Patogenicidad de variantes genéticas nucleares con implicación en el metabolismo del RNA mitocondrial

Las enfermedades mitocondriales son un conjunto de desórdenes metabólicos y genéticos en que, sobre todo, se encuentra comprometida la fosforilación oxidativa de las mitocondrias. Además, se caracterizan por ser enfermedades muy heterogéneas desde un punto de vista clínico y genético, influyendo en esto último el hecho de que su etiología puede residir en variantes que ocurran tanto en el mtDNA como en el nDNA. La interpretación de la patogenicidad de una variante genética es un proceso complejo que requiere de la integración de los datos clínicos, análisis bioinformáticos y estudios moleculares. En la presente tesis doctoral se han analizado los fibroblastos de dos pacientes con variantes en genes nucleares que codifican para proteínas mitocondriales: un primer paciente con un cuadro clínico característico de una enfermedad mitocondrial y con las variantes p.A507S (cambio de sentido) y p.K562* (sin sentido) en PNPT1, encontradas en heterocigosis compuesta; un segundo paciente con una clínica que se aleja de la neuromuscular más característica de las enfermedades mitocondriales (presenta, sobre todo, una alteración del metabolismo serotoninérgico) y con la variante de novo p.Q346* (sin sentido) en TEFM, detectada en heterocigosis. PNPT1 codifica para la PNPasa, proteína que actúa en forma de homotrímero y que, junto a la helicasa SUV3, constituye el degradosoma, principal complejo implicado en la degradación de los mtRNA. Los experimentos llevados a cabo en células del paciente con las variantes en este gen han permitido concluir que dichas mutaciones son patológicas y que constituyen la etiología genética de su enfermedad, ya que derivan en un déficit de la PNPasa que provoca, en última instancia, una disfuncionalidad del sistema OXPHOS. Además, se ha obtenido que la sobreexpresión de PNPT1 es perjudicial para los fibroblastos primarios, si bien en los inmortalizados puede ser capaz de revertir el fenotipo patológico, y que una alteración en los niveles transcripcionales o proteicos de la PNPasa deriva en una regulación de dichos niveles de la helicasa SUV3. Finalmente, los resultados obtenidos han motivado la propuesta de un modelo por el que la PNPasa se encuentra localizada en la matriz mitocondrial, pero con la posibilidad de que pueda estar tanto en forma soluble como anclada por su N-terminal a la membrana interna de las mitocondrias. TEFM codifica para la proteína homónima, cuya principal función descrita hasta la fecha es la de elongar la transcripción mitocondrial mediante diversos mecanismos con los que apoya a POLRMT en su función, entre los que destacan el aumento de la procesividad de la RNA polimerasa y una función anti-terminadora de la transcripción en CSBII. Los ensayos realizados en células del paciente con la variante en este gen han llevado a concluir que ésta provoca una alteración de la fosforilación oxidativa y abren las puertas a la implicación de TEFM en los mecanismos que relacionan al sistema OXPHOS con los niveles de la serotonina. Además, se ha obtenido que la sobreexpresión de TEFM es tóxica para los fibroblastos, ya que produce una afectación generalizada de todos los parámetros evaluados. Entre ellos, destaca un descenso drástico de la proteína TFAM, unos primers R-loop de tamaño insuficiente para desempeñar su función en el inicio de la replicación y una gran afectación del sistema OXPHOS. Todos estos resultados, junto a los del propio paciente, especialmente al someter a los modelos celulares de estudio a estrés con EtBr, así como los publicados por otros autores, llevan a establecer que la función de TEFM es más compleja que la descrita hasta el momento y que se encuentra condicionada por sus niveles: actúa como un sensor que regula el metabolismo del mtDNA y mtRNA.<br /

Estudio de patogenicidad de la mutación c.1036C>T en el gen TEFM

La transcripción del mtDNA es uno de los procesos más importantes en la regulación de la biosíntesis del sistema OXPHOS y en el mantenimiento del mtDNA por estar conectada con la replicación del mismo. La RNA polimerasa mitocondrial humana (POLRMT) actúa como molécula central de la transcripción, que se divide en tres etapas: iniciación, elongación y terminación. Para que se produzca la elongación es necesario el factor de elongación de la transcripción (TEFM), que aumenta la procesividad de POLRMT y se encuentra codificado por el gen nuclear TEFM. En el presente trabajo se ha llevado a cabo un estudio de la mutación c.1036C>T en TEFM presente en el paciente 3304, que cursa con déficit serotoninérgico y disfunción hipotalámica, con el objetivo de determinar si es la responsable de la etiología de su enfermedad. Para ello, se ha analizado bioinformáticamente el carácter patológico de la mutación, se ha caracterizado el mtDNA del paciente y se ha valorado la existencia o ausencia de disfunción mitocondrial a nivel de producción de ATP, transcripción mitocondrial, cuantificación de subunidades del sistema OXPHOS y formación de complejos y supercomplejos respiratorios. Además, se ha aplicado un ensayo de complementación genética para analizar la recuperación de la función mitocondrial. La mutación c.1036C>T se predice como patológica, el paciente carece de mutaciones en su mtDNA y presenta una disfunción mitocondrial que podría estar relacionada con los síntomas de su enfermedad. Finalmente, la sobreexpresión de TEFM wt perjudica la funcionalidad mitocondrial de las células del paciente, imposibilitando la terapia génica como tratamiento

