Functional characterisation of the mesenchymal cell-derived extracellular matrix in myelodysplastic neoplasms

Myelodysplastic neoplasms (MDS) are a group of heterogeneous, clonal disorders characterised by ineffective haematopoiesis and peripheral blood cytopenia. MDS is highly progressive, difficult to treat, and is one of the most common blood cancers, affecting 4-5/100.000 people below the age of 70 and many more thereafter. Single or multiple driver gene mutations and chromosomal abnormalities in the haematopoietic compartment lead to MDS. These somatic gene mutations account for the dysregulation of epigenetic, DNA repair, cohesion complex, and spliceosome pathways. The International prognostic scoring system (IPSS) that was developed in 1997, revised (IPSS-R) in 2016 and updated in 2022 (IPSS-M) classifies MDS into low risk (LR-), intermediate (Int-), and high risk (HR-) groups. The haematopoietic disorder is accompanied by changes in the bone marrow microenvironment (BMME) and especially in mesenchymal cells (MSCs). BMME provides a supportive milieu for haematopoiesis and can be targeted by clinically available drugs such as AZA. The non cellular component of the BMME, the extracellular matrix (ECM), is a framework providing structural and biochemical support via cell-ECM interactions and the maintenance of growth factor gradients. To date, studies of bone marrow interactions in homeostasis and disease have focused largely on soluble and membrane-associated factors, while the involvement of the ECM in MDS and its response to therapy is underexplored. Therefore, this study aimed to characterise the MDS MSC derived ECM of both LR- and HR-MDS in comparison to that from healthy age matched donors in terms of composition, biophysical properties and functional haematopoietic support. This study also aimed to evaluate the impact of in vivo and in vitro AZA treatment on MDS MSC derived ECM. To investigate this, in vitro ECMs were generated by culturing of MSC monolayers on chemically prepared coverslips followed by decellularization using NH4OH and DNase-1 solution. The biophysical properties of the ECM were analysed using atomic force microscopy (AFM). Using targeted approaches, a selection of biochemical ECM components including glycoprotein (fibronectin), collagens and glycosaminoglycans (GAGs) were analysed in the various ECMs generated from the different MSC samples. AFM analysis revealed that MDS MSCs producer a softer ECM than the healthy donor MSCs, and that this difference becomes more prominent as the disorder progresses from LR-to HR- MDS. An increase in overall collagen content and a specific increase in collagens I and IV was observed in the ECM deposited by both LR- and HR-MDS MSCs when compared to healthy donor MSCs. Lectin staining revealed disease stage-specific differences in GAG composition: The levels of GAGs carrying N acetyl glucosamine and those carrying N-acetyl galactosamine sugars were both increased in ECM from LR-MDS, while ECM from HR-MDS retained high levels of N acetyl glucosamine but contained only low levels of N-acetyl galactosamine GAGs. The changes in N acetyl galactosamine and N acetyl glucosamine GAGs were further confirmed by chondroitin sulphate (CS) immunostaining, and hyaluronic acid (HA) ELISA respectively. Electrophoretic analysis revealed the presence of low molecular weight (LMW)-HA in one of the LR-MDS MSC derived ECM. Furthermore, the stimulation of MNCs with LMW-HA showed an increase in gene expression of pro-inflammatory cytokines like IL6 suggesting the possible involvement of LMW-HA in the inflammatory bone marrow state of LR-MDS. ECM derived from both LR- and HR-MDS MSCs had a reduced ability to support HSPC, as revealed by a loss of both polar morphology and subsequent colony-forming potential. The decreased rigidity of the ECM produced by MSCs from MDS patients was reversed in MSCs isolated from the patients post-AZA therapy. Similarly, direct exposure of cultured MDS MSCs to AZA also resulted in a corresponding increase in the rigidity of the ECM, although this remained lower than that observed from MDS MSCs isolated post-AZA therapy. A reduction in the collagen content of the ECM was only observed when using MSC from AZA-treated patients, but not following in vitro AZA treatment of MSCs from untreated patients. This indicated that the AZA-mediated restoration of ECM rigidity is an indirect result of effects in the context of the BMME and not on the MSCs alone. Interestingly, a few ECMs derived from MDS patients after AZA therapy had an improved ability to maintain functional HSPCs, as assessed by subsequent colony formation assay. Moreover, a polarized morphology of HSPCs cultured on the ECM derived from both in vivo