Influència de l'haplotip 46/1 del gen JAK2 en la variació de la càrrega al·lèlica de la mutació JAK2V617F en pacients amb policitèmia vera i trombocitèmia esencial

La presència de l'haplotip 46/1 del gen JAK2 predisposa a neoplàsies mieloproliferatives associades a la mutació de JAK2V617F, però la seva rellevància clínica és desconeguda. En aquest treball determinem, de forma retrospectiva, la càrrega al·lèlica de JAK2V617F de 62 pacients amb NMP JAK2V617+, en el moment del diagnòstic i en l'últim control. Posteriorment, analizem l'augment de la càrrega al·lèlica de JAK2V617F amb l'objectiu de determinar si aquesta es manté estable o presenta un augment progressiu durant el curs natural de la malaltia. Finalment, analitzem la relació entre els resultats obtinguts i l'evolució clínica dels pacients

Caracterización de los progenitores hematopoyéticos CD34+ en las neoplasias mieloproliferativas y su papel en la evolución de la carga mutacional

Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) son enfermedades clonales de la célula madre hematopoyética que se caracterizan por la proliferación de una o más de las líneas mieloides. Se acuerdo con la clasificación actual de la OMS, las NMP cromosoma Filadelfia negativas clásicas incluyen la policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP). En el año 2005 se describió la mutación p.V617F del gen JAK2 presente en el 95% de los pacientes con PV y en la mitad de los casos de TE y MFP. Más recientemente, se han descrito mutaciones que afectan al gen MPL y mutaciones en el gen de la CALR en los pacientes con TE y MFP JAK2 no mutadas. Todas estas mutaciones se consideran mutaciones driver o conductoras de las NMP. Adicionalmente, se han descrito otras mutaciones somáticas que no actúan primariamente en la proliferación celular, pero que pueden modificar el efecto de las mutaciones driver. Las NMP JAK2V617F mutadas se caracterizan por la coexistencia de progenitores clonales JAK2V617F mutados y no mutados. El conocimiento de la carga mutacional de JAK2V617F y de las mutaciones non-driver a nivel de los progenitores hematopoyéticos podría proporcionar información sobre la base biológica de los cambios clínicos evolutivos, especialmente, la transformación a mielofibrosis y leucemia aguda. Asimismo, la carga mutacional a nivel progenitor también podría influir en la respuesta al tratamiento. Algunos autores postulan que las NMP CALR mutadas son una entidad distinta de las JAK2 mutadas, tanto desde el punto de vista biológico, como clínico y pronóstico. Estas observaciones podrían ser la consecuencia de un comportamiento diferente a nivel de los progenitores hematopoyéticos. En este contexto, el presente trabajo de investigación ha caracterizado las subpoblaciones de progenitores hematopoyéticos (CD34+CD38- y CD34+CD38+) de pacientes con NMP JAK2 y CALR mutadas y se ha correlacionado la carga mutacional con la fase evolutiva de la enfermedad, la presencia de mutaciones adicionales y con la presencia de dominancia clonal. Asimismo, se han evaluado las diferencias en el tamaño del clon mutado de los progenitores mutados de acuerdo con el genotipo JAK2 o CALR. Finalmente, se ha investigado el efecto del tratamiento con inhibidores de JAK2 en la evolución de la carga mutacional a nivel progenitor. Los resultados del primer trabajo mostraron que el porcentaje de células CD34+ con mutación V617F del gen JAK2 en los pacientes con PV aumenta durante la evolución de la enfermedad y que en la MF post-PV existe un predominio de progenitores hematopoyéticos mutados probablemente como consecuencia de la expansión de los clones homocigotos. Finalmente, se observó que en el momento del diagnóstico de la PV puede existir hematopoyesis clonal debido a la expansión de clones con mutaciones adicionales. En el segundo trabajo pudimos demostrar que la proporción de progenitores hematopoyéticos mutados es diferente de acuerdo con el genotipo de las NMP. Los pacientes con mutación de CALR se caracterizan por una expansión de los progenitores mutados, mientras que los pacientes con TE y PV JAK2V617F presentan un pequeño porcentaje de progenitores mutados con una alta capacidad de diferenciación. Por último, analizamos la evolución de la carga mutacional de JAK2V617F en una serie de 7 pacientes con NMP durante los primeros 12 meses de tratamiento con un inhibidor de JAK2 (Ruxolitinib). Los resultados obtenidos sugieren que dicho fármaco tiene una escasa capacidad de modificar la carga mutacional de JAK2V617F en las células CD34+ en los pacientes con PV y MF.Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal diseases that origin from hematopoietic stem cell and are characterized by a proliferation of one or more of the myeloid cell types. According to the current WHO Classification, classic Philadelphia negative MPN include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (TE) and primary mielofibrosis (PMF). In 2005, JAK2V617F mutation was described in 95% of PV patients and in half of ET and PMF patients. More recently, mutations affecting MPL or CALR gene have been reported in patients with JAK2V617F negative TE and PMF. All these mutations are considered driver mutations. In addition, other somatic mutations that do not act primarily on cell proliferation, but can modify the effect of the driver mutations, have been described. JAK2V617F MPN are characterized by the coexistence of normal and JAK2V617F-mutated progenitors. Knowledge of the mutational allele burden of JAK2V617F at the progenitor level could provide information on the biological basis of evolutionary clinical changes, especially myelofibrotic and acute leukemia transformation. Moreover, the mutational load at the progenitor level may also influence treatment response. Finally, some authors postulate that CALR mutated MPN are a distinct entity from a biological, clinical and prognostic point of view from JAK2V617F MPN. These observations could be the consequence of a different behaviour at the level of hematopoietic progenitors. In this sense, this work has characterized different subpopulations of hematopoietic progenitor cells (CD34+CD38- and CD34+CD38+) from patients with JAK2V617F and CALR-mutated MPN and their mutational allele burden has been correlated with disease status, presence of additional mutations and presence of clonal dominance. Also, we compared the mutational allele burden at the progenitor level according to the genotype (JAK2 or CALR). Finally, we evaluated the effect of the treatment with JAK2 inhibitors on the JAK2V617F mutant allele burden of the progenitor cells. In our first study, we showed that the percentage of CD34+ cells carrying JAK2V617F mutation increases during the evolution of the disease in PV patients. Moreover, we could demonstrate that the transformation to myelofibrosis is characterized by a predominance of JAK2V617F progenitor cells probably due to the expansion of homozygous clones. Finally, we observed that at the time of PV diagnosis there may be clonal hematopoiesis due to the expansion of clones with additional mutations. In the second study, we could show that the proportion of mutated hematopoietic progenitors is different according to the genotype. Patients with CALR-mutated MPN are characterized by an expansion of mutated progenitors, whereas patients with JAK2V617F ET and PV present a low percentage of mutated progenitors with a high differentiation capacity. Finally, we analysed the evolution of the mutational allele burden of JAK2V617F in 7 patients with MPN during the first 12 months of treatment with JAK2 inhibitor (Ruxolitinib). The results suggest that ruxolitinib has a minimal effect on the JAK2V617F mutant allele burden variation in CD34+ cells

