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An investigation of cell cycle regulation during in vitro models of diapause
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2022Durante o desenvolvimento embrionário, as células do embrião dão origem a diferentes tecidos, dependendo da potência que tiverem. Em estados iniciais do desenvolvimento embrionário, as células pluripotentes surgem no epiblasto (EPI), pré-implantação. Estas células têm a capacidade de formar qualquer tipo de linha celular das três camadas germinativas, e ainda as células germinais primitivas. As células pluripotentes de ratinho podem ser isoladas da massa celular interna do blastocisto (estágio 3.5) e mantidas in vitro, com a capacidade de se dividirem e renovarem-se a si próprias, em um meio condicionado chamado 2i/LIF. Estas células são chamadas de células estaminais embrionárias de rato, com a sigla mESCs (vinda do inglês “mouse embryonic stem cells”). Ainda durante o início do desenvolvimento, os embriões de várias espécies de mamíferos podem entrar num estado de dormência, conhecido como diapausa. Diapausa é caracterizado pelo atraso da implantação do embrião às paredes uterinas. Estudos mostram que este estado é induzível in vitro tanto em blastocistos (pela inibição da hormona estrogénio e injeção diária de progesterona), como em mESCs (pela inibição da molécula mTOR ou da c-Myc). In vivo, após cinco dias da indução da diapausa, foi sugerido que as células da massa celular interna do blastocisto têm um metabolismo semelhante ao dos estados de quiescência. Quiescência é um tipo de paragem do ciclo celular, reversível, que em muitas espécies é semelhante com diapausa. Um exemplo de quiescência foi demonstrado ser provocado após acumulação da proteína p21, em resposta a danificação intrínseca do ADN. Em blastocistos nos quais a diapausa foi induzida, foi sugerido que p21 medeia a retenção das células do blastocisto na fase G0/G1 do ciclo celular e que reduz a replicação do ADN. Apesar disto, ainda não é conhecido se o ciclo celular das mESCs em diapausa é suspenso ou se o seu progresso é desacelerado. Por tanto, ainda não se sabe se este processo é dependente da proteína p21 e/ou se tem outro mecanismo envolvido. O objetivo do meu projeto é caracterizar a regulação do ciclo celular em mESCs, in vitro, e como é iniciado, mantido e terminado o estado de diapausa. Para tal, técnicas de quantificação de imagens de células tanto fixadas como vivas foram usadas para avaliar a expressão de reguladores do ciclo celular. Foi ainda desenvolvido uma linha celular que reporta a atividade de p21 com fluorescência, por CRISPR/Cas9. O avanço do nosso conhecimento nesta área poderá permitir a confirmação de se diapausa ocorre em humanos, em estudos futuros, possivelmente permitindo uma melhor previsão das datas de nascimento. Por outro lado, este avanço poderá ainda informar o nosso conhecimento para descoberta de novas terapias oncológicas, visto que alguns cancros parecem resistir a quimioterapia através da entrada num estado semelhante a diapausa. Aqui, foi reproduzido o modelo de dormência, antes publicado, pela inibição de mTOR (mTORi). Este modelo foi usado para explorar o fenótipo do seu ciclo celular. Através dele, observou se que o mTORi também causa suspensão do progresso do ciclo celular, com a redução da fração de células que estão na fase S do ciclo, aumento das células em G1, e ainda redução dos valores de expressão da proteína ciclina D e da fosforilação da proteína Rb (P-Rb). Resultados semelhantes foram obtidos quando Nutlin foi usada como tratamento, um ativador da proteína p53. Este tratamento também reduziu o crescimento das mESCs, e a fração de células na fase S. No entanto, os valores de fluorescência de P-Rb quando Nutlin é usado sugerem duas populações de células. Quando o ciclo celular destas células tratadas foi analisado, observou-se um aumento da percentagem de células tanto na fase G1 como na G2, sugerindo que a divisão em subpopulações indicadas pelos níveis de P-Rb poderá ser devido a estarem suspensas em fases diferentes do ciclo celular. Adicionalmente, demonstrou-se ainda que mESCs são menos sensíveis a tratamento que inibem CDK4/6, como Palbociclib, em relação a células somáticas. Palbociclib reduziu os níveis de P-Rb e a fração de células da fase S, com o aumento de células em G1. Contrariamente aos outros inibidores usados, com Palbociclib não se observou alterações nas intensidades detetadas da proteína ciclina D. Adicionalmente, com o intuito de acompanhar a dinâmica dos níveis de expressão da proteína p21, em tempo real, enquanto as células entravam e saiam do estado de diapausa, as mESCs foram transfetadas para incorporar o ADN da proteína de fluorescência mRuby, dentro do