Création par évolution dirigée de protéines artificielles en alternatives aux anticorps

Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d une part le développementd une nouvelle famille de protéines artificielles et d autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L objectif général était de développer une approchegénérale permettant d obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d expression, insensibilité à l agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d un motif idéalisé à partir d une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées aRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l architecture aRep choisie : Les protéines s expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d une bibliothèque d aRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d exposition sur phages, de nouvelles aRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L ensemble des résultats montretrès clairement que des aRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les aRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées.The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named aRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration aRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news aReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between aRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Design, production and molecular structure of a new family of artificial Alpha-helicoïdal Repeat Proteins (αRep) as alternative to antibodies.

Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d’une part le développementd’une nouvelle famille de protéines artificielles et d’autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L’objectif général était de développer une approchegénérale permettant d’obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d’anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d’expression, insensibilité à l’agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d’une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d’un motif idéalisé à partir d’une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l’architecture αRep choisie : Les protéines s’expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l’amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d’une bibliothèque d’αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d’exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L’ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l’organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées.The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named αRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration αRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news αReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between αRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities

Création par évolution dirigée de protéines artificielles en alternatives aux anticorps

The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named αRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration αRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news αReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between αRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities.Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d’une part le développementd’une nouvelle famille de protéines artificielles et d’autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L’objectif général était de développer une approchegénérale permettant d’obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d’anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d’expression, insensibilité à l’agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d’une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d’un motif idéalisé à partir d’une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l’architecture αRep choisie : Les protéines s’expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l’amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d’une bibliothèque d’αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d’exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L’ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l’organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées

Selection of specific protein binders for pre-defined targets from an optimized library of artificial helicoidal repeat proteins (alphaRep).

We previously designed a new family of artificial proteins named αRep based on a subgroup of thermostable helicoidal HEAT-like repeats. We have now assembled a large optimized αRep library. In this library, the side chains at each variable position are not fully randomized but instead encoded by a distribution of codons based on the natural frequency of side chains of the natural repeats family. The library construction is based on a polymerization of micro-genes and therefore results in a distribution of proteins with a variable number of repeats. We improved the library construction process using a "filtration" procedure to retain only fully coding modules that were recombined to recreate sequence diversity. The final library named Lib2.1 contains 1.7×10(9) independent clones. Here, we used phage display to select, from the previously described library or from the new library, new specific αRep proteins binding to four different non-related predefined protein targets. Specific binders were selected in each case. The results show that binders with various sizes are selected including relatively long sequences, with up to 7 repeats. ITC-measured affinities vary with Kd values ranging from micromolar to nanomolar ranges. The formation of complexes is associated with a significant thermal stabilization of the bound target protein. The crystal structures of two complexes between αRep and their cognate targets were solved and show that the new interfaces are established by the variable surfaces of the repeated modules, as well by the variable N-cap residues. These results suggest that αRep library is a new and versatile source of tight and specific binding proteins with favorable biophysical properties

The αRep artificial repeat protein scaffold: a new tool for crystallization and live cell applications.

International audienceWe have designed a new family of artificial proteins, named αRep, based on HEAT (acronym for Huntingtin, elongation factor 3 (EF3), protein pphosphatase 2A (PP2A), yeast kinase Tor1) repeat proteins containing an α-helical repeated motif. The sequence of the repeated motifs, first identified in a thermostable archae protein was optimized using a consensus design strategy and used for the construction of a library of artificial proteins. All proteins from this library share the same general fold but differ both in the number of repeats and in five highly randomized amino acid positions within each repeat. The randomized side chains altogether provide a hypervariable surface on αRep variants. Sequences from this library are efficiently expressed as soluble, folded and very stable proteins. αRep binders with high affinity for various protein targets were selected by phage display. Low micromolar to nanomolar dissociation constants between partners were measured and the structures of several complexes (specific αRep/protein target) were solved by X-ray crystallography. Using GFP as a model target, it was demonstrated that αReps can be used as bait in pull-down experiments. αReps can be expressed in eukaryotic cells and specifically interact with their target addressed to different cell compartments

Biophysical characterization of the bGFP-A and GFP/bGFP-A complex.

<p>(A) ITC calorimetric titrations. Concentrations values are expressed in monomer concentrations. (▪): Tiration of GFP (35 μM) with bGFP-A (350 μM). (□): The bGFP-A binding specificity was tested by titration with NCS-wt (bGFP-A 30 μM, NCS-wt 350 μM). (B) The GFP-binding specificity was evaluated by ITC analysis of injection of bA3–1 (360 μM) in a solution of GFP (30 μM). (C) Size Exclusion Chromatography (Superdex 75 10/300) of the selected bGFP-A and GFP. (▾): SEC Elution profile of a mixture of GFP (2.25 nmol) and the binder bGFP-A (6.75 nmol). (∇): elution profile of the bGFP-A alone (2.25 nmol). (<b></b>): elution profile of the GFP alone (6.75 nmol). (D) Affinity determination of selected bGFP-A using SPR. Different concentrations of bGFP-A (71,3; 118; 142,6; 237,6; 713; 1426 nM) were applied to flow cell with immobilized biotinylated EGFP for 120 s followed by washing buffer flow. The sensorgrams were corrected for non-specific binding by subtraction of a channel without EGFP bound (grey curve). The fits of k_on and k_off rates are indicated by black dashed line. K_d values were computed using k_off  = 1.7×10⁻⁴ s⁻¹ for all concentrations and k_on  = 4.3, 4, 2.2, 2.6, 2, 2×10⁴M⁻¹ s⁻¹ for the increasing concentrations respectively.</p

Selection of binders from the αRep libraries.

a<p>The libraries indicated were used for the selections against the corresponding targets.</p>b<p>The phage-ELISA results are indicated as the number of clones giving a positive signal <i>versus</i> the number of clones tested. A Clone was scored as positive if its measured signal/noise <i>ratio</i> was greater than five.</p>c<p>The sequences were determined among the phage-ELISA positive clones. For each target, the number of distinct sequences is indicated over the total number of sequences determined.</p>d<p>The soluble expression of phage-ELISA positive clones was probed using CoFi blot or Western blot experiments after liquid expression cultures. Reported <i>ratios</i> indicate the number soluble proteins over the number of clones tested.</p>e<p>The properties of the clones used for further characterization were determined by ITC, DSC and/or SEC as described below. The number of internal repeats for each binder is indicated in parentheses.</p

Calorimetric data for competition binding experiments.

<p>ITC titration of a mixture of A3 (25 μM) pre-bound to bA3–17 (43 μM) with bA3–2 (350 μM). In these conditions, the apparent binding constant for bA3–2 decreases within the range required for ITC. Determination of the K_app is given by: K_app  = K_a^bA3–2/(1+ K_a^bA3–17 [bA3–17]). ΔH^bA3–17 and K_a^bA3–17 used in the data analysis had been determined in Fig. 2–B.</p