). Utilizando el modelo in vitro de CD humana, hemos evaluado DNA-RNA launched alphavirus replicon vectors (DREP/RREP) que codifican para el HIV clade C gp140 y complejos de ARNm-NPs que codifican para el HIV clade B Gag. Mediante citometría de flujo evaluamos la viabilidad celular (7-AAD y Annexina-V) y los perfiles de maduración (CD83+ y HLA-DR) de las CDs de individuos sanos o infectados derivadas de monocitos, transfectadas por (electroporación, lipofección o pulsado). Por tinción de CFSE medimos la proliferación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ tras 6 días de cocultivo con células T autólogas. Por Luminex realizamos el análisis de 25 citocinas en los sobrenadantes de los cocultivos. Finalmente, por Elispot evaluamos la inducción de las células T secretoras de IFN-γ frente a Env o Gag. La evaluación de la viabilidad celular reveló una alta tasa de supervivencia (>60%) en las CDsmo. En los perfiles de maduración, se observó un aumento de la expresión de CD83 y HLA-DR (hasta un 40%) en CDsmo tanto en replicones como con ARNm-NPs. Dentro de esta subpoblación madura de CDs, se determinó la mayor expresión de gp140/Gag tras la transfección de DREPgp140 (10-20%) y LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA (15-20%), respectivamente. Los ensayos de CFSE mostraron, por un lado, que las CDsmo con RREP/DREPgp140 inducían ligeramente la capacidad proliferativa de los linfocitos T CD8+ (hasta un 10%) y en un 5% en los linfocitos T CD4+, y por otro, que los complejos de ARNm-NPs no estimulan la proliferación. Por el contrario, tras el cocultivo con CDsmo por DREP- gp140 o LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA, aumentaba la secreción de citocinas proinflamatorias (IFN-α e IL-6) y Th-1 (IFN-γ y MIP-1β). Por último, la adición de CDsmo con DREPgp140 o LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA incrementó la formación de spots equivalente a las células T secretoras de IFN-γ en los cocultivos tras la estimulación overnight con pooles de péptidos de Env o Gag, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que replicones y ARNm/NPs fueron capaces de activar a las CDs y de administrar eficazmente gp140 o Gag. De entre ellos, DREPgp140 y LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA parecen ser los candidatos más prometedores para ser utilizados en un contexto de vacuna preventiva y terapéutica, respectivamente, frente al VIH

Nanopartículas y Células Dendríticas: Estudio de nuevas estrategias en inmunoterapia frente al VIH

Programa de Doctorat en Biomedicina[spa] De entre las vacunas de ácidos nucleicos, las basadas en ARNm autoreplicativos (replicones) o ARNm convencionales unidos a diferentes nanopartículas (NPs) como: oro (Au-NP), nanocápsulas (NCs), ácido poliláctico (PLA), PLA con corona lipídica (LP-PLA) y liposomas (LS), están siendo muy prometedoras por sus perfiles de seguridad e inmunogenicidad. El principal éxito de estas vacunas radica en la captación y administración de estos candidatos por parte de las células dendríticas (CDs) que son claves para la eficacia de la vacuna. El objetivo de esta tesis consistió en comparar y seleccionar la mejor formulación de ARNm a partir del modelo in-vitro de CDs humanas para evaluar la capacidad inmunogénica de DREP/RREP-gp140 y ARNm Gag/NPs (Au-NP, NCs, PLA, LP-PLA, LS). Utilizando el modelo in vitro de CD humana, hemos evaluado DNA-RNA launched alphavirus replicon vectors (DREP/RREP) que codifican para el HIV clade C gp140 y complejos de ARNm-NPs que codifican para el HIV clade B Gag. Mediante citometría de flujo evaluamos la viabilidad celular (7-AAD y Annexina-V) y los perfiles de maduración (CD83+ y HLA-DR) de las CDs de individuos sanos o infectados derivadas de monocitos, transfectadas por (electroporación, lipofección o pulsado). Por tinción de CFSE medimos la proliferación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ tras 6 días de cocultivo con células T autólogas. Por Luminex realizamos el análisis de 25 citocinas en los sobrenadantes de los cocultivos. Finalmente, por Elispot evaluamos la inducción de las células T secretoras de IFN-γ frente a Env o Gag. La evaluación de la viabilidad celular reveló una alta tasa de supervivencia (>60%) en las CDsmo. En los perfiles de maduración, se observó un aumento de la expresión de CD83 y HLA-DR (hasta un 40%) en CDsmo tanto en replicones como con ARNm-NPs. Dentro de esta subpoblación madura de CDs, se determinó la mayor expresión de gp140/Gag tras la transfección de DREPgp140 (10-20%) y LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA (15-20%), respectivamente. Los ensayos de CFSE mostraron, por un lado, que las CDsmo con RREP/DREPgp140 inducían ligeramente la capacidad proliferativa de los linfocitos T CD8+ (hasta un 10%) y en un 5% en los linfocitos T CD4+, y por otro, que los complejos de ARNm-NPs no estimulan la proliferación. Por el contrario, tras el cocultivo con CDsmo por DREP- gp140 o LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA, aumentaba la secreción de citocinas proinflamatorias (IFN-α e IL-6) y Th-1 (IFN-γ y MIP-1β). Por último, la adición de CDsmo con DREPgp140 o LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA incrementó la formación de spots equivalente a las células T secretoras de IFN-γ en los cocultivos tras la estimulación overnight con pooles de péptidos de Env o Gag, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que replicones y ARNm/NPs fueron capaces de activar a las CDs y de administrar eficazmente gp140 o Gag. De entre ellos, DREPgp140 y LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA parecen ser los candidatos más prometedores para ser utilizados en un contexto de vacuna preventiva y terapéutica, respectivamente, frente al VIH

