Vaccinia-related kinase 1 is required for early uterine development in Caenorhabditis elegans

Protein kinases regulate a multitude of processes by reversible phosphorylation of target molecules. Induction of cell proliferation and differentiation are fundamental to development and rely on tightly controlled kinase activities. Vaccinia-Related Kinases (VRKs) have emerged as a multifunctional family of kinases with essential functions conserved, from nematodes and fruit flies, to humans. VRK substrates include chromatin and transcription factors, whereas deregulation of VRKs is implicated in sterility, cancer and neurological defects. In contrast to previous observations, we describe here that Caenorhabditis elegans VRK-1 is expressed in all cell types, including proliferating and post-mitotic cells. Despite the ubiquitous expression pattern, we find that vrk-1 mutants are particularly impaired in uterine development. Our data show that VRK-1 is required for uterine cell proliferation and differentiation. Moreover, the anchor cell, a specialized uterine cell, fails to fuse with neighboring cells to form the utse syncytium in vrk-1 mutants, thus providing further insight on the role of VRKs in organogenesis.We gratefully acknowledge funding from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (BFU2013-42709P), the Autonomous Government of Andalusia (P08-CVI-3920) and the European Regional Development Fund to P.A. and a postdoctoral contract from the Autonomous Government of Andalusia to A.D.Peer reviewe

