Long-Term Effects of Experimental Carotid Stenosis on Hippocampal Infarct Pathology, Neurons and Glia and Amelioration by Environmental Enrichment

Hippocampal atrophy and pathology are common in ageing-related disorders and associated with cognitive impairment and dementia. We explored whether environmental enrichment (EE) ameliorated the pathological sequelae in the hippocampus subsequent to chronic cerebral hypoperfusion induced by bilateral common carotid artery stenosis (BCAS). Seventy-four male C57BL/6 J mice underwent BCAS or sham surgery. One-week after surgery, mice were exposed to three different degrees of EE; either standard housing conditions (std), limited 3-hour exposure to EE per day (3h) or full-time exposure to EE (full) for 3 months. Four months after surgery, the hippocampus was examined for the extent of vascular brain injury and neuronal and glial changes. Results showed that long-term BCAS induced strokes, most often in CA1 subfield, reduced 40-50% CA1 neurons (P<0.01) and increased microglia/macrophage in CA1-CA3 subfields (P<0.02). Remarkably, both 3h and full-time EE regimes attenuated hippocampal neuronal death and repressed recurrent strokes with complete prevention of larger infarcts in mice on full-time EE (P<0.01). Full-time EE also reduced astrocytic clasmatodendrosis and microglial/macrophage activation in all CA subfields. Our results suggest that exposure to EE differentially reduces long-term hypoperfusive hippocampal damage. The implementation of even limited EE may be beneficial for patients diagnosed with vascular cognitive impairment

Caracterización farmacológica y modulación de los canales de calcio voltaje-dependientes de terminales sinápticos

El Ca²+ juega un papel preponderante en la regulación de numerosos procesos celulares tales como el acoplamiento excitatorio-contráctil, la secreción hormonal, la expresión de genes y la proliferación celular. Además, en la neuronas, el Ca²+ que entra a través de los canales de Ca²+ voltaje-dependientes (CCVD) participa en la transmisión sináptica como una señal intracelular que dispara el proceso de liberación de neurotransmisor en respuesta a la despolarización de la membrana. Así, entre todos los procesos celulares en los que participa el Ca²+ en el sistema nervioso, el papel que cumple en la exocitosis es, sin lugar a dudas, uno de los más prominentes. Los canales de Ca²+ voltaje-dependientes (CCVD) conforman una de las familias de canales iónicos más heterogéneas. Muy probablemente, esta característica refleja la gran diversidad de procesos celulares en los que participan. De acuerdo a sus propiedades de activación, los CCVD han sido divididos en dos clases: los canales que se activan por pequeñas despolarizaciones (low voltage activated, LVA) y los canales que requieren grandes despolarizaciones para su activación (high voltage activated, HVA). Entre los HVA, han sido descriptos al menos tres tipos de canales de Ca²+: los CCVD de tipo L, los de tipo N y los canales de tipo P/Q, distinguidos por su sensibilidad a bloqueantes. Los CCVD de tipo L son sensibles a las dihidropiridinas, compuestos que pueden actuar como antagonistas o agonistas; los de tipo N son canales bloqueados por la toxina w-CgTx GVIA, y los de tipo P/Q son inhibidos por las toxinas w-AgaIVA y FTX. Uno de los objetivos de este trabajo es la caracterización farmacológica de los CCVD en los terminales sinápticos del cerebro de dos especies de vertebrados, el pollo y la rata. En el primer capítulo se determina la sensibilidad a los distintos bloqueantes que presenta el influjo de Ca²+ voltaje-dependiente en sinaptosomas de cerebro anterior de pollo y corteza frontal de rata. En los terminales sinápticos de corteza frontal de rata, los CCVD que median la entrada de Ca²+ inducida por despolarización ([K]c= 40 mM) son de alto umbral de activación y sensibles a w-AgaIVA, FTX y altas concentraciones de w-CgTx MVIID, características de los CCVD de tipo P/Q. Contrariamente, el influjo de Ca²+ voltaje-dependiente en los terminales nerviosos del cerebro anterior del pollo es mediado por CCVD de alto umbral de activación sensibles a w-CgTx GVIA. Sin embargo, este proceso también es bloqueado, aunque parcialmente, por FTX, w-AgaIVA y w-CgTx MVIID. Estos resultados presentan evidencias de la existencia, en los terminales sinápticos del cerebro anterior del pollo, de un canal de Ca²+ con características farmacológicas no descriptas anteriormente. Por otro lado, los CCVD son componentes de membrana altamente regulados y, como consecuencia de la modulación de su actividad, los procesos que dependen de la entrada de Ca²+ a través de los mismos puede ser ajustados de manera muy precisa. Otro objetivo de este trabajo es el estudio de la modulación de la actividad de los CCVD de los terminales sinápticos. En el capítulo 2 se determinan los posibles cambios en las propiedades del influjo de Ca²+ a través de los CCVD en los terminales nerviosos aislados a partir de corteza frontal de rata, producidos como consecuencia del tratamiento de los animales con el ácido 3-mercaptopropiónico (MP), una droga convulsivante que provoca una generalizada hiperactividad neuronal. Los animales fueron sometidos a dos tratamientos distintos con MP: tratamiento agudo (1 dosis MP 150 mg/kg) y tratamiento crónico (1 dosis MP 35 mg/kg cada 24 horas, durante 3 días) y estudiados en los periodos de convulsión o postconvulsión. Las propiedades farmacológicas de los CCVD que participan del influjo de Ca²+ a los terminales sinápticos no son modificadas como consecuencia del tratamiento agudo ni del tratamiento crónico con MP. Más aún, tampoco es afectada significativamente la dependencia de la captación de Ca²+ con la concentración extracelular de KCl en los animales tratados con MP, lo que podría sugerir que las características de activación de los CCVD tampoco son alteradas por el tratamiento. En el estudio desarrollado en el capítulo 3, se determina el efecto modulador del péptido atrial natriurético (ANP) sobre la actividad de los CCVD de los terminales sinápticos de hipotálamo de rata. ANP, además ser liberado por los miocitos atriales en respuesta al estiramiento de la pared del atrio, es sintetizado y liberado en el sistema nervioso central, en particular, en el hipotálamo. En este trabajo se analiza el efecto del ANP sobre la entrada de Ca²+ a los terminales nerviosos aislados de hipotálamo de rata. ANP inhibe potentemente y de manera dependiente de la concentración la entrada de Ca²+ voltaje-dependiente (IC50= 2 nM). Este proceso es también bloqueado por la toxina w-Aga IVA, indicando que los CCVD involucrados en el influjo de Ca²+ a los terminales de hipotálamo podrían pertenecer a los tipo P/Q. Por otro lado, otro péptido de la familia de los factores natriuréticos, el péptido natriurético tipo C, no afecta el influjo de Ca²+ en esta preparación, lo que sugiere la especificidad de la acción de ANP. En este trabajo tesis se identifican las propiedades farmacológicas de los CCVD de terminales sinápticos del SNC del pollo y la rata, y de esta manera, los resultados aportan a la comprensión de los componentes involucrados en la transmisión sináptica en el SNC de vertebrados. Por otro lado, este estudio proveen evidencias del papel modulador del péptido atrial natriurético sobre la actividad de los CCVD de los terminales sinápticos de hipotálamo de rata. Estos resultados podrían facilitar la comprensión de los efectos fisiológicos de ANP sobre el sistema nerviosos central y de los mecanismos involucrados en el control de la volemia y la presión arterial.Fil:Alvarez Maubecin, Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Atrial natriuretic factor (ANF) effects on L-, N-, and P/Q-type voltage-operated calcium channels

