Isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais do sangue menstrual

Orientador: Celia Regina Cavichiolo FrancoMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : Células-tronco (CTs) são células não especializadas, autorrenováveis e que podem originar múltiplos tipos celulares de todos os tecidos do organismo. As CTs adultas contribuem para manutenção e regeneração tecidual. Entre outras características, a multipotencialidade torna estas células uma ferramenta terapêutica atraente capaz de ter um papel importante em uma ampla gama de aplicações clínicas no contexto de terapias celular e gênica. Porém, alguns tipos de CTs não podem ser obtidos por métodos práticos, considerando a relação custo-benefício, nem podem ser facilmente transferidos para uso clínico. Métodos pouco invasivos para a coleta de material e posterior isolamento de CTs são preferidos para o uso em terapias. As células derivadas de sangue menstrual humano oferecem importantes vantagens, pois são obtidas por um procedimento simples, seguro e indolor e podem ser eficientemente expandidas in vitro. O sangue e tecidos desprendidos contêm uma população heterogênea de células incluindo algumas com capacidade regenerativa. Considerando o uso em potencial das células-tronco mesenquimais do sangue menstrual, o presente trabalho visa estabelecer o isolamento, o cultivo e a caracterização de células obtidas do sangue menstrual humano. Dados preliminares indicam que a células isoladas através do protocolo descrito neste trabalho correspondem imunofenotipicamente e funcionalmente a células-tronco mesenquimais (CTMs). Deste modo, uma nova fonte de CTMs poderá ser utilizada nas pesquisas do Instituto Carlos Chagas – Fiocruz-PR

Identificação de Micrornas associados aos Polissomos durante a diferenciação adipogênica das células-tronco derivadas do tecido adiposo

Submitted by Renata Fontoura ([email protected]) on 2014-11-26T16:24:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5)Approved for entry into archive by Renata Fontoura ([email protected]) on 2014-11-26T16:25:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5)Made available in DSpace on 2014-11-26T16:25:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) Previous issue date: 2014Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.Células-tronco (CT) são células autorrenováveis e não especializadas, com o potencial de diferenciação multidirecional. Células-tronco de tecido adiposo (CT-TA) são um tipo de células-tronco adultas multipotentes, de fácil isolamento e cultura. Nos últimos anos, CT-TA têm mostrado grande potencial para engenharia de tecidos e terapias baseadas em células. Apesar do interesse em aplicações clínicas deste tipo de célula, os mecanismos moleculares fundamentais a sua autorrenovação e diferenciação ainda não foram completamente elucidados. miRNAs são pequenos RNAs não-codificadores, com 21-25 nucleotídeos de comprimento, que tem se mostrado como importantes reguladores da expressão gênica em nível pós-transcricional. miRNAs podem atuar por meio de clivagem direta de mRNAs alvo ou através da repressão da tradução, dependendo da complementaridade entre o mRNA e a sequência do miRNA. Perfis de miRNAs de CT adultas sugerem que estes pequenos reguladores podem contribuir para as propriedades intrínsecas das CT. Para entender melhor os mecanismos de ação dos miRNAs em CT-TA, miRNAs associados ao polissomos de CT-TA foram isolados durante a diferenciação celular. Procurando miRNAs reguladores das etapas iniciais de diferenciação ou envolvidos na autorrenovação de CT, as culturas de células foram induzidas a diferenciação adipogênica durante 72 h. O lisado celular foi submetido à ultracentrifugação em gradiente de sacarose para separar monosomos, polissomos e fração livre de ribossomos. O RNA total associado aos ribossomos foi extraído, os fragmentos de RNA (<200 nt) foram enriquecidos e a seleção de tamanho de fragmentos de RNA apropriados ocorreu durante a preparação das amostras para o sequenciamento em larga escala. As amostras foram sequenciadas utilizando a plataforma SOLiD ™, e as frações polissomais de culturas Não Induzida e 72h de indução foram comparadas e dezesseis miRNAs foram identificados. miRNAs encontrados em um trabalho prévio do grupo foram adicionados a esses dados, e sete miRNAs (hsamiR-29b-1-5p, hsa- miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210- 5p e hsa-miR-6775- 5p) foram testados por RT-qPCR para confirmar a expressão diferencial, sendo que um deles (hsa-miR-210-5p) mostrou diferença estatisticamente significativa.Stem cells (SC) are self-renewing and non-specialized cells with the potential of multi-directional differentiation. Adipose Stem Cell (ADSC) is a type of multipotent adult stem cell, easy to isolate and culture. In the past few years, hADSCs have shown great potential for tissue engineering and cell-based therapies. Despite the interest in clinical applications of this kind of cell, the molecular mechanisms underlying their self-renewal and differentiation have yet to be fully elucidated. miRNAs are small noncoding RNAs, 21-25 nucleotides in length, that have been shown to be important regulators of posttranscriptional gene expression. miRNAs can act through direct cleavage of target mRNAs or through translational repression, depending of complementary pairing between the mRNA and miRNA sequence.miRNA profile of adult SCs suggests that these small regulators can contribute to the intrinsic properties of SCs. To better understand the mechanisms of action of miRNAs in hADSCs, we isolate miRNAs associated to polysomes of hADSC during cellular differentiation. Looking for miRNAs regulators of early steps of differentiation or involved in ADSC self-renewing, cell cultures were induced to adipogenic differentiation for 72 h. The cell lysate was submitted to ultracentrifugation on a sucrose gradient to separate monosomes, polysomes and the fraction free of ribosomes. The total RNA associated to ribosomes was extracted and the RNA fragments (<200 nt) were enriched and the size selection of appropriate RNA fragments occurred during the preparation of samples for deep sequencing. The samples were sequenced using SOLiD™ platform, and polysomal fraction of cell cultures non induced and 72h of induction were compared and sixteen miRNAs were identified. miRNAs found in a previous work of our group were added to these data and seven miRNAs (hsa-miR-29b-1-5p, hsa-miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210-5p e hsa-miR-6775-5p) were tested by RTqPCR to confirm differential expression, and one of them (hsa-miR-210-5p) showed statistical significant difference