Protein kinase VRK1 and its role in cell proliferation and differentiation

Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología QuímicaCaenorhabditis elegans es un nematodo pequeño que se alimenta de microorganismos, es transparente y fácil y barato para cultivar en el laboratorio. Además, su naturaleza hermafrodita, un ciclo de vida rápido, posibilidad de congelación y recuperación de los nematodos viables facilitan muchas manipulaciones genéticas. Por estas ventajas se utiliza como un sistema modelo en casi todas las áreas de la biología célullar, neurobiología y desarrollo. La elucidación de la organogénesis es importante para la comprensión del desarrollo de los organismos multicelulares. La vulva de un adulto hermafrodita sirve como un pasillo que conecta el útero con el ambiente externo y su desarrollo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos que subyacen a la especificación del destino celular y las vías de señalización intercelular (Sternberg,2005). Durante el estadio larvario L3 una célula especializada de la gónada llamada célula ancla (AC), induce el desarrollo de la vulva mediante la secreción de la proteína LIN-3, un ligando del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a los precursores celulares de la vulva (VPC) subyacentes, llamados P3.p-P8.p para adoptar los destinos vulvares (Hill and Sternberg, 1992). El nivel mas alto de LIN-31o recibe P6.p para adoptar 1¿destino celular y activar el LIN-12 (Notch) en PS.p y P7.p y adoptar el 2¿ destino celular (Sternberg, 1988). Los tres restantes VPCs (P3.p , P4.p y P8.p) que no reciben el señal inductiva ni las señales laterales adoptan el 3¿ destino celular, se dividen una vez y se fusionan con la hipodermis (hyp7). Después de tres rondas de divisiones celulares durante los estadios larvarios L3 y L4 se generan 22 células de la vulva de siete tipos diferentes que se invaginan y fusionan para formar siete anillos toroidales diferentes, se conectan al útero y emergen durante la última muda para formar la vulva madura del hermafrodita. La AC desempeña un papel crucial no sólo durante el desarrollo de la vulva, sino también en la morfogénesis uterina. Después de la inducción de tres VPCs para adoptar sus destinos vulvares, la AC señala, a través de LAG-2 y su receptor LIN-12, a seis de los doce descendientes de las células ventrales del útero (VU) a adoptar el destino celular ¿. Durante el estadio larvario L4, ocho células ¿ fusionan con la AC y forman el sinsitio llamado utse. La fosforilación de proteínas por parte de quinasas es una modificación postraduccional que juega un papel importante en procesos biológicos numerosos. Se estima que aproximadamente el30% de las proteínas intracelulares se fosforila de forma reversible (Cohen, 2000), lo que hace que las proteínas quinasas sean reguladores clave de procesos biológicos incluyendo la transducción de la señal, la transcripción, la progresión del ciclo celular, el crecimiento, la diferenciación y la apoptosis. La familia de quinasas humanas Vaccinia Related Kinases, VRKs, está constituida por tres miembros proteínas, VRK1 ¿ 3, de los cuales sólo VRK1 y VRK2 son cataliticamente activos (Nichols and Traktman, 2004). En Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster hay sólo un ortólogo (VRK-1 y NHK-1, respectivamente). No hay ortólogos de las VRKs identificados en la levadura. VRK1 humana es el miembro más estudiado de la familia de VRK. Experimentos en diferentes organismos han demostrado que VRK1 fosforila varios factores de transcripción (p53, c-Jun y ATF2) y proteínas asociadas a la cromatina (histonas H2A y H3, BAF1) (Kierkx et al., 2009b). VRK1 regula la progresión del ciclo celular y juega un papel importante en la dinámica de la envoltura nuclear (Gorjanacz et al., 2007;Nichols et al., 2006). En los mamíferos, la pérdida de VRK1 conduce a la esterilidad y puede causar trastornos neurológicos (Renbaum et al., 2009; Wiebe et al., 2010). Además, la expresión de VRK1 se correlaciona con la progresión de ciertos tipos de cáncer (Santos et al., 2006). Los estudios realizados en nuestro laboratorio utilizando los nematodos C. elegans como organismo modelo han demostrado que VRK1 juega un papel critico en el desarrollo de órganos, así como en la proliferación de células germinales y divisiones mitóticas durante la embriogénesis temprana (Gorjanacz et al.,2007; Klerkx et al., 2009a). Sin embargo, poco se sabe acerca de la dinámica de VRK1, su regulación y sus sustratos durante el desarrollo. Los objetivos de mi tesis doctoral han sido situar a VRK-1 dentro del contexto del desarrollo de órganos de C. elegans, caracterizar la dinámica de la localización de VRK-1 tanto en C. elegans como en las células humanas e identificar nuevos sustratos de esta quinasa. La primera parte de mi tesis se concentra en la caracterización de la localización y la movilidad de VRK1 tanto en C. elegans como en las células humanas. Con el fin de caracterizar la dinámica de VRK1 y garantizar los niveles de expresión uniformes hemos utilizado los sistemas MosSCI y Flp-ln para generar nuevas cepas transgénicas de C. elegans y líneas celulares humanas, que expresan solo una copia de los transgenes. Hemos observado que las nuevas cepas muestran la expresión de VRK-1 no sólo en las células previamente reportadas (neuronas, células hipodérmica y células precursoras de la vulva), sino también en las celulas del utero y la célula ancla. Ademas, hemos observado que VRK1 humano es nuclear durante la interfase y en mitosis se asocia con los cromosomas condensados, igual a lo descrito para los embriones de C. elegans (Gorjanacz et al., 2007). Por otra parte, una mutagénesis dirigida a tres argininas conservadas en la región carboxyl terminal identificó un nuevo motivo conservado, responsable de la localización de VRK1 en cromatina durante la mitosis. La recuperación de fluorescencia posterior al foto-blanqueamiento (FRAP) sugiere una asociación transitoria de VRK1 con la cromatina. Se observaron cinéticas idénticas en interfase y en la mitosis, lo que sugiere que VRK1 puede interactuar con las mismas proteínas de la cromatina durante todo el ciclo celular. La segunda parte de mi tesis se concentra en la relación entre VRK1 y las vías de señalización implicadas en el desarrollo de C. elegans. Durante el desarrollo de la vulva la AC se fusiona con células uterinas para formar el utse. Los defectos en la formación de utse producen un fenotipo conocido como vulva protuberante (Pvl). Hemos demostrado que la AC no se fusiona en los mutantes de vrk-1, muy probablemente debido a la pérdida de VRK-1 en el tejido uterino,lo cúal, esta perdida se caracteriza por defectos en la proliferación y la diferenciación en las células uterinas. La tercera parte de esta tesis se centra en la identificación de las proteínas que interaccionan con VRK1. Hemos expresado y purificado VRK1 de células humanas asincrónicas y mitóticas, seguido por espectrometría de masas de alta resolución. Algunos de los principales candidatos identificados fueron miembros del complejo de pasajeros cromosómica (CPC) - Aurora B, Borealin y survivin. Experimentos en curso servirán para confirmar la interacción de VRK1 con el CPC. En conclusión, en esta tesis hemos destapado nuevos dominios reguladores de la proteína quinasa VRK1 y proteínas que interaccionan con VRK1. Estos resultados son importantes para comprender las actividades moleculares de esta quinasa, que está vinculada a la organogénesis, así como a los cánceres humanos y a trastornos neurológicos.Universidad Pablo de Olavide. Centro de Estudios de PostgradoCentro Andaluz de Biología del Desarroll