gene que codifica a proteína p21, usando CRISPR/Cas9. Posto isto, o relatório final do projeto está aqui representado, apontando novos conhecimentos fascinantes e pontos importantes para próximos estudos, na investigação de como as mESCs entram e saem do estado de diapausa.During embryonic development cells can give rise to different tissues, depending on their potency. Early in embryonic development, pluripotent cells emerge in the pre-implantation epiblast (EPI) which have the capacity to form any cell type derived from one of three primary germ cell layers, as well as germ cells. Mouse pluripotent cells can be isolated from the EPI (embryonic day (E)4.5) and maintained in vitro as self-renewing mouse embryonic stem cells (mESCs) in a culture medium called 2i/LIF. Also, early in development, mammalian embryos of various species can go through a dormancy stage, known as diapause, which in mouse is characterized by a delay in blastocyst implantation. This stage has been induced in vitro either in blastocysts or in mESCs by inhibition of oestrogen and daily progesterone injection, or inhibition of c-Myc or mTOR, respectively. In vivo, after five days of diapause induction, it has been suggested that inner cell mass (ICM) cells are metabolically quiescent. Quiescence is a reversible cell cycle arrest that, in many aspects, appears similar to diapause. One example of quiescence is due to accumulation of p21 in response to intrinsic DNA damage. In diapausedblastocysts in vitro, it has been suggested that p21 mediates the retainment of the blastocyst’s cells inG0/G1-phase and DNA replication reduction during diapause. Despite these findings, in diapausedmESCs it is still poorly understood whether the cells are arrested in a particular cell cycle phase or only present a slower proliferation rate. Therefore, it is unclear if this process is p21-dependent and/or if other molecular mechanisms are involved. The aim of my project is to characterize how the cell cycle of mESCs is regulated in vitro and how they enter, maintain and exit diapause. For this, quantitative fixed and live cell imaging was used to evaluate the expression of cell cycle regulators, and I developed a fluorescent reporter of p21 activity, engineered by CRISPR/Cas9. Advancing our knowledge in this area may permit further studies to confirm if diapause occurs in human, by comparing cell cycle regulations between mESCs with hESCs,that may lead to adjusted pregnancy dates. Alternatively, this might provide insight to cancer therapies, since some cancers might resist chemotherapy by entering into a diapause-like state.Here, I reproduce a published model of dormancy using inhibition of mTOR (mTORi). I used this model to explore cell cycle phenotypes and observed that treatment with mTORi also shows cell cycle arrest with a reduction in the fraction of S-phase cells, increase of cells in G1-phase, reduced Cyclin D levels and a reduction of Rb phosphorylation. Similar results were obtained with the p53 activator Nutlin. Nutlin caused reduced growth in mESCs, and a reduction in the fraction of S-phase cells. However, staining for P-Rb following Nutlin treatment suggest two populations of cells. Cell cycle analysis of Nutlin treated cells showed an increase of cells in both G1- and G2- phases. This may suggest that different P-Rb subpopulations are formed depending on which stage of the cell cycle they arrest in. I also show that mESCs are less sensitive to the CDK4/6 inhibitor Palbociclib than somatic cells. Palbociclib also reduces the percentage of mESCs in S-phase, with an increase of cells in G1-phase, reduction of Rb phosphorylation and, in contrast with the other treatments, I observed no change in Cyclin D intensity. In addition, in order to track p21 expression dynamics in real-time as cells enter and exit diapause states, I transfected mESCs to incorporate mRuby DNA (red fluorescence protein) within the p21 coding gene, by CRISPR/Cas9. Taken together this improves our understanding of cellular quiescence and points towards next steps in the investigation of how mESCs enter and exit a diapause-like state
Targeted nanostructured lipid carriers based epigallocatechin gallate delivery system to cancer cellls
Contributions of non-formal education in socio-educational intervention projects at a students residence: analysis of recreational practice of jump at IFB
Este artigo apresenta os resultados de uma investigação sobre os contributos de atividades
educativas não formais em espaço escolar, em específico, do uso de camas elásticas, popularmente
denominadas “jump”, em atividades desportivas/artísticas por parte de estudantes de Ensino Médio
(equivalente ao Ensino Secundário em Portugal) residentes na escola, enquadradas num projeto