Influència de l’haplotip 46/1 del gen JAK2 en la variació de la càrrega al•lèlica de la mutació JAK2V617F en pacients amb policitèmia vera i trombocitèmia esencial

La presència de l’haplotip 46/1 del gen JAK2 predisposa a neoplàsies mieloproliferatives associades a la mutació de JAK2V617F, però la seva rellevància clínica és desconeguda. En aquest treball determinem, de forma retrospectiva, la càrrega al•lèlica de JAK2V617F de 62 pacients amb NMP JAK2V617+, en el moment del diagnòstic i en l’últim control. Posteriorment, analizem l’augment de la càrrega al•lèlica de JAK2V617F amb l’objectiu de determinar si aquesta es manté estable o presenta un augment progressiu durant el curs natural de la malaltia. Finalment, analitzem la relació entre els resultats obtinguts i l’evolució clínica dels pacients

Caracterización de los progenitores hematopoyéticos CD34+ en las neoplasias mieloproliferativas y su papel en la evolución de la carga mutacional

Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) son enfermedades clonales de la célula madre hematopoyética que se caracterizan por la proliferación de una o más de las líneas mieloides. Se acuerdo con la clasificación actual de la OMS, las NMP cromosoma Filadelfia negativas clásicas incluyen la policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP). En el año 2005 se describió la mutación p.V617F del gen JAK2 presente en el 95% de los pacientes con PV y en la mitad de los casos de TE y MFP. Más recientemente, se han descrito mutaciones que afectan al gen MPL y mutaciones en el gen de la CALR en los pacientes con TE y MFP JAK2 no mutadas. Todas estas mutaciones se consideran mutaciones driver o conductoras de las NMP. Adicionalmente, se han descrito otras mutaciones somáticas que no actúan primariamente en la proliferación celular, pero que pueden modificar el efecto de las mutaciones driver. Las NMP JAK2V617F mutadas se caracterizan por la coexistencia de progenitores clonales JAK2V617F mutados y no mutados. El conocimiento de la carga mutacional de JAK2V617F y de las mutaciones non-driver a nivel de los progenitores hematopoyéticos podría proporcionar información sobre la base biológica de los cambios clínicos evolutivos, especialmente, la transformación a mielofibrosis y leucemia aguda. Asimismo, la carga mutacional a nivel progenitor también podría influir en la respuesta al tratamiento. Algunos autores postulan que las NMP CALR mutadas son una entidad distinta de las JAK2 mutadas, tanto desde el punto de vista biológico, como clínico y pronóstico. Estas observaciones podrían ser la consecuencia de un comportamiento diferente a nivel de los progenitores hematopoyéticos. En este contexto, el presente trabajo de investigación ha caracterizado las subpoblaciones de progenitores hematopoyéticos (CD34+CD38- y CD34+CD38+) de pacientes con NMP JAK2 y CALR mutadas y se ha correlacionado la carga mutacional con la fase evolutiva de la enfermedad, la presencia de mutaciones adicionales y con la presencia de dominancia clonal. Asimismo, se han evaluado las diferencias en el tamaño del clon mutado de los progenitores mutados de acuerdo con el genotipo JAK2 o CALR. Finalmente, se ha investigado el efecto del tratamiento con inhibidores de JAK2 en la evolución de la carga mutacional a nivel progenitor. Los resultados del primer trabajo mostraron que el porcentaje de células CD34+ con mutación V617F del gen JAK2 en los pacientes con PV aumenta durante la evolución de la enfermedad y que en la MF post-PV existe un predominio de progenitores hematopoyéticos mutados probablemente como consecuencia de la expansión de los clones homocigotos. Finalmente, se observó que en el momento del diagnóstico de la PV puede existir hematopoyesis clonal debido a la expansión de clones con mutaciones adicionales. En el segundo trabajo pudimos demostrar que la proporción de progenitores