Splice-shifting oligonucleotide (SSO) mediated blocking of an exonic splicing enhancer (ESE) created by the prevalent c.903+469T>C MTRR mutation corrects splicing and restores enzyme activity in patient cells

The prevalent c.903+469T>C mutation in MTRR causes the cblE type of homocystinuria by strengthening an SRSF1 binding site in an ESE leading to activation of a pseudoexon. We hypothesized that other splicing regulatory elements (SREs) are also critical for MTRR pseudoexon inclusion. We demonstrate that the MTRR pseudoexon is on the verge of being recognized and is therefore vulnerable to several point mutations that disrupt a fine-tuned balance between the different SREs. Normally, pseudoexon inclusion is suppressed by a hnRNP A1 binding exonic splicing silencer (ESS). When the c.903+469T>C mutation is present two ESEs abrogate the activity of the ESS and promote pseudoexon inclusion. Blocking the 3′splice site or the ESEs by SSOs is effective in restoring normal splicing of minigenes and endogenous MTRR transcripts in patient cells. By employing an SSO complementary to both ESEs, we were able to rescue MTRR enzymatic activity in patient cells to approximately 50% of that in controls. We show that several point mutations, individually, can activate a pseudoexon, illustrating that this mechanism can occur more frequently than previously expected. Moreover, we demonstrate that SSO blocking of critical ESEs is a promising strategy to treat the increasing number of activated pseudoexon

The Splicing Efficiency of Activating HRAS Mutations Can Determine Costello Syndrome Phenotype and Frequency in Cancer

Costello syndrome (CS) may be caused by activating mutations in codon 12/13 of the HRAS proto-oncogene. HRAS p.Gly12Val mutations have the highest transforming activity, are very frequent in cancers, but very rare in CS, where they are reported to cause a severe, early lethal, phenotype. We identified an unusual, new germline p.Gly12Val mutation, c.35_36GC>TG, in a 12-year-old boy with attenuated CS. Analysis of his HRAS cDNA showed high levels of exon 2 skipping. Using wild type and mutant HRAS minigenes, we confirmed that c.35_36GC>TG results in exon 2 skipping by simultaneously disrupting the function of a critical Exonic Splicing Enhancer (ESE) and creation of an Exonic Splicing Silencer (ESS). We show that this vulnerability of HRAS exon 2 is caused by a weak 3' splice site, which makes exon 2 inclusion dependent on binding of splicing stimulatory proteins, like SRSF2, to the critical ESE. Because the majority of cancer- and CS- causing mutations are located here, they affect splicing differently. Therefore, our results also demonstrate that the phenotype in CS and somatic cancers is not only determined by the different transforming potentials of mutant HRAS proteins, but also by the efficiency of exon 2 inclusion resulting from the different HRAS mutations. Finally, we show that a splice switching oligonucleotide (SSO) that blocks access to the critical ESE causes exon 2 skipping and halts proliferation of cancer cells. This unravels a potential for development of new anti-cancer therapies based on SSO-mediated HRAS exon 2 skipping

Abstracts from the 8th International Conference on cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications

This work was supported by a restricted research grant of Bayer AG

Förekomsten av rabatt vid värdering av privata bolag i Sverige - En kvalitativ studie bland svenska banker och investmentbolag

Genom ett flertal kvantitativa undersökningar har forskare konstaterat att privata bolag, i jämförelse med publika bolag, värderas till rabatt. Den procentuella siffran varierar beroende på studie men uppgår till mellan 15 och 33.75 procent. Vår avsikt har varit att undersöka huruvida det som framkommit genom dessa kvantitativa undersökningar stämmer överens med vad praktiker som arbetar med företagsvärdering anser. Vi ville även undersöka huruvida praktiker använder sig av en standardiserad rabatt för privata bolag vid företagsvärdering. Som respondenter för vår undersökning valde vi erfarna medarbetare på investmentbolag och större banker i Sverige. Det är också genom dessa val vår avgränsning skett. För att bäst uppnå vårt syfte och kunna besvara våra forskningsfrågor har vi valt att tillämpa en kvalitativ metod då den till sin natur är mer förklarande och lämpar sig bättre när syftet är att fördjupa förståelsen för ett ämne. Respondenterna var i stort sett eniga i sin syn på värdering av företag och förekomsten av en rabatt för privata bolag. Det förekom dock vissa avvikelser. Vi argumenterar för att det, i enlighet med vad våra respondenter hävdar, i praktiken inte förekommer någon ren privat bolagsrabatt. Den rabatt som likställs med en privat bolagsrabatt utgörs istället av ett flertal rabatter till följd av ett bolags olika egenskaper, vilka oftast sammanfaller för privata bolag. Det rör sig om bolagets storlek, dess möjlighet till genomlysning för förvärvsaspiranter och dess avsaknad av likviditet