and in vitro AZA-treated MDS MSCs, suggests a partial restoration of the HSPC behaviour on the AZA-treated MDS ECM. In conclusion, this study has demonstrated changes in the structure, collagen content, and GAG composition of ECM derived from MSCs from MDS patients compared to healthy donors. This study is one of the first to demonstrate an impact of MDS-derived ECM on both the morphology and function of HSPCs, supporting the relevance of the bone marrow ECM in haematological malignancies. The partial revision of the MDS ECM phenotype following in vivo AZA treatment suggests that the ECM itself may be a potential therapeutic target. An improved, in-depth understanding of the contribution of ECM to disease processes is therefore likely to enable us to find novel therapeutic targets to improve drug response in MDS in the future.Myelodysplastische Neoplasien (MDS) sind eine Gruppe heterogener, klonaler Erkrankungen, die durch ineffektive Hämatopoese und Zytopenie des peripheren Blutes gekennzeichnet sind. MDS sind hochgradig progressiv, schwer zu behandeln und gehören zu den häufigsten Blutkrebserkrankungen, von denen 4-5/100.000 Menschen unter 70 Jahren betroffen sind. Die Inzidenz steigt mit zunehmendem Alter deutlich an. MDS wird durch einzelne oder mehrfache Mutationen von Treibergenen und Chromosomenanomalien im hämatopoetischen Kompartiment verursacht. Diese somatischen Genmutationen sind für die Dysregulation von epigenetischen, DNA-Reparatur-, Kohäsionskomplex- und Spleißosomen-Signalwegen verantwortlich. Das Internationale Prognosesystem (IPSS) wurde 1997 entwickelt, 2016 überarbeitet (IPSS-R) und 2022 aktualisiert (IPSS M), um MDS in Gruppen mit niedrigem Risiko (LR-), mittlerem (Int ) und hohem Risiko (HR-) einzuteilen. Die hämatopoetische Erkrankung geht mit Veränderungen in der Mikroumgebung des Knochenmarks (BMME) einher, insbesondere bei mesenchymalen Zellen (MSCs). Das BMME bietet ein unterstützendes Milieu für die Hämatopoese und kann durch klinisch verfügbare Medikamente wie AZA beeinflusst werden. Die nichtzelluläre Komponente der BMME, die extrazelluläre Matrix (ECM), ist ein Gerüst, das durch Zell-ECM-Interaktionen und die Aufrechterhaltung von Wachstumsfaktorgradienten strukturelle und biochemische Unterstützung bietet. Bislang haben sich Studien über die Interaktionen im Knochenmark bei Homöostase und Krankheit hauptsächlich auf lösliche und membranassoziierte Faktoren konzentriert, während die Beteiligung der ECM an MDS und ihre Reaktion auf die Therapie noch nicht ausreichend erforscht ist. Daher zielte diese Studie darauf ab, die aus MDS-MSCs abgeleitete ECM sowohl bei LR- als auch bei HR-MDS im Vergleich zu der von gesunden, altersgleichen Spendern zu charakterisieren, und zwar hinsichtlich der Zusammensetzung, der biophysikalischen Eigenschaften und der funktionellen hämatopoetischen Unterstützung. Ziel dieser Studie war es auch, die Auswirkungen einer in vivo und in vitro AZA-Therapie auf die aus MDS-MSCs stammende ECM zu untersuchen. Hierfür wurden in vitro ECMs durch Kultivierung von MSC-Monolayern auf chemisch-präparierten-Deckgläsern und anschließender Dezellularisierung mit NH4OH und DNase-1-Lösung erzeugt. Die biophysikalischen Eigenschaften der ECM wurden mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) analysiert. Mit gezielten Ansätzen wurde eine Auswahl biochemischer ECM-Komponenten, darunter Glykoproteine (Fibronektin), Kollagene und Glykosaminoglykane (GAGs), in den ECMs analysiert. Die AFM-Analyse ergab eine weichere ECM, die von MDS-MSCs im Vergleich zu gesunden Spender-MSCs gebildet wurde, was mit dem Fortschreiten der Erkrankung von LR- zu HR-MDS noch deutlicher wurde. Sowohl in LR-MDS- als auch in HR-MDS-ECMs wurde im Vergleich zu gesunden Spender-ECMs ein Anstieg des Gesamtkollagengehalts und eine spezifische Zunahme der Kollagene I und IV beobachtet. Darüber hinaus zeigte die Lektinfärbung krankheitsspezifische Unterschiede in der GAG-Zusammensetzung: Der Gehalt an N-Acetylglucosamin-tragenden GAGs und an N-Acetylgalactosamin-tragenden GAGs war in der ECM von LR-MDS erhöht, während die ECM von HR-MDS einen hohen Gehalt an N-Acetylglucosamin, aber nur einen geringen Gehalt an N-Acetylgalactosamin-GAGs aufwies. Die Veränderungen bei den N-Acetyl-Galactosamin- und N-Acetyl-Glucosamin-GAGs wurden durch Chondroitinsulfat (CS)-Immunfärbung bzw. Hyaluronsäure (HA) ELISA weiter bestätigt. Eine Elektrophoretische Analyse zeigte das Vorhandensein von niedermolekularem (LMW)-HA in einer der von LR-MDS-MSCs stammenden ECM. Darüber hinaus zeigte die Stimulierung von mononuklearen Zellen mit LMW-HA einen Anstieg der Genexpression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL6, was auf eine Rolle von LMW-HA im entzündlichen Zustand