de intervenção socioeducativa promovido pela primeira autora chamado “Jump Interação”. O
público a que se refere o estudo é o de jovens que se veem obrigados a residir na instituição de
ensino, Campus Planaltina do Instituto Federal de Brasília (IFB), que oferece cursos que atribuem
a certificação do Ensino Médio, em particular o curso técnico em agropecuária. Assim, pelo período
mínimo de três anos a escola será seu quase exclusivo ambiente de socialização. O público
atendido, em sua maioria, apresenta-se na adolescência, passando pelo desafio da transitoriedade
identitária, ao mesmo tempo em que está distante dos seus familiares e quadros de referência
afetiva. Acresce que muitos têm uma origem familiar desfavorecida, o que, somado aos restantes
desafios, sugere ações interventivas específicas. Metodologicamente, utilizou-se uma abordagem
qualitativa, com o recurso à entrevista semiestruturada aplicada a participantes do projeto Jump
Interação. A análise permitiu perceber os desafios enfrentados pelos jovens residentes e a forma
como a atividade proposta, mediada por um interventor social, trouxe contribuições para o bem
estar individual e social. Notam-se ganhos no aprender a lidar com novas experimentações; maior
motivação para a educação formal, decorrente do sentimento de pertença alcançado;
desenvolvimento do processo criativo e consequente de valorização pessoal; além dos benefícios
da saúde, autoestima, relaxamento e de atendimento de uma demanda almejada pelos próprios
estudantes: atividades desportivas e de lazer que façam da estadia na escola uma experiência mais
significativa e prazerosa.This article presents the results of an investigation on non-formal education activities in school
spaces, in particular, through the use of trampolines, popularly called > , in sports / artistic
activities with high school pupils living at school, framed by a project called "Jump Interaction",
promoted by the first author.
The object of the study are young people who are forced to reside in the educational institution, a
rural campus of the Federal Institute of Brasilia (IFB), which offers courses that award secondary
education certification, namely in the area of agriculture. Thus, for a minimum period of three years,
school is their almost exclusive socialization environment. The public are mainly adolescent,
experiencing the challenge of identity construction while being away from their families and affective
frameworks. In addition, many have a disadvantaged family background, which, added to the
remaining challenges, suggests specific intervention actions.
Methodologically, a qualitative approach was used, using semi-structured interviews with the
participants of Jump Interaction project. The analysis allowed us to understand the challenges faced
by young people living in school and how the proposed activity, mediated by a social intervention
professional, brought contributions to young people individual and social well being. there were
gains in learning to deal with new challenges; greater motivation in formal education due to the
acquired feeling of belonging; development of the creative process and consequent personal
recovery; and the benefits to health, self-esteem, relaxation and meeting a demand desired by the
students: sports and leisure activities to do in school, making it a more meaningful and enjoyable
experience.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Abdominoplasty with Scarpa Fascia Preservation: Prospective Comparative Study of Suction Drain Number
Monitoring antibiotics in the environment. Study of Quinoxaline derivatives bioactivity
Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em
Química SustentávelAntimicrobial agents have revolutionized medicine and promoted an increase in average life expectancy of human populations worldwide. These drugs are used not only in human medicine but also in veterinary practice, in the treatment and prevention of infections, and in some regions in the world, as well as growth promoters, ensuring a greater and better animal production. The use of antimicrobial agents in animal production causes contamination of the final product with drug residues that are eventually distributed in human food chain. Residues of antimicrobial agents provenient from human and animal consumption are also present in sewage, surface water or ground water. It is still unknown all the consequences of this contamination, but there are indications of changes in indigenous microbiota. The use of these drugs was quickly followed by the emergence of resistance, which led to decreased efficacy and compounds available. Therefore, the spread of antimicrobial agents in the environment is also associated with increased resistance to such drugs.
