Nanopartículas y Células Dendríticas: Estudio de nuevas estrategias en inmunoterapia frente al VIH

Abstract

[spa] De entre las vacunas de ácidos nucleicos, las basadas en ARNm autoreplicativos (replicones) o ARNm convencionales unidos a diferentes nanopartículas (NPs) como: oro (Au-NP), nanocápsulas (NCs), ácido poliláctico (PLA), PLA con corona lipídica (LP-PLA) y liposomas (LS), están siendo muy prometedoras por sus perfiles de seguridad e inmunogenicidad. El principal éxito de estas vacunas radica en la captación y administración de estos candidatos por parte de las células dendríticas (CDs) que son claves para la eficacia de la vacuna. El objetivo de esta tesis consistió en comparar y seleccionar la mejor formulación de ARNm a partir del modelo in-vitro de CDs humanas para evaluar la capacidad inmunogénica de DREP/RREP-gp140 y ARNm Gag/NPs (Au-NP, NCs, PLA, LP-PLA, LS). Utilizando el modelo in vitro de CD humana, hemos evaluado DNA-RNA launched alphavirus replicon vectors (DREP/RREP) que codifican para el HIV clade C gp140 y complejos de ARNm-NPs que codifican para el HIV clade B Gag. Mediante citometría de flujo evaluamos la viabilidad celular (7-AAD y Annexina-V) y los perfiles de maduración (CD83+ y HLA-DR) de las CDs de individuos sanos o infectados derivadas de monocitos, transfectadas por (electroporación, lipofección o pulsado). Por tinción de CFSE medimos la proliferación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ tras 6 días de cocultivo con células T autólogas. Por Luminex realizamos el análisis de 25 citocinas en los sobrenadantes de los cocultivos. Finalmente, por Elispot evaluamos la inducción de las células T secretoras de IFN-γ frente a Env o Gag. La evaluación de la viabilidad celular reveló una alta tasa de supervivencia (>60%) en las CDsmo. En los perfiles de maduración, se observó un aumento de la expresión de CD83 y HLA-DR (hasta un 40%) en CDsmo tanto en replicones como con ARNm-NPs. Dentro de esta subpoblación madura de CDs, se determinó la mayor expresión de gp140/Gag tras la transfección de DREPgp140 (10-20%) y LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA (15-20%), respectivamente. Los ensayos de CFSE mostraron, por un lado, que las CDsmo con RREP/DREPgp140 inducían ligeramente la capacidad proliferativa de los linfocitos T CD8+ (hasta un 10%) y en un 5% en los linfocitos T CD4+, y por otro, que los complejos de ARNm-NPs no estimulan la proliferación. Por el contrario, tras el cocultivo con CDsmo por DREP- gp140 o LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA, aumentaba la secreción de citocinas proinflamatorias (IFN-α e IL-6) y Th-1 (IFN-γ y MIP-1β). Por último, la adición de CDsmo con DREPgp140 o LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA incrementó la formación de spots equivalente a las células T secretoras de IFN-γ en los cocultivos tras la estimulación overnight con pooles de péptidos de Env o Gag, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que replicones y ARNm/NPs fueron capaces de activar a las CDs y de administrar eficazmente gp140 o Gag. De entre ellos, DREPgp140 y LAH4-L1/ARNmGag/LP-PLA parecen ser los candidatos más prometedores para ser utilizados en un contexto de vacuna preventiva y terapéutica, respectivamente, frente al VIH