1. We have previously reported that atrial natriuretic factor (ANF) decreases neuronal norepinephrine (NE) release. The mechanism that mediates NE release from presynaptic membrane to synaptic cleft is a strongly calcium-dependent process. The modulator effect of ANF may be related to modifications in calcium influx at the presynaptic nerve ending by interaction with voltage-operated calcium channels (VOCCs). 2. On this basis we investigated the effects of ANF on K+-induced 45Ca2+ uptake and evoked neuronal NE release in the presence of specific L-, N-, and P/Q-type calcium channel blockers in the rat hypothalamus. 3. Results showed that ANF inhibited K+-induced 45Ca2+ uptake in a concentration-dependent fashion. Concentration-response curves to VOCC blockers nifedipine (NFD, L-type channel blocker), ω̄-conotoxin GVIA (CTX, N-type channel blocker), and ω̄-agatoxin IVA (AGA, P/Q-type channel blocker) showed that all the blockers decreased NE release. Incubation of ANF plus NFD showed an additive effect as compared to NFD or ANF alone. However, when the hypothalamic tissue was incubated in the presence of ANF plus CTX or AGA there were no differences in neuronal NE release as compared to calcium channel blockers or ANF alone. 4. These results suggest that ANF decreases NE release by an L-type calcium channel independent mechanism by inhibiting N- and/or P/Q-type calcium channels at the neuronal presynaptic level. Thus. ANF modulates neuronal NE release through different mechanisms involving presynaptic calcium channel inhibition.Fil: Rodríguez Fermepin, Martin. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Fisiopatología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Alvarez Maubecin, Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Zarrabeitía, Valeria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Fisiología Humana; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bianciotti, Liliana Graciela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Fisiopatología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Vatta, Marcelo Sergio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Fisiología Humana; ArgentinaFil: Fernandez, Belisario Enrique. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Fisiopatología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Reorganization of gap junctions after focused ultrasound blood–brain barrier opening in the rat brain

Ultrasound-induced opening of the blood–brain barrier (BBB) is an emerging technique for targeted drug delivery to the central nervous system. Gap junctions allow transfer of information between adjacent cells and are responsible for tissue homeostasis. We examined the effect of ultrasound-induced BBB opening on the structure of gap junctions in cortical neurons, expressing Connexin 36, and astrocytes, expressing Connexin 43, after focused 1-MHz ultrasound exposure at 1.25 MPa of one hemisphere together with intravenous microbubble (Optison, Oslo, Norway) application. Quantification of immunofluorescence signals revealed that, compared with noninsonicated hemispheres, small-sized Connexin 43 and 36 gap-junctional plaques were markedly reduced in areas with BBB breakdown after 3 to 6 hours (34.02±6.04% versus 66.49±2.16%, P=0.02 for Connexin 43; 33.80±1.24% versus 36.77±3.43%, P=0.07 for Connexin 36). Complementing this finding, we found significant increases in large-sized gap-junctional plaques (5.76±0.96% versus 1.02±0.84%, P=0.05 for Connexin 43; 5.62±0.22% versus 4.65±0.80%, P=0.02 for Connexin 36). This effect was reversible at 24 hours after ultrasound exposure. Western blot analyses did not show any change in the total connexin amount. These results indicate that ultrasound-induced BBB opening leads to a reorganization of gap-junctional plaques in both neurons and astrocytes. The plaque-size increase may be a cellular response to imbalances in extracellular homeostasis after BBB leakage