The presented work intended to establish methods for monitoring the presence of antibiotics in animal foods, evaluate if the presence of antimicrobial agents in the
environment at sub-inhibitory concentrations can contribute to the selection of resistant bacteria and characterize the biological activity of a number of compounds of the quinoxaline family as potential new antimicrobial agents.
In order to achieve these objectives, chromatographic techniques were used for
detection and quantification of antimicrobial agents, methods of microbiology and molecular biology to evaluate the behavior of bacteria under selective pressure.
Various strains of prokaryotes and eukaryotes microorganisms were also used to
evaluate the antimicrobial activity of N-oxide derivatives of quinoxaline. We used,
also, cell cultures to assess the potential toxicity of these new antibiotics. A new
chromatographic method was developed to quantify the reduced and oxidized forms
of glutathione, in order to infer the cellular oxidative stress induced by exposure to the quinoxaline derivative compounds with proven antimicrobial activity.
The results confirm that the chromatographic HPLC-DAD methods are powerful tools in monitoring food quality. They also indicate that the presence of subinhibitory amounts of ciprofloxacin in water may influence the dynamic of susceptible and resistant to ciprofloxacin Escherichia coli population. An assessment of the biological activity of quinoxaline derivatives indicated the
compounds studied as potential new antimicrobial agents who have shown low
toxicity in cell lines and oxidative cell damage in small extent.Fundação para a Ciência e Tecnologia - bolsa de doutoramento SFRH / BD /48116 / 200
Tradução, adaptação cultural e validação do questionário quality of life in epilepsy (QOLIE-31) para a população portuguesa
Provas públicas apresentadas à Escola Superior de Saúde Dr. Lopes Dias do Instituto Politécnico de Castelo Branco para o cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do título de Especialista em Neurofisiologia.A epilepsia é uma das doenças mais comuns e graves do cérebro, pode ocorrer em todas as idades e manifestar-se de variadas formas e com causas distintas. Estima-se que em Portugal haja cerca de 50 mil habitantes com epilepsia, sendo que grande parte dos doentes se encontram em idade ativa, é evidente a necessidade do controlo das crises. Vários estudos demonstraram a relação positiva entre a frequência das crises, a qualidade de vida dos doentes com epilepsia, e os custos envolvidos. A identificação de modelos de gestão que maximizem a qualidade de vida dos doentes vão por isso traduzir-se em ganhos em saúde. O objetivo deste estudo foi fazer a tradução, adaptação cultural e validação do questionário Quality of Life in Epilepsy (QOLIE-31) para a população Portuguesa.
A metodologia utilizada para a tradução e adaptação cultural foi a recomendada por Beaton e colaboradores. Foram feitas duas traduções tendo, depois de analisadas, dado origem a uma versão síntese. Posteriormente, foram feitas duas retrotraduções e todas as versões foram analisadas por uma comissão de especialistas. As alterações propostas foram ajustadas e deram origem à versão pré-teste do questionário que foi aplicada 30 doentes.
A amostra foi constituída por 167 questionários válidos de doentes com diagnostico de epilepsia, com idades compreendidas entre os 18 e os 65 anos, sendo 92 do género feminino e 75 do género masculino. A fidelidade da versão adaptada foi avaliada através da consistência interna, que se revelou boa com um Alfa de Cronbach de 0.88, mostrando que existe uma correlação muito forte entre os itens do instrumento. A validade de constructo foi testada através da análise fatorial (AF) uma vez que o valor de KMO revelou uma correlação média entre as variáveis, com um valor de 0.7. Inicialmente pela AF confirmatória para avaliar a qualidade de ajustamento do modelo de medida teórico à estrutura correlacional observada entre as variáveis desta amostra e posteriormente pela AF exploratória para aferir a relação entre as variáveis que se revelou forte.