Differential MicroRNA Expression Profile between Stimulated PBMCs from HIV-1 Infected Elite Controllers and Viremic Progressors

<div><p>Background</p><p>The emerging relationship between microRNAs (miRNA) and viral-control is a topic of interest in the field of HIV. Host-genome might play an important role in the control of viremia. The aim of this study was to assess the specific miRNA profile that could contribute to the control of HIV replication in Elite Controllers</p><p>Results</p><p>After adequate normalization, expression profile of 286 human miRNAs (hsa-miR) was evaluated in phytohaemagglutinin-stimulated PBMCs from 29 individuals classified in 4 groups: 8 elite controllers (EC; viral load <50 cp/ml without treatment), 8 viremic progressors (VP; VL>5000 cp/ml without treatment), 8 patients under antiretroviral treatment (ART; VL<200 cp/ml) and 5 uninfected individuals (HIV-) through TaqMan Array Human microRNA Cards v3.0. A differential expression pattern consisting of 23 miRNAs became significantly different when comparing EC and VP. Profiling analysis segregated the population in two different blocks: while EC and HIV- clustered together in the same block (EC/HIV-_block 1), VP and ART individuals clustered together in a second block (VP/ART_block 2). Two inversely expressed miRNA patterns were determined within those two blocks: a set of 4 miRNAs (hsa-miR-221, -27a, -27b and -29b) was up-expressed in EC/HIV-_block and down-expressed in VP/ART_block while 19 miRNAs were down-expressed in block 1 and up-expressed in block 2. Differential miRNAs were successfully validated through individual RT-qPCR assays.</p><p>Conclusions</p><p>Profile in EC resembled HIV- and differentially clusters with VP and ART. Therefore, differential clustering does not rely on undetectable viremia.</p></div

Differential miRNAs between Elite Controllers (EC) and Viremic Progressors (VP).

<p>A) Hierarchical clustering of the differentially expressed miRNAs between EC and VP. Patients are ordered on vertical lines and candidate miRNAs on horizontal lines. For each miRNA, green represents under-expressed and red over-expressed values compared to the average value (median), in dark. Dendrograms (tree graph) between patients and between miRNAs are depicted, where the closest branches of the tree represent patients/miRNAs with the most similar expression pattern. Two blocks of patients (Block 1/Block 2) with an inverse expression profile were segregated. Two groups of miRNAs (Group 1/Group 2) with an inverse expression profile were segregated within each block. B) Fold change (log 2) of the 23 differentially expressed miRNAs in EC. Differential levels are normalized to all assesed miRNAs and relative to VP. Bars represent standard error means (SEM).</p

Fold change (log₂) of EC, VP and ART, normalized to endogenous control miRNAs and relative to HIV-.

<p>One-way analysis of variance (ANOVA) tests were performed for global comparisons and Turkey post-hoc tests for pair comparisons. Bars represent standard error means (SEM); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001 for Tuckey post-hoc tests; VP, viremic progressors; EC, elite controllers; ART, antiretroviral therapy.</p

Baseline characteristics of the study participants.

<p>VP, viremic progressors; EC, elite controller; ART, antiretroviral therapy; MSM, men who had sex with men; *; median [interquartile range  =  upper quartile (Q3) - lower quartile (Q1)]; N/A, not applicable.</p><p>Baseline characteristics of the study participants.</p