des Knochenmarks von LR-MDS hindeutet. Darüber hinaus wies die ECM von LR- und von HR-MDS, eine verminderte Fähigkeit, hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) zu unterstützen, auf. Dies zeigte sich in einem Verlust sowohl der polaren Morphologie von HSPCs als auch des anschließenden koloniebildenden Potenzials selbiger. Darüber hinaus wurde die verringerte Steifigkeit der ECM von MDS-MSCs, die nach der AZA-Therapie aus den Patienten isoliert wurden, umgekehrt. In ähnlicher Weise führte die direkte Exposition von kultivierten MDS-MSCs mit AZA zu einer entsprechenden Erhöhung der Steifigkeit der ECM. Diese war jedoch geringer als bei den nach der AZA-Therapie isolierten MDS-MSCs. Die Verringerung des Kollagengehalts der ECM wurde nur in der in vivo mit AZA behandelten MSC-ECM beobachtet, nicht aber in den in vitro mit AZA behandelten Proben. Dies deutet darauf hin, dass die AZA-vermittelte Wiederherstellung der ECM-Steifigkeit ein Ergebnis der indirekten Wirkung von AZA im Knochenmark ist und eventuell vom MDS-Klon ausgeht. Interessanterweise wurde bei einigen ECMs von MDS-Patienten nach der AZA-Therapie eine Verbesserung der Koloniebildung hierauf- kultivierter HSPCs beobachtet. Darüber hinaus deutet eine polarisierte Morphologie von HSPCs, die auf der ECM von in vivo und in vitro AZA-behandelten MDS-MSCs vorkultiviert wurden, auf eine teilweise Wiederherstellung des Verhaltens von HSPCs auf der AZA-behandelten MDS-ECM hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie Veränderungen in der Struktur, im Kollagengehalt und in der GAG-Zusammensetzung zwischen der ECM von MDS-MSCs und der ECM von gesunden MSCs nachgewiesen hat. Dies ist auch eine der ersten Studien, die einen Einfluss der aus MDS-MSCs stammenden ECM auf die Morphologie und Funktion von HSPCs zeigt. Dies weist auf die Rolle der ECM bei der Entstehung hämatologischer Malignome hin. Darüber hinaus deutet die teilweise Korrektur des MDS-ECM-Phänotyps nach einer in vivo AZA-Behandlung darauf hin, dass die ECM selbst ein potenzielles therapeutisches Ziel sein könnte. Ein besseres und tieferes Verständnis des Beitrags der ECM zu MDS-Krankheitsprozessen wird es uns daher ermöglichen, neue therapeutische Ziele zu finden, um das Ansprechen auf Medikamente verbessern zu könne

Bone marrow mesenchymal stromal cell-derived extracellular matrix displays altered glycosaminoglycan structure and impaired functionality in Myelodysplastic Syndromes

Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies characterized by clonal hematopoiesis, one or more cytopenias such as anemia, neutropenia, or thrombocytopenia, abnormal cellular maturation, and a high risk of progression to acute myeloid leukemia. The bone marrow microenvironment (BMME) in general and mesenchymal stromal cells (MSCs) in particular contribute to both the initiation and progression of MDS. However, little is known about the role of MSC-derived extracellular matrix (ECM) in this context. Therefore, we performed a comparative analysis of in vitro deposited MSC-derived ECM of different MDS subtypes and healthy controls. Atomic force microscopy analyses demonstrated that MDS ECM was significantly thicker and more compliant than those from healthy MSCs. Scanning electron microscopy showed a dense meshwork of fibrillar bundles connected by numerous smaller structures that span the distance between fibers in MDS ECM. Glycosaminoglycan (GAG) structures were detectable at high abundance in MDS ECM as white, sponge-like arrays on top of the fibrillar network. Quantification by Blyscan assay confirmed these observations, with higher concentrations of sulfated GAGs in MDS ECM. Fluorescent lectin staining with wheat germ agglutinin and peanut agglutinin demonstrated increased deposition of N-acetyl-glucosamine GAGs (hyaluronan (HA) and heparan sulfate) in low risk (LR) MDS ECM. Differential expression of N-acetyl-galactosamine GAGs (chondroitin sulfate, dermatan sulfate) was observed between LR- and high risk (HR)-MDS. Moreover, increased amounts of HA in the matrix of MSCs from LR-MDS patients were found to correlate with enhanced HA synthase 1 mRNA expression in these cells. Stimulation of mononuclear cells from healthy donors with low molecular weight HA resulted in an increased expression of various pro-inflammatory cytokines suggesting a contribution of the ECM to the inflammatory BMME typical of LR-MDS. CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) displayed an impaired differentiation potential after cultivation on MDS ECM and modified morphology accompanied by decreased integrin expression which mediate cell-matrix interaction. In summary, we provide evidence for structural alterations of the MSC-derived ECM in both LR- and HR-MDS. GAGs may play an important role in this remodeling processes during the malignant transformation which leads to the observed disturbance in the support of normal hematopoiesis