hematopoyéticos mutados es diferente de acuerdo con el genotipo de las NMP. Los pacientes con mutación de CALR se caracterizan por una expansión de los progenitores mutados, mientras que los pacientes con TE y PV JAK2V617F presentan un pequeño porcentaje de progenitores mutados con una alta capacidad de diferenciación. Por último, analizamos la evolución de la carga mutacional de JAK2V617F en una serie de 7 pacientes con NMP durante los primeros 12 meses de tratamiento con un inhibidor de JAK2 (Ruxolitinib). Los resultados obtenidos sugieren que dicho fármaco tiene una escasa capacidad de modificar la carga mutacional de JAK2V617F en las células CD34+ en los pacientes con PV y MF.Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal diseases that origin from hematopoietic stem cell and are characterized by a proliferation of one or more of the myeloid cell types. According to the current WHO Classification, classic Philadelphia negative MPN include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (TE) and primary mielofibrosis (PMF). In 2005, JAK2V617F mutation was described in 95% of PV patients and in half of ET and PMF patients. More recently, mutations affecting MPL or CALR gene have been reported in patients with JAK2V617F negative TE and PMF. All these mutations are considered driver mutations. In addition, other somatic mutations that do not act primarily on cell proliferation, but can modify the effect of the driver mutations, have been described. JAK2V617F MPN are characterized by the coexistence of normal and JAK2V617F-mutated progenitors. Knowledge of the mutational allele burden of JAK2V617F at the progenitor level could provide information on the biological basis of evolutionary clinical changes, especially myelofibrotic and acute leukemia transformation. Moreover, the mutational load at the progenitor level may also influence treatment response. Finally, some authors postulate that CALR mutated MPN are a distinct entity from a biological, clinical and prognostic point of view from JAK2V617F MPN. These observations could be the consequence of a different behaviour at the level of hematopoietic progenitors. In this sense, this work has characterized different subpopulations of hematopoietic progenitor cells (CD34+CD38- and CD34+CD38+) from patients with JAK2V617F and CALR-mutated MPN and their mutational allele burden has been correlated with disease status, presence of additional mutations and presence of clonal dominance. Also, we compared the mutational allele burden at the progenitor level according to the genotype (JAK2 or CALR). Finally, we evaluated the effect of the treatment with JAK2 inhibitors on the JAK2V617F mutant allele burden of the progenitor cells. In our first study, we showed that the percentage of CD34+ cells carrying JAK2V617F mutation increases during the evolution of the disease in PV patients. Moreover, we could demonstrate that the transformation to myelofibrosis is characterized by a predominance of JAK2V617F progenitor cells probably due to the expansion of homozygous clones. Finally, we observed that at the time of PV diagnosis there may be clonal hematopoiesis due to the expansion of clones with additional mutations. In the second study, we could show that the proportion of mutated hematopoietic progenitors is different according to the genotype. Patients with CALR-mutated MPN are characterized by an expansion of mutated progenitors, whereas patients with JAK2V617F ET and PV present a low percentage of mutated progenitors with a high differentiation capacity. Finally, we analysed the evolution of the mutational allele burden of JAK2V617F in 7 patients with MPN during the first 12 months of treatment with JAK2 inhibitor (Ruxolitinib). The results suggest that ruxolitinib has a minimal effect on the JAK2V617F mutant allele burden variation in CD34+ cells