Norges frivilligsentraler - tid som betyr noe

Denne bacheloroppgaven i kampanjeplanlegging er et avsluttende arbeid for studiet Kommunikasjonsledelse ved Handelshøyskolen BI. Kampanjen er utarbeidet for Norges Frivilligsentraler. Bakgrunnen for kampanjen er at Norges Frivilligsentraler har et behov for flere unge frivillige ved sine sentraler. Oppgavens overordnede problemstilling er derfor: “Hvordan skal vi få flere i aldersgruppen 18 - 25 år til å melde seg som frivillig ved sin lokale frivilligsentral?”. Bacheloroppgaven bygger på Ronald D. Smiths fire kampanjeplanleggingsfaser: formativ forskning, strategi, taktikk og evaluering. Fase 1: Undersøkelser gjort av SSB i 2017 viser at personer mellom 16 og 24 år i gjennomsnitt har 7 timer og 12 minutter fritid hver dag. Samtidig er mer enn halvparten av alle over 16 år ikke fornøyd med hvordan de utnytter fritiden sin. I vår datainnsamling skal vi blant annet kartlegge årsakene til dette, og hvordan det kan påvirke målgruppens ønske om å delta i frivillig arbeid. Vår kvalitative forskning består av fokusgrupper og dybdeintervjuer. Dette ga oss bedre forståelse av målgruppen, og et grunnlag for kvantitativ forskning i form av en nettbasert spørreundersøkelse. Funnene viser at målgruppen har positive holdninger til frivillig arbeid, og at hensikten med kampanjen derfor bør være å endre atferden deres. Respondentene opplyser òg at de ikke har nok tid til å delta i frivillig arbeid, da de oppfatter det som svært tidkrevende. Fase 2: Kampanjens målgruppe ble utformet på bakgrunn av clusteren “De engasjerte” - ett av to segmenter som ble kartlagt i clusteranalysen. De har en positiv holdning til frivillig arbeid, og opplyser at de er villige til å melde seg som frivillig. Følgelig formulerte vi hovedmålet: “Kampanjen skal få flere i målgruppen til å melde seg som frivillig ved sin lokale frivilligsentral”. Herunder har vi utformet to delmål vedrørende målgruppens kjennskap og engasjement knyttet til Norges Frivilligsentraler. De underbygger hovedmålet, og tar utgangspunkt i SMART-kriteriene. For å nå målsettingene ser vi det hensiktsmessig å benytte en proaktiv strategi som kombinerer handlings- og kommunikasjonsstrategier. Gjennom kampanjen skal vi “kommunisere at frivillig arbeid ikke trenger å være tidkrevende, samt øke synligheten til Norges Frivilligsentraler”. Som følge av dette skal budskapet derfor bevisstgjøre målgruppen på deres egen tidsbruk, samt endre deres oppfatning av frivillig arbeid som tidkrevende. Det skal blant annet gjøres ved å illustrere hvor mye fritid de gjennomsnittlig har hver dag, samt vise gjenkjennelige eksempler på unødvendig tidsbruk i hverdagen. Kampanjen har fått navnet “Tid som betyr noe”. Fase 3: Med utgangspunkt i de formative undersøkelsene og strategien, har vi kommet opp med følgende taktikker som vil gjennomføres mellom 1. september og 15. oktober 2019: Publisitetsstunt: Hensikten er å oppnå positiv medieomtale, få publikums oppmerksomhet og øke målgruppens kjennskap om Norges Frivilligsentraler. I et forsøk på å oppnå dette skal publisitetsstuntet filmes og deles i sosiale medier. Stuntets støttetaktikker er å bruke opinionsledere for økt spredning, og publisere en kronikk i media for å skape diskusjon rundt temaet. Reklamefilmer på Instagram: Hensikten er å sikre synlighet av kampanjen i en kanal målgruppen bruker. En nødvendig støttetaktikk er å forbedre nettsiden til Norges Frivilligsentraler. Dette er viktig for at kampanjen skal oppnå ønskelig effekt. Reklame i podkast: Hensikten er å presentere kampanjen i et format hvor budskapet formidles på en mer beskrivende måte, treffer målgruppen godt, og i mindre grad fremstår som betalt innhold. For kampanjen er det satt opp en budsjettramme på 250 000 kroner. Fase 4: Evalueringen av kampanjen inneholder en implementeringsrapport, en progresjonsrapport og en sluttrapport. Den presenterer òg forslag til målemetoder for kampanjens hovedmål og delmål. Evalueringen skal vise om tiltakene har bidratt til å oppnå målsettingene, og om kampanjen har vært vellykket