Functional characterisation of the mesenchymal cell-derived extracellular matrix in myelodysplastic neoplasms

Myelodysplastic neoplasms (MDS) are a group of heterogeneous, clonal disorders characterised by ineffective haematopoiesis and peripheral blood cytopenia. MDS is highly progressive, difficult to treat, and is one of the most common blood cancers, affecting 4-5/100.000 people below the age of 70 and many more thereafter. Single or multiple driver gene mutations and chromosomal abnormalities in the haematopoietic compartment lead to MDS. These somatic gene mutations account for the dysregulation of epigenetic, DNA repair, cohesion complex, and spliceosome pathways. The International prognostic scoring system (IPSS) that was developed in 1997, revised (IPSS-R) in 2016 and updated in 2022 (IPSS-M) classifies MDS into low risk (LR-), intermediate (Int-), and high risk (HR-) groups. The haematopoietic disorder is accompanied by changes in the bone marrow microenvironment (BMME) and especially in mesenchymal cells (MSCs). BMME provides a supportive milieu for haematopoiesis and can be targeted by clinically available drugs such as AZA. The non cellular component of the BMME, the extracellular matrix (ECM), is a framework providing structural and biochemical support via cell-ECM interactions and the maintenance of growth factor gradients. To date, studies of bone marrow interactions in homeostasis and disease have focused largely on soluble and membrane-associated factors, while the involvement of the ECM in MDS and its response to therapy is underexplored. Therefore, this study aimed to characterise the MDS MSC derived ECM of both LR- and HR-MDS in comparison to that from healthy age matched donors in terms of composition, biophysical properties and functional haematopoietic support. This study also aimed to evaluate the impact of in vivo and in vitro AZA treatment on MDS MSC derived ECM. To investigate this, in vitro ECMs were generated by culturing of MSC monolayers on chemically prepared coverslips followed by decellularization using NH4OH and DNase-1 solution. The biophysical properties of the ECM were analysed using atomic force microscopy (AFM). Using targeted approaches, a selection of biochemical ECM components including glycoprotein (fibronectin), collagens and glycosaminoglycans (GAGs) were analysed in the various ECMs generated from the different MSC samples. AFM analysis revealed that MDS MSCs producer a softer ECM than the healthy donor MSCs, and that this difference becomes more prominent as the disorder progresses from LR-to HR- MDS. An increase in overall collagen content and a specific increase in collagens I and IV was observed in the ECM deposited by both LR- and HR-MDS MSCs when compared to healthy donor MSCs. Lectin staining revealed disease stage-specific differences in GAG composition: The levels of GAGs carrying N acetyl glucosamine and those carrying N-acetyl galactosamine sugars were both increased in ECM from LR-MDS, while ECM from HR-MDS retained high levels of N acetyl glucosamine but contained only low levels of N-acetyl galactosamine GAGs. The changes in N acetyl galactosamine and N acetyl glucosamine GAGs were further confirmed by chondroitin sulphate (CS) immunostaining, and hyaluronic acid (HA) ELISA respectively. Electrophoretic analysis revealed the presence of low molecular weight (LMW)-HA in one of the LR-MDS MSC derived ECM. Furthermore, the stimulation of MNCs with LMW-HA showed an increase in gene expression of pro-inflammatory cytokines like IL6 suggesting the possible involvement of LMW-HA in the inflammatory bone marrow state of LR-MDS. ECM derived from both LR- and HR-MDS MSCs had a reduced ability to support HSPC, as revealed by a loss of both polar morphology and subsequent colony-forming potential. The decreased rigidity of the ECM produced by MSCs from MDS patients was reversed in MSCs isolated from the patients post-AZA therapy. Similarly, direct exposure of cultured MDS MSCs to AZA also resulted in a corresponding increase in the rigidity of the ECM, although this remained lower than that observed from MDS MSCs isolated post-AZA therapy. A reduction in the collagen content of the ECM was only observed when using MSC from AZA-treated patients, but not following in vitro AZA treatment of MSCs from untreated patients. This indicated that the AZA-mediated restoration of ECM rigidity is an indirect result of effects in the context of the BMME and not on the MSCs alone. Interestingly, a few ECMs derived from MDS patients after AZA therapy had an improved