Inhibition of Hedgehog signaling pathway affects the expression of miR-20a and miR-3

Submitted by Luciane Willcox ([email protected]) on 2016-09-19T16:28:28Z No. of bitstreams: 1 Inibição da via de sinalização Hedgehog.pdf: 1093460 bytes, checksum: 4a5d3de417f100e17c84b5b6a4f0e2cf (MD5)Approved for entry into archive by Luciane Willcox ([email protected]) on 2016-09-19T16:39:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Inibição da via de sinalização Hedgehog.pdf: 1093460 bytes, checksum: 4a5d3de417f100e17c84b5b6a4f0e2cf (MD5)Made available in DSpace on 2016-09-19T16:39:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Inibição da via de sinalização Hedgehog.pdf: 1093460 bytes, checksum: 4a5d3de417f100e17c84b5b6a4f0e2cf (MD5) Previous issue date: 2013-11Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-PR), Ministério da Saúde, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação Araucária.Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Laboratório de Biologia Básica de Células-Tronco. Curitiba, PR, Brasil.Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Laboratório de Biologia Básica de Células-Tronco. Curitiba, PR, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Laboratório de Biologia Básica de Células-Tronco. Curitiba, PR, Brasil.MicroRNAs são pequenas moléculas de RNA (~ 22 nucleotídeos), que atuam como reguladores pós-transcricional da expressão de genes, inibindo a tradução do RNA mensageiro. MicroRNAs estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos e patológicos, assim como a via de sinalização Hedgehog (Hh). Nós avaliamos a expressão de quatro microRNAs (miR-20a, miR-31, miR-17 e miR-199b5p) em células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sob ativação e bloqueio da via de sinalização Hh. As células foram tratadas com purmorfamina (ativador da via Hh) ou ciclopamina (bloqueador da via Hh) durante 24 horas. Extração de RNA e cDNA foram realizadas para fazer a analise da expressão dos miRNAs por RT-PCR quantitativa. O nível de expressão do miR-20a e miR-31 aumentou após o bloqueio da via de sinalização Hh, sendo assim, esses miRNAs podem estar envolvidos no controle da proliferação de células-tronco e câncer. O miR-20a e o miR-31 são fortes candidatos para biomarcadores da via Hh.MicroRNAs are small RNA molecules (~ 22 nucleotides) that act as post-transcriptional regulators of gene expression by inhibiting translation of messenger RNAs. MicroRNAs are involved in regulating many biological and pathological processes, as well as the Hedgehog (Hh) signaling pathway. We evaluate the expression of four miRNAs (miR-20a, miR-31, miR-17 and miR-199b5p) in human adipose-derived stem cells under activation and blockade of Hh signaling pathway. Cells were treated with purmorphamine (Hh activator) or cyclopamine (Hh blocker) for 24 hours. RNA extraction and cDNA were performed to analyze of miRNAs expression by quantitative RT-PCR. The expression level of miR-20a and miR-31 increased after blocking Hh signaling pathway, thus these miRNAs may be involved in control of proliferation in stem and cancer cells. MiR-20a and miR-31 are strong candidates for biomarkers of Hh pathway

Downregulation of the protein synthesis machinery is a major regulatory event during early adipogenic differentiation of human adipose-derived stromal cells

Commitment of adult stem cells involves the activation of specific gene networks regulated from transcription to protein synthesis. Here, we used ribosome profiling to identify mRNAs regulated at the translational level, through both differential association to polysomes and modulation of their translational rates. We observed that translational regulation during the differentiation of human adipose-derived stromal cells (hASCs, also known as adipose-derived mesenchymal stem cells), a subset of which are stem cells, to adipocytes was a major regulatory event. hASCs showed a significant reduction of whole protein synthesis after adipogenic induction and a downregulation of the expression and translational efficiency of ribosomal proteins. Additionally, focal adhesion and cytoskeletal proteins were downregulated at the translational level. This negative regulation of the essential biological functions of hASCs resulted in a reduction in cell size and the potential of hASCs to migrate. We analyzed whether the inactivation of key translation initiation factors was involved in this observed major repression of translation. We showed that there was an increase in the hypo phosphorylated forms of 4E-BP1, a negative regulator of translation, during early adipogenesis. Our results showed that extensive translational regulation occurred during the early stage of the adipogenic differentiation of hASCs