Endogenous Bak inhibitors Mcl-1 and Bcl-xL: differential impact on TRAIL resistance in Bax-deficient carcinoma

Although both Mcl-1 and Bcl-xL keep proapoptotic Bak in check, it is the loss of Mcl-1 that sensitizes cells to death receptor–mediated apoptosis

Characterization of the p14ARF-tumor suppressor signaling pathway

Das Tumorsuppressorprotein p14ARF kann Apoptose sowohl über einen p53-abhängigen, als auch über einen p53-unabhängigen, mitochondrialen Signalweg auslösen. Ziel dieser Arbeit war es daher, diese beiden Signalwege in humanen Tumorzelllinienmodellen miteinander zu vergleichen und auf funktioneller Ebene zu dissezieren. Hierfür wurden zunächst systematisch die pro- und anti-apoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Genfamilie, die maßgeblich an der Aktivierung der mitochondrialen Apoptose beteiligt sind, sowohl in einem p53-profizienten Zellen, als auch in einem p53-defizienten Zellen hinsichtlich ihrer Expression und ihrer Funktionen untersucht. Nach Expression von p14ARF kommt es in p53-profizienten Zellen zu einer transkriptionellen Hochregulation des Apoptose-fördernden BH3-only-Proteins Puma. Einhergehend damit stieg die Puma-Proteinkonzentration an. Des Weiteren folgte eine aktivierende Konformationsänderung des Apoptose-fördernden Bcl-2-Proteins Bax. Bax transloziert und senkt sich in die Mitochondrienmembran ein, was zur Freisetzung pro-apoptotischer Faktoren, wie Cytochrom c, aus den Mitochondrien ins Zytosol und zur Auslösung von Apoptose führt. Die funktionelle Bedeutung des BH3-only-Proteins Puma zeigt sich ferner daran, dass Puma-defiziente Zellen vollständig resistent gegenüber der Apoptose-vermittelnden Wirkung von p14ARF sind und die Rekonstitution von Puma diese Zelltodresistenz wirkungsvoll durchbrechen kann. In p53-defizienten Zellen hingegen verläuft die Apoptose nach Expression von p14ARF gänzlich unabhängig von Puma und anderen BH3-only-Proteinen, sowie von Bax ab. Stattdessen löst p14ARF hier eine gezielte Herunterregulation der Apoptose-hemmenden Bcl-2-Familienmitglieder Mcl-1 und Bcl-xL aus. Hierdurch entfällt deren hemmende Wirkung auf das Apoptose-fördernde Bax-Homolog Bak, welches durch N-terminale Konformations-änderung aktiviert wird und daraufhin Apoptose über einen mitochondrialen Signalweg einleitet. Eine Sensibilisierung für Bak- vermittelte Apoptose durch Herunterregulation von Mcl-1 konnte auch für den Zelltod, der durch den Todesliganden TRAIL (tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand) ausgelöst wird, gezeigt werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass, in Abhängigkeit vom p53-Status und der Expression der zentralen Apoptose-Effektoren Bax und Bak, Tumorzellen über sehr distinkte Apoptose-Signalwege auf zellulären Stress reagieren. Insbesondere konnten durch diese Untersuchungen wesentliche Unterschiede in der zellulären Reaktion auf den p14ARF Tumorsuppressor, der ein wesentliches Element der Onkogen-induzierten Stressantwort darstellt, erarbeitet werden. Diese Unterschiede sind auch für die Empfindlichkeit von Krebszellen gegenüber neuen Tumortherapeutika wie TRAIL von Bedeutung.The tumor suppressor p14ARF is capable of triggering apoptosis via a p53-dependent and -independent mitochondrial signaling pathway. Aim of this work was, to explore both mechanisms of p14ARF-mediated apoptosis in human cancer cells. Therefore, the pro- and antiapoptotic Bcl-2 protein family members were analyzed towards expression levels and function after p14ARF- expression in p53-deficient and p53-proficient tumor cells. Upon p14ARF- expression in p53-proficient tumor cells the proapoptotic BH3-only protein Puma is rapidly induced at both the mRNA and the protein level. Furthermore, p14ARF triggers the N-terminal conformational change of Bax protein which translocates from the cytosol to the cytoplasm of mitochondria. This is followed by activation of mitochondria, by the breakdown of mitochondrial membrane potential, release of proapoptotic factors, such as cytochrome c, activation of caspase cascade and execution of apoptosis. Apoptosis induction by p14ARF critically depends on the presence of Puma. Moreover, Puma-deficient tumor cells are almost completely resistant towards p14ARF-induced apoptosis. However, the sensitivity of Puma-deficient cells to p14ARF-induced apoptosis is fully restored by functional reconstitution of Puma. Interestingly on the other hand, the p53-independent induction of mitochondrial apoptosis by p14ARF is fully independent from the BH3-only proteins like Puma and other proapoptotic proteins like Bax. Thus, p14ARF is triggering the mitochondrial apoptosis signaling by activating the Bax-homolog Bak, which is facilitated by the down-regulation of the antiapoptotic proteins Mcl-1 and Bcl-xL. The inhibition of two endogenous Bak inhibitors leads to activation of Bak and therefore leads to induction of mitochondrial apoptosis in the absence of BH3-only protein regulation. Furthermore, we were also able to show the sensitivity towards Bak-mediated induction of apoptosis after inhibition of the antiapoptotic protein Mcl-1 in death ligand TRAIL-(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand) triggered apoptosis. Taken together, these data indicate that, dependent on protein status of p53, and the expression of proapoptotic Bax and Bak, p14ARF is capable to trigger distinct signaling pathways in tumor cells. Moreover, tumor cells behave different upon cellular stress. Especially, the analysis shows differences of the cellular stress response upon activation of the tumor suppressor p14ARF. The differences are most important for sensitization of human cancer cells towards new tumor therapeutics, such as TRAIL