ability to maintain functional HSPCs, as assessed by subsequent colony formation assay. Moreover, a polarized morphology of HSPCs cultured on the ECM derived from both in vivo and in vitro AZA-treated MDS MSCs, suggests a partial restoration of the HSPC behaviour on the AZA-treated MDS ECM. In conclusion, this study has demonstrated changes in the structure, collagen content, and GAG composition of ECM derived from MSCs from MDS patients compared to healthy donors. This study is one of the first to demonstrate an impact of MDS-derived ECM on both the morphology and function of HSPCs, supporting the relevance of the bone marrow ECM in haematological malignancies. The partial revision of the MDS ECM phenotype following in vivo AZA treatment suggests that the ECM itself may be a potential therapeutic target. An improved, in-depth understanding of the contribution of ECM to disease processes is therefore likely to enable us to find novel therapeutic targets to improve drug response in MDS in the future.Myelodysplastische Neoplasien (MDS) sind eine Gruppe heterogener, klonaler Erkrankungen, die durch ineffektive Hämatopoese und Zytopenie des peripheren Blutes gekennzeichnet sind. MDS sind hochgradig progressiv, schwer zu behandeln und gehören zu den häufigsten Blutkrebserkrankungen, von denen 4-5/100.000 Menschen unter 70 Jahren betroffen sind. Die Inzidenz steigt mit zunehmendem Alter deutlich an. MDS wird durch einzelne oder mehrfache Mutationen von Treibergenen und Chromosomenanomalien im hämatopoetischen Kompartiment verursacht. Diese somatischen Genmutationen sind für die Dysregulation von epigenetischen, DNA-Reparatur-, Kohäsionskomplex- und Spleißosomen-Signalwegen verantwortlich. Das Internationale Prognosesystem (IPSS) wurde 1997 entwickelt, 2016 überarbeitet (IPSS-R) und 2022 aktualisiert (IPSS M), um MDS in Gruppen mit niedrigem Risiko (LR-), mittlerem (Int ) und hohem Risiko (HR-) einzuteilen. Die hämatopoetische Erkrankung geht mit Veränderungen in der Mikroumgebung des Knochenmarks (BMME) einher, insbesondere bei mesenchymalen Zellen (MSCs). Das BMME bietet ein unterstützendes Milieu für die Hämatopoese und kann durch klinisch verfügbare Medikamente wie AZA beeinflusst werden. Die nichtzelluläre Komponente der BMME, die extrazelluläre Matrix (ECM), ist ein Gerüst, das durch Zell-ECM-Interaktionen und die Aufrechterhaltung von Wachstumsfaktorgradienten strukturelle und biochemische Unterstützung bietet. Bislang haben sich Studien über die Interaktionen im Knochenmark bei Homöostase und Krankheit hauptsächlich auf lösliche und membranassoziierte Faktoren konzentriert, während die Beteiligung der ECM an MDS und ihre Reaktion auf die Therapie noch nicht ausreichend erforscht ist. Daher zielte diese Studie darauf ab, die aus MDS-MSCs abgeleitete ECM sowohl bei LR- als auch bei HR-MDS im Vergleich zu der von gesunden, altersgleichen Spendern zu charakterisieren, und zwar hinsichtlich der Zusammensetzung, der biophysikalischen Eigenschaften und der funktionellen hämatopoetischen Unterstützung. Ziel dieser Studie war es auch, die Auswirkungen einer in vivo und in vitro AZA-Therapie auf die aus MDS-MSCs stammende ECM zu untersuchen. Hierfür wurden in vitro ECMs durch Kultivierung von MSC-Monolayern auf chemisch-präparierten-Deckgläsern und anschließender Dezellularisierung mit NH4OH und DNase-1-Lösung erzeugt. Die biophysikalischen Eigenschaften der ECM wurden mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) analysiert. Mit gezielten Ansätzen wurde eine Auswahl biochemischer ECM-Komponenten, darunter Glykoproteine (Fibronektin), Kollagene und Glykosaminoglykane (GAGs), in den ECMs analysiert. Die AFM-Analyse ergab eine weichere ECM, die von MDS-MSCs im Vergleich zu gesunden Spender-MSCs gebildet wurde, was mit dem Fortschreiten der Erkrankung von LR- zu HR-MDS noch deutlicher wurde. Sowohl in LR-MDS- als auch in HR-MDS-ECMs wurde im Vergleich zu gesunden Spender-ECMs ein Anstieg des Gesamtkollagengehalts und eine spezifische Zunahme der Kollagene I und IV beobachtet. Darüber hinaus zeigte die Lektinfärbung krankheitsspezifische Unterschiede in der GAG-Zusammensetzung: Der Gehalt an N-Acetylglucosamin-tragenden GAGs und an N-Acetylgalactosamin-tragenden GAGs war in der ECM von LR-MDS erhöht, während die ECM von HR-MDS einen hohen Gehalt an N-Acetylglucosamin, aber nur einen geringen Gehalt an N-Acetylgalactosamin-GAGs aufwies. Die Veränderungen bei den N-Acetyl-Galactosamin- und N-Acetyl-Glucosamin-GAGs wurden durch Chondroitinsulfat (CS)-Immunfärbung bzw. Hyaluronsäure (HA) ELISA weiter bestätigt. Eine Elektrophoretische Analyse zeigte das Vorhandensein von niedermolekularem (LMW)-HA in einer der von LR-MDS-MSCs stammenden ECM. Darüber hinaus zeigte die Stimulierung