Human case of autochthonous West Nile virus lineage 2 infection in Italy, September 2011.

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Molecular analysis of hepatitis B virus (HBV) in an HIV co-infected patient with reactivation of occult HBV infection following discontinuation of lamivudine-including antiretroviral therapy

Abstract Background Occult hepatitis B virus (HBV) infection (OBI) is characterized by HBV DNA persistence even though the pattern of serological markers indicates an otherwise resolved HBV infection. Although OBI is usually clinically silent, immunocompromised patients may experience reactivation of the liver disease. Case presentation We report the case of an individual with human immunodeficiency virus (HIV) infection and anti-HBV core antibody positivity, who experienced severe HBV reactivation after discontinuation of lamivudine-including antiretroviral therapy (ART). HBV sequencing analysis showed a hepatitis B surface antigen escape mutant whose presence in an earlier sample excluded reinfection. Molecular sequencing showed some differences between two isolates collected at a 9-year interval, indicating HBV evolution. Resumption of ART containing an emtricitabine/tenofovir combination allowed control of plasma HBV DNA, which fell to undetectable levels. Conclusion This case stresses the ability of HBV to evolve continuously, even during occult infection, and the effectiveness of ART in controlling OBI reactivation in HIV-infected individuals.</p

Identificazione del corecettore utilizzato da HIV per l'ingresso nella cellula: confronto tra saggio fenotipico in vitro e fenotipo virtuale

OBIETTIVI: L’introduzione nella pratica clinica degli antagonisti del CCR5 come nuova classe di inibitori dell’entry ha determinato la necessità di conoscere il coreceptor usage del virus prima di iniziare la terapia. Molti clinici ottengono questa informazione utilizzando il test Trofile nell’ ultima versione ultrasensibile (ESTA).Il largo utilizzo di questo saggio è limitato da alti costi e da lunghi tempi di attesa per la risposta. Sono perciò stati fatti numerosi sforzi per ottenere risultati in minor tempo possibile e con bassi costi migliorando i test genotipici che prevedono l’utilizzo di algoritmi interpretativi. A causa dell’elevata variabilità del gene env i saggi genotipici sono tuttavia inaffidabili mentre i saggi biologici sono quasi sempre in grado di definire il tropismo attuale. A tal fine abbiamo messo a punto un vettore di espressione fluorescente che si caratterizza per consentire il clonaggio delle sequenze V3 amplificate dal paziente di interesse. Questo plasmide è dotato di un gene per la proteina fluorescente GFP che viene espressa quando il virus replica nelle cellule, è pertanto possibile conoscere sia il fenotipo conferito da quella specifica sequenza V3 che la capacità replicativa della variante V3 attraverso l’analisi fluorimetrica delle cellule dopo un saggio di transfezionne-infezione. Obiettivo di questo lavoro è confrontare il saggio fenotipico home-brew con il saggio commerciale Trofile nella sua forma più sensibile l’Enhanced Trofile (ESTA) e conseguire una valutazione comparativa tra i diversi saggi fenotipici e tra i saggi fenotipici e saggi virtuali nella definizione del coreceptor usage. MATERIALI E METODI: E’ stata utilizzata una strategia molecolare ricombinante che ha permesso di clonare in pNLmodΔV3GFP la sequenza V3 amplificata dal virus di 38 pazienti analizzati generando chimere virali replicative. La regione V3 delle varianti virali è stata sequenziata e analizzata al geno2pheno, al fine di ottenere la predizione del fenotipo. E’ importante determinare il livello di significatività, cioè di selezionare quanto conservativa è la determinazione del virus X4, questo livello di significatività è determinato dal tasso di falsa positività per la classificazione di un virus X4. Questo tasso detto FPR (False Positive Rate) è un cut off, una soglia al di sopra della quale i virus sono definiti R5 e al di sotto X4. Attualmente l’FPR utilizzato dalla comunità scientifica è del 10%; questo valore sembra raggiungere un buon compromesso tra sensibilità e specificità. RISULTATI: sono stati ottenuti 117 cloni dal plasma di 38 pazienti HIV-1 positivi, il saggio ricombinante home brew ha identificato 90 cloni con fenotipo R5 corrispondenti a 28 pazienti, 20 cloni con fenotipo D/M corrispondenti a 9 pazienti e tutte le chimere virali ottenute da 1 paziente sono risultate essere non replicative (risultato DM con ESTA). Il saggio ESTA ha identificato 25 pazienti con fenotipo R5, 9 pazienti con fenotipo D/M e 4 NR (due di questi sono risultai D/M e uno R5 con il nostro saggio). CONCLUSIONI: il saggio fenotipico home brew descritto si mostra più sensibile del saggio ESTA ed inoltre offre la possibilità di analizzare la quasi specie virale del paziente consentendo di studiare l’influenza che ogni residuo aminoacidico della regione V3 ha sul fenotipo. I nostri risultati mostrano che il 33% delle sequenze V3 clonate identificate come X4 dall’algoritmo geno2pheno quando inserite nel backbone di NL 4-3 conferiscono alla chimera virale un fenotipo R5. Il livello di FPR dovrebbe pertanto essere scelto con molta attenzione

Genotype and Phenotype Patterns of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Resistance to Enfuvirtide during Long-Term Treatment

The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) fusion inhibitor enfuvirtide has recently been introduced into clinical practice and has exhibited efficient anti-HIV-1 activity in combination with other antiretroviral agents. In the present study, we addressed the effect of long-term treatment with enfuvirtide on the intrahost evolution of HIV-1. The genotype and phenotype patterns and the relative replication capacity (rRC) of enfuvirtide-resistant HIV-1 mutants were evaluated in samples from 11 subjects (7 virological nonresponders and 4 responders) who received the compound for more than 1 year in combination with different regimens. Selection of one or more mutations clustering in a sequence (amino acids 36 to 45) of the gp41 N-terminal heptad repeat was observed in samples from the seven virological nonresponders but not in those from responders. In two subjects who discontinued enfuvirtide, reversion of the resistant genotype was detected within 3 months. Recombinant clones bearing mutated gp41 sequences displayed reduced susceptibilities to enfuvirtide, with the 50% inhibitory concentrations (IC(50)s) ranging from 0.6 to 12.8 μg/ml, whereas the IC(50) for isolates with baseline sequences was 0.013 ± 0.010 μg/ml. Interestingly, long-term monitoring of resistant variants provided evidence that ongoing adaptation to the drug is paralleled by phenotypic changes. A limited drop in the rRC in the absence of drug was observed for clones from four of the seven nonresponders bearing mutations associated with resistance. Overall, the data indicate that the different genotype patterns associated with a detectable degree of HIV-1 resistance to enfuvirtide generated during long-term treatments are characterized by a substantially low genetic barrier, possible ongoing adaptation with increased degrees of resistance, and limited influence on the viral rRC