Perfil científico e tecnológico do diagnóstico, tratamento e proteção vacinal para leishmaniose visceral / Scientific and technological profile of diagnosis, treatment and vaccine protection for visceral leishmaniasis

As espécies Leishmania infantum e Leishmania donovani constituem tripanossomatídeos parasitários que provocam a leishmaniose visceral (LV), uma doença grave, de elevada incidência no Brasil, de difícil prevenção, diagnóstico e tratamento. Nesse sentido, a fim de avaliar o desenvolvimento tecnológico e científico da LV, foi realizado o levantamento informações sobre pesquisas e artigos científicos no banco de dados SCOPUS?e de registros de patentes nas bases de dados Espacenet, WIPO e INPI. Os resultados apresentam que o Brasil assume posição de destaque na pesquisa de diagnóstico da LV, sendo sede das principais instituições financiadoras e pesquisadoras do tema no mundo, com destaque para as instituições públicas. Ademais, constatou-se que ao longo das décadas ocorreu aumento no número de registros de patentes, com predomínio de depósitos relacionados ao tratamento da LV, seguindo por vacinas e diagnóstico.  A quantidade inferior de pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de vacinas e de testes diagnósticos de LV revela que a atenção tem sido mais voltada à cura da LV do que à prevenção dessa doença

Papel da proteína de superfície SAG2A de Toxoplasma gondii na regulação da resposta imune inata de hospedeiros murinos

Toxoplasma gondii is known to shut down pro-inflammatory responses triggered by Toll-like receptor agonists and, in this sense, has been widely used as a model for subversion of innate immunity. Here, we describe one of the possible mechanisms by which the parasite is able to down regulate nitric oxide and IL-12 production by activated macrophages and dendritic cells. We show that parasite-induced immunomodulation is independent of live invasion and replication, and presented distinct patterns depending on the type of strain used (type I or II). Strikingly, blockage of SAG2A surface protein by specific monoclonal antibody reverted the suppression of activated cells in a dose-dependent manner. Further analysis indicated that the innate immune modulation induced by the molecule depends on the presence of the intact Cterminal region of the protein. Additionally, in silico analysis revealed that the protein presents diverse phosphorylation sites of hosts intracellular kinases and cAMP, in addition to an orthologue of the human IL-6 binding site at the cytokine α−chain receptor, which is shown to actively bind the cytokine. Altogether, we demonstrate that SAG2A by T. gondii is able to modulate innate immune responses and contributes to parasite evasion of effectors mechanisms induced by the host.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisMestre em Imunologia e Parasitologia AplicadasToxoplasma gondii é conhecido por modular a resposta imune pró-inflamatória desencadeada por agonistas de receptores tipo Toll e, neste contexto, tem sido amplamente utilizado como modelo de subversão da imunidade inata. No presente trabalho, um dos possíveis mecanismos pelos quais o parasita é capaz de impedir a produção de óxido nítrico e IL - 12 por macrófagos ativados e células dendríticas ativados é relatado. Foi encontrado que a imunomodulação induzida pelo parasita é independente da invasão pelo parasito vivo e de sua replicação, apresentando padrões distintos dependendo do tipo de cepa utilizada (tipo I ou II). O bloqueio da proteína de superfície por SAG2A por monoclonal específico reverteu a supressão de células ativadas de forma dose dependente. Análises adicionais indicaram que a modulação imune inata induzida através da SAG2A depende da presença da região C-terminal da proteína. Além disso, a análise in silico revelou que a proteína apresenta diversos sítios de fosforilação intracelular de quinases e AMPc do hospedeiro e um sequência ortóloga da cadeia-α do receptor de IL-6 humano e murino, o qual mostrou-se capaz de ligar-se a essa citocina. Assim, a presença de SAG2A em T. gondii é capaz de modular as respostas imune inatas e contribui para mecanismos de evasão do parasita frente a resposta efetora induzida pelo hospedeiro

Caracterização de antígenos de Neospora caninum com potencial para produção de insumos em diagnóstico, profilaxia e proteção na neosporose