Influència de l'haplotip 46/1 del gen JAK2 en la variació de la càrrega al·lèlica de la mutació JAK2V617F en pacients amb policitèmia vera i trombocitèmia esencial

La presència de l'haplotip 46/1 del gen JAK2 predisposa a neoplàsies mieloproliferatives associades a la mutació de JAK2V617F, però la seva rellevància clínica és desconeguda. En aquest treball determinem, de forma retrospectiva, la càrrega al·lèlica de JAK2V617F de 62 pacients amb NMP JAK2V617+, en el moment del diagnòstic i en l'últim control. Posteriorment, analizem l'augment de la càrrega al·lèlica de JAK2V617F amb l'objectiu de determinar si aquesta es manté estable o presenta un augment progressiu durant el curs natural de la malaltia. Finalment, analitzem la relació entre els resultats obtinguts i l'evolució clínica dels pacients

Characterization of CD34+ hematopoietic progenitor cells in JAK2V617F and CALR-mutated myeloproliferative neoplasms.

Mutations in JAK2 or CALR are observed in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN). To get further insight in the dynamics of the mutant clone, we assessed the mutant allele burden in hematopoietic stem cells (HSCs), hematopoietic progenitor cells (HPCs) and granulocytes from 138 patients [51 polycythemia vera (PV), 58 essential thrombocythemia (ET) and 29 myelofibrosis (MF)]. CALR-mutated ET patients harbored a higher mutant load at progenitor level than JAK2V617F-positive ET (HSCs: 39.9% vs 7.5% p<0.001, HPCs: 32.7% vs 7.7% p<0.001). Moreover, HSCs of CALR-mutated ET patients showed a similar mutational load than patients with CALR-mutated MF (39.9% vs 48.2%, p=0.17). Regarding JAK2V617F MPN, PV and ET patients showed a low mutational burden at progenitor level whereas in the myelofibrotic phase the dominance of the mutated clone was a constant finding. In conclusion, the size of the mutated clone in chronic phase MPN is different according to genotype with CALR-mutated ET showing a pattern similar to that observed in MF.This study was supported by grants from the Ministry of Health of Spain and Instituto de Salud Carlos III FEDER (FIS PI10/018087, PI13/00557, PI13/00393, RD12/0036/0010

Masked polycythaemia vera: presenting features, response to treatment and clinical outcomes.

Masked polycythaemia vera (PV) has been proposed as a new entity with poorer outcome than overt PV. In this study, the initial clinical and laboratory characteristics, response to treatment and outcome of masked and overt PV were compared using red cell mass and haemoglobin or haematocrit levels for the distinction between both entities. Sixty-eight of 151 PV patients (45%) were classified as masked PV according to World Health Organisation diagnostic criteria, whereas 16 (11%) were classified as masked PV using the British Committee for Standards in Haematology (BCSH). In comparison with overt PV, a higher platelet count and a lower JAK2V617F allele burden at diagnosis were observed in masked PV. Patients with masked PV needed lower phlebotomies and responded faster to hydroxcarbamide than those with overt PV. Complete haematological response was more frequently achieved in masked than in overt PV (79% vs. 58%, P = 0.001). There were no significant differences in the duration of haematological response, the rate of resistance or intolerance to hydroxycarbamide and the probability of molecular response according to type of PV (masked vs. overt). Overall survival, rate of thrombosis and major bleeding, and probability of transformation was superimposable among patients with masked and overt PV.This work was supported by grants from the Spanish Health Ministry ‘Fondo de Investigación Sanitaria’, PI10/01807,PI13/00557, PI13/00393, AECC Cataluña 2011, Instituto de Salud Carlos III FEDER RD12/0036/0010, SGR2014 567,the ‘Xarxa de Bancs de Tumors sponsored by Pla Director d’Oncologia de Catalunya (XBTC)’. Anna Angona is currently supported by a research grant from RETICS RD12/0036/0010