Caracterización del gen MAPT en modelos celulares para el estudio de la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro, formados por depósitos del péptido β-amiloide y la proteína tau hiperfosforilada, respectivamente. El origen de la enfermedad y las bases moleculares de la misma siguen en estudio, ámbito en el que desde nuestro grupo se ha establecido una hipótesis que relaciona al sistema OXPHOS, la síntesis de novo de pirimidinas y la EA. Para comprobar esta hipótesis es necesario investigar las bases moleculares de la enfermedad y para ello deben validarse modelos de estudio de forma previa. En el presente trabajo se ha llevado a cabo la validación de las líneas celulares hNSC, SH-SY5Y y SK-N-BE(2)-C como modelos adecuados a fin de diferenciarlas a neuronas colinérgicas y estudiar la proteína tau en ensayos posteriores. En concreto, se ha realizado la caracterización del gen MAPT (Microtubule-associated protein tau), codificante para la proteína tau, mediante el análisis de la expresión del gen y del ratio del grupo de isoformas 3R y 4R (establecidas por splicing alternativo del exón 10), así como la búsqueda de las 6 isoformas mayoritarias presentes en cerebro adulto humano y el estudio de las variaciones genéticas de MAPT. En las líneas SK-N-BE(2)-C y SH-SY5Y no se han encontrado variaciones en los transcritos secuenciados de MAPT y se ha observado un claro predominio de la isoforma fetal con respecto a las demás. Sin embargo, más ensayos son necesarios para validar la línea hNSC antes de su utilización, ya que sólo ha podido determinarse la mayor expresión de las isoformas 3R en esta línea celular

Molecular characterization of new FBXL4 mutations in patients with mtDNA depletion syndrome

Encephalomyopathic mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndrome 13 (MTDPS13) is a rare genetic disorder caused by defects in F-box leucine-rich repeat protein 4 (FBXL4). Although FBXL4 is essential for the bioenergetic homeostasis of the cell, the precise role of the protein remains unknown. In this study, we report two cases of unrelated patients presenting in the neonatal period with hyperlactacidemia and generalized hypotonia. Severe mtDNA depletion was detected in muscle biopsy in both patients. Genetic analysis showed one patient as having in compound heterozygosis a splice site variant c.858+5G>C and a missense variant c.1510T>C (p.Cys504Arg) in FBXL4. The second patient harbored a frameshift novel variant c.851delC (p.Pro284LeufsTer7) in homozygosis. To validate the pathogenicity of these variants, molecular and biochemical analyses were performed using skin-derived fibroblasts. We observed that the mtDNA depletion was less severe in fibroblasts than in muscle. Interestingly, the cells harboring a nonsense variant in homozygosis showed normal mtDNA copy number. Both patient fibroblasts, however, demonstrated reduced mitochondrial transcript quantity leading to diminished steady state levels of respiratory complex subunits, decreased respiratory complex IV (CIV) activity, and finally, low mitochondrial ATP levels. Both patients also revealed citrate synthase deficiency. Genetic complementation assays established that the deficient phenotype was rescued by the canonical version of FBXL4, confirming the pathological nature of the variants. Further analysis of fibroblasts allowed to establish that increased mitochondrial mass, mitochondrial fragmentation, and augmented autophagy are associated with FBXL4 deficiency in cells, but are probably secondary to a primary metabolic defect affecting oxidative phosphorylation

Método del caso: Ramón y la esclerosis múltiple. Aprendizaje del sistema nervioso en equipo

Nuestra sociedad está experimentando una serie de cambios en los últimos años que se ven reflejados en el alumnado de Secundaria y, por ende, afectan al proceso de enseñanza-aprendizaje. Este hecho, sumado a que abordar el estudio del sistema nervioso en 3º de la ESO es uno de los más complicados en la Biología y Geología de dicho nivel por los conceptos más complejos y abstractos que incluye, hace necesaria la aplicación de nuevas metodologías en las aulas para adaptarse a las necesidades de la sociedad actual y facilitar así el aprendizaje del sistema nervioso por parte de los alumnos. En este ámbito, en el presente TFM se expone una propuesta didáctica sobre dicho sistema biológico basada en la combinación del método tradicional de enseñanza con estrategias más innovadoras, como el caso práctico y los grupos cooperativos, y que ha sido elaborada a partir de la bibliografía consultada y de las enseñanzas recibidas desde el Máster en Profesorado, de las que se realiza además una reflexión y se presentan una serie de propuestas de mejora sobre las mismas y el propio Máster. En particular, con la propuesta didáctica se pretendía comprobar, especialmente, si tomar apuntes es un hábito instaurado en los alumnos de 3º de la ESO y si son capaces de relacionar conceptos impartidos de forma secuencial. Para ello, la propuesta se aplicó en dos grupos de 3º de la ESO del colegio Compañía de María de Zaragoza, obteniéndose que tanto la toma de apuntes como la integración de contenidos deben trabajarse más en las aulas con objeto de que se termine favoreciendo el proceso de enseñanza-aprendizaje del sistema nervioso