von mononuklearen Zellen mit LMW-HA einen Anstieg der Genexpression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL6, was auf eine Rolle von LMW-HA im entzündlichen Zustand des Knochenmarks von LR-MDS hindeutet. Darüber hinaus wies die ECM von LR- und von HR-MDS, eine verminderte Fähigkeit, hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) zu unterstützen, auf. Dies zeigte sich in einem Verlust sowohl der polaren Morphologie von HSPCs als auch des anschließenden koloniebildenden Potenzials selbiger. Darüber hinaus wurde die verringerte Steifigkeit der ECM von MDS-MSCs, die nach der AZA-Therapie aus den Patienten isoliert wurden, umgekehrt. In ähnlicher Weise führte die direkte Exposition von kultivierten MDS-MSCs mit AZA zu einer entsprechenden Erhöhung der Steifigkeit der ECM. Diese war jedoch geringer als bei den nach der AZA-Therapie isolierten MDS-MSCs. Die Verringerung des Kollagengehalts der ECM wurde nur in der in vivo mit AZA behandelten MSC-ECM beobachtet, nicht aber in den in vitro mit AZA behandelten Proben. Dies deutet darauf hin, dass die AZA-vermittelte Wiederherstellung der ECM-Steifigkeit ein Ergebnis der indirekten Wirkung von AZA im Knochenmark ist und eventuell vom MDS-Klon ausgeht. Interessanterweise wurde bei einigen ECMs von MDS-Patienten nach der AZA-Therapie eine Verbesserung der Koloniebildung hierauf- kultivierter HSPCs beobachtet. Darüber hinaus deutet eine polarisierte Morphologie von HSPCs, die auf der ECM von in vivo und in vitro AZA-behandelten MDS-MSCs vorkultiviert wurden, auf eine teilweise Wiederherstellung des Verhaltens von HSPCs auf der AZA-behandelten MDS-ECM hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie Veränderungen in der Struktur, im Kollagengehalt und in der GAG-Zusammensetzung zwischen der ECM von MDS-MSCs und der ECM von gesunden MSCs nachgewiesen hat. Dies ist auch eine der ersten Studien, die einen Einfluss der aus MDS-MSCs stammenden ECM auf die Morphologie und Funktion von HSPCs zeigt. Dies weist auf die Rolle der ECM bei der Entstehung hämatologischer Malignome hin. Darüber hinaus deutet die teilweise Korrektur des MDS-ECM-Phänotyps nach einer in vivo AZA-Behandlung darauf hin, dass die ECM selbst ein potenzielles therapeutisches Ziel sein könnte. Ein besseres und tieferes Verständnis des Beitrags der ECM zu MDS-Krankheitsprozessen wird es uns daher ermöglichen, neue therapeutische Ziele zu finden, um das Ansprechen auf Medikamente verbessern zu könne

Functional characterisation of the mesenchymal cell-derived extracellular matrix in myelodysplastic neoplasms

Myelodysplastic neoplasms (MDS) are a group of heterogeneous, clonal disorders characterised by ineffective haematopoiesis and peripheral blood cytopenia. MDS is highly progressive, difficult to treat, and is one of the most common blood cancers, affecting 4-5/100.000 people below the age of 70 and many more thereafter. Single or multiple driver gene mutations and chromosomal abnormalities in the haematopoietic compartment lead to MDS. These somatic gene mutations account for the dysregulation of epigenetic, DNA repair, cohesion complex, and spliceosome pathways. The International prognostic scoring system (IPSS) that was developed in 1997, revised (IPSS-R) in 2016 and updated in 2022 (IPSS-M) classifies MDS into low risk (LR-), intermediate (Int-), and high risk (HR-) groups. The haematopoietic disorder is accompanied by changes in the bone marrow microenvironment (BMME) and especially in mesenchymal cells (MSCs). BMME provides a supportive milieu for haematopoiesis and can be targeted by clinically available drugs such as AZA. The non cellular component of the BMME, the extracellular matrix (ECM), is a framework providing structural and biochemical support via cell-ECM interactions and the maintenance of growth factor gradients. To date, studies of bone marrow interactions in homeostasis and disease have focused largely on soluble and membrane-associated factors, while the involvement of the ECM in MDS and its response to therapy is underexplored. Therefore, this study aimed to characterise the MDS MSC derived ECM of both LR- and HR-MDS in comparison to that from healthy age matched donors in terms of composition, biophysical properties and functional haematopoietic support. This study also aimed to evaluate the impact of in vivo and in vitro AZA treatment on MDS MSC derived ECM. To investigate this, in vitro ECMs were generated by culturing of MSC monolayers on chemically prepared coverslips followed by decellularization using NH4OH and DNase-1 solution. The biophysical properties of the ECM were analysed using atomic force microscopy (AFM). Using targeted approaches, a selection of biochemical ECM components including glycoprotein (fibronectin), collagens and glycosaminoglycans (GAGs) were analysed in the various ECMs generated from the different MSC samples. AFM analysis revealed that MDS MSCs producer a softer ECM than the healthy donor MSCs, and that this difference becomes more prominent as the disorder progresses from LR-to HR- MDS. An increase in overall collagen content and a specific increase in collagens I and IV was observed in the ECM deposited by both LR- and HR-MDS MSCs when compared to healthy donor MSCs. Lectin staining revealed disease stage-specific differences in GAG composition: The levels of GAGs carrying N acetyl glucosamine and those carrying N-acetyl galactosamine sugars were both increased in ECM from LR-MDS, while ECM from HR-MDS retained high levels of N acetyl glucosamine but contained only low levels of N-acetyl galactosamine GAGs. The changes in N acetyl galactosamine and N acetyl glucosamine GAGs were further confirmed by chondroitin sulphate (CS) immunostaining, and hyaluronic acid (HA) ELISA respectively. Electrophoretic analysis revealed the presence of low molecular weight (LMW)-HA in one of the LR-MDS MSC derived ECM. Furthermore, the stimulation of MNCs with LMW-HA showed an increase in gene expression of pro-inflammatory cytokines like IL6 suggesting the possible involvement of LMW-HA in the inflammatory bone marrow state of LR-MDS. ECM derived from both LR- and HR-MDS MSCs had a reduced ability to support HSPC, as revealed by a loss of both polar morphology and subsequent colony-forming potential. The decreased rigidity of the ECM produced by MSCs from MDS patients was reversed in MSCs isolated from the patients post-AZA therapy. Similarly, direct exposure of cultured MDS MSCs to AZA also resulted in a corresponding increase in the rigidity of the ECM, although this remained lower than that observed from MDS MSCs isolated post-AZA therapy. A reduction in the collagen content of the ECM was only observed when using MSC from AZA-treated patients, but not following in vitro AZA treatment of MSCs from untreated patients. This indicated that the AZA-mediated restoration of ECM rigidity is an indirect result of effects in the context of the BMME and not on the MSCs alone. Interestingly, a few ECMs derived from MDS patients after AZA therapy had an improved ability to maintain functional HSPCs, as assessed by subsequent colony formation assay. Moreover, a polarized morphology of HSPCs cultured on the ECM derived from both in vivo and in vitro AZA-treated MDS MSCs, suggests a partial restoration of the HSPC behaviour on the AZA-treated MDS ECM. In conclusion, this study has demonstrated changes in the structure, collagen content, and GAG composition of ECM derived from MSCs from MDS patients compared to healthy donors. This study is one of the first to demonstrate an impact of MDS-derived ECM on both the morphology and function of HSPCs, supporting the relevance of the bone marrow ECM in haematological malignancies. The partial revision of the MDS ECM phenotype following in vivo AZA treatment suggests that the ECM itself may be a potential therapeutic target. An improved, in-depth understanding of the contribution of ECM to disease processes is therefore likely to enable us to find novel therapeutic targets to improve drug response in MDS in the future.Myelodysplastische Neoplasien (MDS) sind eine Gruppe heterogener, klonaler Erkrankungen, die durch ineffektive Hämatopoese und Zytopenie des peripheren Blutes gekennzeichnet sind. MDS sind hochgradig progressiv, schwer zu behandeln und gehören zu den häufigsten Blutkrebserkrankungen, von denen 4-5/100.000 Menschen unter 70 Jahren betroffen sind. Die Inzidenz steigt mit zunehmendem Alter deutlich an. MDS wird durch einzelne oder mehrfache Mutationen von Treibergenen und Chromosomenanomalien im hämatopoetischen Kompartiment verursacht. Diese somatischen Genmutationen sind für die Dysregulation von epigenetischen, DNA-Reparatur-, Kohäsionskomplex- und Spleißosomen-Signalwegen verantwortlich. Das Internationale Prognosesystem (IPSS) wurde 1997 entwickelt, 2016 überarbeitet (IPSS-R) und 2022 aktualisiert (IPSS M), um MDS in Gruppen mit niedrigem Risiko (LR-), mittlerem (Int ) und hohem Risiko (HR-) einzuteilen. Die hämatopoetische Erkrankung geht mit Veränderungen in der Mikroumgebung des Knochenmarks (BMME) einher, insbesondere bei mesenchymalen Zellen (MSCs). Das BMME bietet ein unterstützendes Milieu für die Hämatopoese und kann durch klinisch verfügbare Medikamente wie AZA beeinflusst werden. Die nichtzelluläre Komponente der BMME, die extrazelluläre Matrix (ECM), ist ein Gerüst, das durch Zell-ECM-Interaktionen und die Aufrechterhaltung von Wachstumsfaktorgradienten strukturelle und biochemische Unterstützung bietet. Bislang haben