Characterization of CD34+ hematopoietic progenitor cells in JAK2V617F and CALR-mutated myeloproliferative neoplasms.

Mutations in JAK2 or CALR are observed in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN). To get further insight in the dynamics of the mutant clone, we assessed the mutant allele burden in hematopoietic stem cells (HSCs), hematopoietic progenitor cells (HPCs) and granulocytes from 138 patients [51 polycythemia vera (PV), 58 essential thrombocythemia (ET) and 29 myelofibrosis (MF)]. CALR-mutated ET patients harbored a higher mutant load at progenitor level than JAK2V617F-positive ET (HSCs: 39.9% vs 7.5% p<0.001, HPCs: 32.7% vs 7.7% p<0.001). Moreover, HSCs of CALR-mutated ET patients showed a similar mutational load than patients with CALR-mutated MF (39.9% vs 48.2%, p=0.17). Regarding JAK2V617F MPN, PV and ET patients showed a low mutational burden at progenitor level whereas in the myelofibrotic phase the dominance of the mutated clone was a constant finding. In conclusion, the size of the mutated clone in chronic phase MPN is different according to genotype with CALR-mutated ET showing a pattern similar to that observed in MF.This study was supported by grants from the Ministry of Health of Spain and Instituto de Salud Carlos III FEDER (FIS PI10/018087, PI13/00557, PI13/00393, RD12/0036/0010

Masked polycythaemia vera: presenting features, response to treatment and clinical outcomes.

Masked polycythaemia vera (PV) has been proposed as a new entity with poorer outcome than overt PV. In this study, the initial clinical and laboratory characteristics, response to treatment and outcome of masked and overt PV were compared using red cell mass and haemoglobin or haematocrit levels for the distinction between both entities. Sixty-eight of 151 PV patients (45%) were classified as masked PV according to World Health Organisation diagnostic criteria, whereas 16 (11%) were classified as masked PV using the British Committee for Standards in Haematology (BCSH). In comparison with overt PV, a higher platelet count and a lower JAK2V617F allele burden at diagnosis were observed in masked PV. Patients with masked PV needed lower phlebotomies and responded faster to hydroxcarbamide than those with overt PV. Complete haematological response was more frequently achieved in masked than in overt PV (79% vs. 58%, P = 0.001). There were no significant differences in the duration of haematological response, the rate of resistance or intolerance to hydroxycarbamide and the probability of molecular response according to type of PV (masked vs. overt). Overall survival, rate of thrombosis and major bleeding, and probability of transformation was superimposable among patients with masked and overt PV.This work was supported by grants from the Spanish Health Ministry ‘Fondo de Investigación Sanitaria’, PI10/01807,PI13/00557, PI13/00393, AECC Cataluña 2011, Instituto de Salud Carlos III FEDER RD12/0036/0010, SGR2014 567,the ‘Xarxa de Bancs de Tumors sponsored by Pla Director d’Oncologia de Catalunya (XBTC)’. Anna Angona is currently supported by a research grant from RETICS RD12/0036/0010

Molecular characterisation of triple negative essential thrombocythaemia patients by platelet analysis and targeted sequencing.

Essential thrombocythaemia (ET) is a myeloproliferative neoplasm(MPN) characterised by megakaryocyte hyperplasia and thrombo-cytosis. From the genetic perspective, ET patients harbourmutations inJAK2(50–60%),CALR(15–30%) andMPL(1–5%) genes.This study was supported in part by grants from ISCIII and Spanish Ministry of Health, PI13/00557, PI13/00393, RD12/0036/0010, PT13/0010/0005, 2014SGR567 and the Xarxa de Banc de Tumors de Catalunya