Neospora caninum, an obligate intracellular protozoan parasite, belongs to the phylum Apicomplexa and is ubiquitously distributed in the environment. This parasite has epidemiological and economical importance to cause disease in livestock, especially cattle, fostering considerable economic losses for the country. This thesis comprises two chapters involved the characterization study of antigens from N. caninum in different models of experimental infection. In the first chapter, the profile of cross-reactivity between N. caninum and Toxoplasma gondii was evaluated in an experimental infections in a mouse model. Our results indicated the presence of apical recognition of N. caninum as indicative of cross-reactivity by immunofluorescence. Animals infected with N. caninum showed high cross-reactivity for soluble antigens of T. gondii (STAg and STAg-TgESA) by ELISA. On the other hand, soluble antigens of N. caninum (NLA and NLA-NcESA) showed less heterologous recognition. The secreted-excreted antigens (NcESA) comprise the antigenic fraction with the highest potential to distinguish infection by the parasites, profile that is not observed in the same antigenic extract of T. gondii. We observed cross-reactivity to N. caninum in fractions of NLA with high molecular weight (80-110 kDa) and bands above 32 kDa and 64 kDa for NLA-NcESA and NcESA, respectively. Thus, antigenic fractions smaller than 32 kDa of the NLA and 60 kDa to NcESA are possible candidates for the diagnosis of neosporosis with a significant decrease of the possibility of cross-reactivity between the parasite in question. In Chapter II, we characterized the profile of antigen recognition of N. caninum in bovine experimental infection. The animals were seropositive after 15 days of infection and occurred prevalence of specific IgG2/IgG1 to NLA in begin of infection and after reinfection. However, a slight predominance of IgG1 over IgG2 anti-NcESA was observed in the late phase. IgM and IgA were found to be produced at different times of infection, which could not be associated with the acute phase of neosporosis. Avidez Index (AI) 70% were associated with early and late phases of infection, respectively. Bands of 29 and 36 kDa of NLA were immunodominant to IgG antibodies and its subclasses (IgG1 and IgG2). Distinct bands of this same fraction were recognized by IgG1 and IgG2 (59-60, 80 and 110 kDa) and IgA (32 kD) after reinfection. However, bands of 42 and 50 kDa in total antigens of N. caninum were immunodominant for IgG (Total, IgG1, IgG2) and IgM antibodies during infection, with the recognition of 15 and 24 kDa for IgG and 24 and 28 kDa for IgA as indicators for reinfection in bovine neosporosis. When NcESA was measured, we observed IgG(+) and IgM(-) toward antigens of 32 and 36 kDA with profile association with the chronic infection and 32 kDa recognized by IgG1 and 30 and 32 kDa by IgA as reinfection markers. Thus, the associations of different diagnostic techniques with different antigenic fractions may elucidate the profile of infection with N. caninum favoring specific distinction between the early stages, late and of reinfection in neosporosis.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisDoutor em Imunologia e Parasitologia AplicadasNeospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório, pertencente ao filo Apicomplexa e que pode ser encontrado ubiquamente no ambiente. Este parasito possui importância epidemiológica e econômica por causar doenças reprodutivas em rebanhos de ruminantes, principalmente em bovinos, acarretando consideráveis perdas econômicas para o país. A presente tese é composta por dois capítulos referentes ao estudo de caracterização de frações antigênicas provenientes de N. caninum em diferentes modelos de infecção experimental. No primeiro capítulo, o perfil da reação cruzada entre N. caninum e Toxoplasma gondii foi avaliado em modelo de infecção experimental murino. Nossos resultados indicaram a presença de marcação apical de N. caninum como indicativo de reatividade cruzada por reação de imunofluorescência. A reatividade cruzada foi intensa por ELISA para antígenos solúveis de T. gondii (STAg e STAg-TgESA) por soros de animais infectados com N. caninum. Já antígenos solúveis de N. caninum (NLA e NLA-NcESA) apresentaram menores índices de reconhecimento heterólogo. Os antígenos excretados-secretados de N. caninum (NcESA) compõe a fração antigênica com maior potencialidade de distinção de infecção pelos parasitos, perfil este não observado pelo mesmo extrato antigênico de T. gondii. Observamos reatividade cruzada para os antígenos de N. caninum com alto peso no NLA (80-110 kDa) e para com bandas acima de 32 kDa e 64 kDa do NLA-NcESA e NcESA, respectivamente. Dessa forma frações antigênicas menores que 32 kDa do NLA e abaixo de 60 de NcESA seriam possíveis candidatos para o diagnósticos da neosporose com significante diminuição da possibilidade de reatividade cruzada entre os parasitos em questão. No capítulo II, caracterizamos o perfil de reconhecimento antigênico de N. caninum em modelo de infecção experimental bovino. Os animais apresentaram sorologia reagente após 15 dias de infecção e predomínio de IgG2/IgG1 específico para NLA no Inicio da infecção ou após reinfecção. Entretanto, leve predomínio de IgG1 sobre IgG2 específico para NcESA pode ser observado em fase tardia da infecção. Por ELISA, IgM e IgA foram encontradas em diferentes momentos da infecção, não podendo ser associado a fase aguda da neosporose. Índice Avidez (IA) 70% foram associados com a fase inicial e tardia da infecção, respectivamente. Bandas de 29 e 36 kDa de NLA foram imunodominantes para IgG, IgG1 e IgG2. Distintas bandas desta mesma fração foram reconhecidas por IgG1 e IgG2 (59-60,80 e 110 kDa) e IgA (32 kDa) somente após reinfecção. Já as bandas de 42 e 50 kDa do antígenos total de N. caninum foram imunodominantes para IgG, IgG1, IgG2 e IgM durante a infecção, sendo o reconhecimento de 15 e 24 kDa por IgG e 24 e 28 kDa por IgA indicadores de reinfecção da neosporose bovina. Quando avaliado o NcESA, pode ser observado a associação do perfil de marcação, IgG(+) e IgM(-), para as bandas 32 e 36 kDa com fase crônica da infecção e IgG1 para 32 kDa e IgA para 30 e 32 kDa com marcadores de reinfecção. Desta forma, pode ser observado que as associações de diferentes técnicas de diagnóstico com diferentes frações antigênicas podem elucidar o perfil de infecção favorecendo a distinção específica entre fases iniciais, tardias e de reinfecção da neosporose