Splicing of phenylalanine hydroxylase (PAH) exon 11 is vulnerable: molecular pathology of mutations in PAH exon 11

In about 20-30% of phenylketonuria (PKU) patients, phenylalanine (Phe) levels can be controlled by cofactor 6R-tetrahydrobiopterin (BH(4)) administration. The phenylalanine hydroxylase (PAH) genotype has a predictive value concerning BH(4)-response and therefore a correct assessment of the mutation molecular pathology is important. Mutations that disturb the splicing of exons (e.g. interplay between splice site strength and regulatory sequences like exon splicing enhancers (ESEs)/exon splicing silencers (ESSs)) may cause different severity of PKU. In this study, we identified PAH exon 11 as a vulnerable exon and used patient derived lymphoblast cell lines and PAH minigenes to study the molecular defect that impacted pre-mRNA processing. We showed that the c.1144T>C and c.1066-3C>T mutations cause exon 11 skipping, while the c.1139C>T mutation is neutral or slightly beneficial. The c.1144T>C mutation resides in a putative splicing enhancer motif and binding by splicing factors SF2/ASF, SRp20 and SRp40 is disturbed. Additional mutations in potential splicing factor binding sites contributed to elucidate the pathogenesis of mutations in PAH exon 11. We suggest that PAH exon 11 is vulnerable due to a weak 3' splice site and that this makes exon 11 inclusion dependent on an ESE spanning position c.1144. Importantly, this implies that other mutations in exon 11 may affect splicing, since splicing is often determined by a fine balance between several positive and negative splicing regulatory elements distributed throughout the exon. Finally, we identified a pseudoexon in intron 11, which would have pathogenic consequences if activated by mutations or improved splicing conditions. Exonic mutations that disrupt splicing are unlikely to facilitate response to BH(4) and may lead to inconsistent genotype-phenotype correlations. Therefore, recognizing such mutations enhances our ability to predict the BH(4)-response

Absence of an Intron Splicing Silencer in Porcine Smn1 Intron 7 Confers Immunity to the Exon Skipping Mutation in Human SMN2

Spinal Muscular Atrophy is caused by homozygous loss of SMN1. All patients retain at least one copy of SMN2 which produces an identical protein but at lower levels due to a silent mutation in exon 7 which results in predominant exclusion of the exon. Therapies targeting the splicing of SMN2 exon 7 have been in development for several years, and their efficacy has been measured using either in vitro cellular assays or in vivo small animal models such as mice. In this study we evaluated the potential for constructing a mini-pig animal model by introducing minimal changes in the endogenous porcine Smn1 gene to maintain the native genomic structure and regulation. We found that while a Smn2-like mutation can be introduced in the porcine Smn1 gene and can diminish the function of the ESE, it would not recapitulate the splicing pattern seen in human SMN2 due to absence of a functional ISS immediately downstream of exon 7. We investigated the ISS region and show here that the porcine ISS is inactive due to disruption of a proximal hnRNP A1 binding site, while a distal hnRNP A1 binding site remains functional but is unable to maintain the functionality of the ISS as a whole

Identification of Six Novel PTH1R Mutations in Families with a History of Primary Failure of Tooth Eruption

Primary Failure of tooth Eruption (PFE) is a non-syndromic disorder which can be caused by mutations in the parathyroid hormone receptor 1 gene (PTH1R). Traditionally, the disorder has been identified clinically based on post-emergent failure of eruption of permanent molars. However, patients with PTH1R mutations will not benefit from surgical and/or orthodontic treatment and it is therefore clinically important to establish whether a given failure of tooth eruption is caused by a PTH1R defect or not. We analyzed the PTH1R gene in six patients clinically diagnosed with PFE, all of which had undergone surgical and/or orthodontic interventions, and identified novel PTH1R mutations in all. Four of the six mutations were predicted to abolish correct mRNA maturation either through introduction of premature stop codons (c.947C>A and c.1082G>A), or by altering correct mRNA splicing (c.544-26_544-23del and c.989G>T). The latter was validated by transfection of minigenes. The six novel mutations expand the mutation spectrum for PFE from eight to 14 pathogenic mutations. Loss-of-function mutations in PTH1R are also associated with recessively inherited Blomstrand chondrodysplasia. We compiled all published PTH1R mutations and identified a mutational overlap between Blomstrand chondrodysplasia and PFE. The results suggest that a genetic approach to preclinical diagnosis will have important implication for surgical and orthodontic treatment of patients with failure of tooth eruption