A disponibilização deste questionário à comunidade médica e a outros prestadores de cuidados de saúde, permitirá perceber melhor as dificuldades e necessidades dos doentes com epilepsia, assim como dos fatores relacionados com a doença que mais impactam no seu quotidiano. Desta forma, será possível articular os serviços de saúde e seus profissionais para uma gestão mais adequada dos recursos disponíveis potenciando assim ganhos em saúde.ABSTRACT: Epilepsy is one of the most common and serious diseases of the brain, can occur at all ages and manifest itself in a variety of ways and with different causes. It is estimated that in Portugal there are about 50 thousand inhabitants with epilepsy, and most of the patients are of active age, it is evident the need for seizures management. Several studies have demonstrated the positive relationship between the frequency of seizures, the quality of life of patients with epilepsy, and the costs involved. The identification of management models that maximize patients' quality of life will therefore translate into health gains. The objective of this study was to translate, adapt and validate the Quality of Life in Epilepsy questionnaire (QOLIE-31) for the portuguese population.
The methodology used for translation and cultural adaptation was recommended by Beaton et al. Two translations were made and, after being analyzed, gave rise to a synthesis version. Subsequently, two back-translations were made and all versions were analyzed by a committee of experts. The proposed changes were adjusted and gave rise to the pre-test version of the questionnaire which was applied to 30 patients.
The sample consisted of 167 valid questionnaires from patients diagnosed with epilepsy, aged between 18 and 65 years, of which 92 were female and 75 were male. The fidelity of the adapted version was evaluated through internal consistency, which proved to be good with a Cronbach's Alpha of 0.88, showing that there is a very strong correlation between the items of the instrument. The construct validity was tested through factorial analysis (FA) since the KMO value revealed a mean correlation between the variables, with a value of 0.7. Initially, by the confirmatory AF to evaluate the quality of adjustment of the theoretical measurement model to the correlational structure observed between the variables of this sample and later by the exploratory AF to gauge the relationship between the variables that proved to be strong.
The availability of this questionnaire to the medical community and other health care providers will allow us to better understand the difficulties and needs of patients with epilepsy, as well as the factors related to the disease that most impact their daily lives. In this way, it will be possible to articulate the health services and their professionals to a more adequate management of the resources available, thus promoting health gains.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Metallodrugs as protein modulators
Metal-based drugs have been used in medicine for millennia, and some of them are still in use in current medicine. For example, in the treatment of diseases like cancer (Cisplatin) or rheumatoid arthritis (Auranofin), as well as used as antimicrobial agents (silver sulfadiazine) or radiopharmaceuticals. Some of the pharmacological properties of these metal compounds are due to their interactions with protein targets. In this thesis, the potential of novel metal-based compounds as proteins/enzymes inhibitors is highlighted, which may infer them promising anticancer properties.In Part A, gold(III) compounds are presented, which showed to potently inhibit the human membrane protein channels aquaglyceroporins (AQPs) and that can be used as chemical tools to understand the roles of AQPs in physiology and pathophysiology. The studies were conducted via different biophysical, biological and computational methods and unraveled the mechanisms of AQPs inhibition by gold compounds at a molecular level. Additionally, in Part B, we present the study of different families of gold compounds as anticancer agents. Specifically, a new series of bifunctional fluorescent compounds (gold-ruthenium) showed promising anticancer effects in vitro and could be studied in cells via fluorescence microscopy. Moreover, an other series of organometallic gold(I) N-heterocyclic carbenes with a fluorescent coumarin moiety showed promising anticancer effects which are most likely due to the inhibition of the seleno-enzyme thioredoxin reductase (TrxR). Overall, our results demonstrate that gold compounds have great potential for applications in chemical biology and medicine
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