sich Studien über die Interaktionen im Knochenmark bei Homöostase und Krankheit hauptsächlich auf lösliche und membranassoziierte Faktoren konzentriert, während die Beteiligung der ECM an MDS und ihre Reaktion auf die Therapie noch nicht ausreichend erforscht ist. Daher zielte diese Studie darauf ab, die aus MDS-MSCs abgeleitete ECM sowohl bei LR- als auch bei HR-MDS im Vergleich zu der von gesunden, altersgleichen Spendern zu charakterisieren, und zwar hinsichtlich der Zusammensetzung, der biophysikalischen Eigenschaften und der funktionellen hämatopoetischen Unterstützung. Ziel dieser Studie war es auch, die Auswirkungen einer in vivo und in vitro AZA-Therapie auf die aus MDS-MSCs stammende ECM zu untersuchen. Hierfür wurden in vitro ECMs durch Kultivierung von MSC-Monolayern auf chemisch-präparierten-Deckgläsern und anschließender Dezellularisierung mit NH4OH und DNase-1-Lösung erzeugt. Die biophysikalischen Eigenschaften der ECM wurden mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) analysiert. Mit gezielten Ansätzen wurde eine Auswahl biochemischer ECM-Komponenten, darunter Glykoproteine (Fibronektin), Kollagene und Glykosaminoglykane (GAGs), in den ECMs analysiert. Die AFM-Analyse ergab eine weichere ECM, die von MDS-MSCs im Vergleich zu gesunden Spender-MSCs gebildet wurde, was mit dem Fortschreiten der Erkrankung von LR- zu HR-MDS noch deutlicher wurde. Sowohl in LR-MDS- als auch in HR-MDS-ECMs wurde im Vergleich zu gesunden Spender-ECMs ein Anstieg des Gesamtkollagengehalts und eine spezifische Zunahme der Kollagene I und IV beobachtet. Darüber hinaus zeigte die Lektinfärbung krankheitsspezifische Unterschiede in der GAG-Zusammensetzung: Der Gehalt an N-Acetylglucosamin-tragenden GAGs und an N-Acetylgalactosamin-tragenden GAGs war in der ECM von LR-MDS erhöht, während die ECM von HR-MDS einen hohen Gehalt an N-Acetylglucosamin, aber nur einen geringen Gehalt an N-Acetylgalactosamin-GAGs aufwies. Die Veränderungen bei den N-Acetyl-Galactosamin- und N-Acetyl-Glucosamin-GAGs wurden durch Chondroitinsulfat (CS)-Immunfärbung bzw. Hyaluronsäure (HA) ELISA weiter bestätigt. Eine Elektrophoretische Analyse zeigte das Vorhandensein von niedermolekularem (LMW)-HA in einer der von LR-MDS-MSCs stammenden ECM. Darüber hinaus zeigte die Stimulierung von mononuklearen Zellen mit LMW-HA einen Anstieg der Genexpression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL6, was auf eine Rolle von LMW-HA im entzündlichen Zustand des Knochenmarks von LR-MDS hindeutet. Darüber hinaus wies die ECM von LR- und von HR-MDS, eine verminderte Fähigkeit, hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) zu unterstützen, auf. Dies zeigte sich in einem Verlust sowohl der polaren Morphologie von HSPCs als auch des anschließenden koloniebildenden Potenzials selbiger. Darüber hinaus wurde die verringerte Steifigkeit der ECM von MDS-MSCs, die nach der AZA-Therapie aus den Patienten isoliert wurden, umgekehrt. In ähnlicher Weise führte die direkte Exposition von kultivierten MDS-MSCs mit AZA zu einer entsprechenden Erhöhung der Steifigkeit der ECM. Diese war jedoch geringer als bei den nach der AZA-Therapie isolierten MDS-MSCs. Die Verringerung des Kollagengehalts der ECM wurde nur in der in vivo mit AZA behandelten MSC-ECM beobachtet, nicht aber in den in vitro mit AZA behandelten Proben. Dies deutet darauf hin, dass die AZA-vermittelte Wiederherstellung der ECM-Steifigkeit ein Ergebnis der indirekten Wirkung von AZA im Knochenmark ist und eventuell vom MDS-Klon ausgeht. Interessanterweise wurde bei einigen ECMs von MDS-Patienten nach der AZA-Therapie eine Verbesserung der Koloniebildung hierauf- kultivierter HSPCs beobachtet. Darüber hinaus deutet eine polarisierte Morphologie von HSPCs, die auf der ECM von in vivo und in vitro AZA-behandelten MDS-MSCs vorkultiviert wurden, auf eine teilweise Wiederherstellung des Verhaltens von HSPCs auf der AZA-behandelten MDS-ECM hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie Veränderungen in der Struktur, im Kollagengehalt und in der GAG-Zusammensetzung zwischen der ECM von MDS-MSCs und der ECM von gesunden MSCs nachgewiesen hat. Dies ist auch eine der ersten Studien, die einen Einfluss der aus MDS-MSCs stammenden ECM auf die Morphologie und Funktion von HSPCs zeigt. Dies weist auf die Rolle der ECM bei der Entstehung hämatologischer Malignome hin. Darüber hinaus deutet die teilweise Korrektur des MDS-ECM-Phänotyps nach einer in vivo AZA-Behandlung darauf hin, dass die ECM selbst ein potenzielles therapeutisches Ziel sein könnte. Ein besseres und tieferes Verständnis des Beitrags der ECM zu MDS-Krankheitsprozessen wird es uns daher ermöglichen, neue therapeutische Ziele zu finden, um das Ansprechen auf Medikamente verbessern zu könne