Protein kinase VRK1 and its role in cell proliferation and differentiation

Tesis Doctoral presentada por la licenciada
 Agnieszka
 Dobrzynska para
 optar
 al
 grado
 de 
Doctor 
por
 la
 Universidad 
Pablo de
 Olavide y realizada en el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), centro mixto del CSIC.-- Excepto si se señala otra cosa, la licencia del ítem se describe como Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 España.Caenorhabditis elegans es un nematodo pequeño que se alimenta de microorganismos, es transparente y fácil y barato para cultivar en el laboratorio. Además, su naturaleza hermafrodita, un ciclo de vida rápido, posibilidad de congelación y recuperación de los nematodos viables facilitan muchas manipulaciones genéticas. Por estas ventajas se utiliza como un sistema modelo en casi todas las áreas de la biología célullar, neurobiología y desarrollo. La elucidación de la organogénesis es importante para la comprensión del desarrollo de los organismos multicelulares. La vulva de un adulto hermafrodita sirve como un pasillo que conecta el útero con el ambiente externo y su desarrollo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos que subyacen a la especificación del destino celular y las vías de señalización intercelular (Sternberg,2005). Durante el estadio larvario L3 una célula especializada de la gónada llamada célula ancla (AC), induce el desarrollo de la vulva mediante la secreción de la proteína LIN-3, un ligando del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a los precursores celulares de la vulva (VPC) subyacentes, llamados P3.p-P8.p para adoptar los destinos vulvares (Hill and Sternberg, 1992). El nivel mas alto de LIN-31o recibe P6.p para adoptar 1º destino celular y activar el LIN-12 (Notch) en PS.p y P7.p y adoptar el 2º destino celular (Sternberg, 1988). Los tres restantes VPCs (P3.p , P4.p y P8.p) que no reciben el señal inductiva ni las señales laterales adoptan el 3º destino celular, se dividen una vez y se fusionan con la hipodermis (hyp7). Después de tres rondas de divisiones celulares durante los estadios larvarios L3 y L4 se generan 22 células de la vulva de siete tipos diferentes que se invaginan y fusionan para formar siete anillos toroidales diferentes, se conectan al útero y emergen durante la última muda para formar la vulva madura del hermafrodita. La AC desempeña un papel crucial no sólo durante el desarrollo de la vulva, sino también en la morfogénesis uterina. Después de la inducción de tres VPCs para adoptar sus destinos vulvares, la AC señala, a través de LAG-2 y su receptor LIN-12, a seis de los doce descendientes de las células ventrales del útero (VU) a adoptar el destino celular π
. Durante el estadio larvario L4, ocho células π
 fusionan con la AC y forman el sinsitio llamado utse. La fosforilación de proteínas por parte de quinasas es una modificación postraduccional que juega un papel importante en procesos biológicos numerosos. Se estima que aproximadamente el 30% de las proteínas intracelulares se fosforila de forma reversible (Cohen, 2000), lo que hace que las proteínas quinasas sean reguladores clave de procesos biológicos incluyendo la transducción de la señal, la transcripción, la progresión del ciclo celular, el crecimiento, la diferenciación y la apoptosis. La familia de quinasas humanas Vaccinia Related Kinases, VRKs, está constituida por tres miembros proteínas, VRK1 - 3,de los cuales sólo VRK1 y VRK2 son cataliticamente activos (Nichols and Traktman, 2004). En Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster hay sólo un ortólogo (VRK-1 y NHK-1, respectivamente). No hay ortólogos de las VRKs identificados en la levadura. VRK1 humana es el miembro más estudiado de la familia de VRK. Experimentos en diferentes organismos han demostrado que VRK1 fosforila varios factores de transcripción (p53, c-Jun y ATF2) y proteínas asociadas a la cromatina (histonas H2A y H3, BAF1) (Kierkx et al., 2009b). VRK1 regula la progresión del ciclo celular y juega un papel importante en la dinámica de la envoltura nuclear (Gorjanacz et al., 2007;Nichols et al., 2006). En los mamíferos, la pérdida de VRK1 conduce a la esterilidad y puede causar trastornos neurológicos (Renbaum et al., 2009; Wiebe et al., 2010). Además, la expresión de VRK1 se correlaciona con la progresión de ciertos tipos de cáncer (Santos et al., 2006). Los estudios realizados en nuestro laboratorio utilizando los nematodos C. elegans como organismo modelo han demostrado que VRK1 juega un papel critico en el desarrollo de órganos, así como en la proliferación de células germinales y divisiones mitóticas durante la embriogénesis temprana (Gorjanacz et al.,2007; Klerkx et al., 2009a). Sin embargo, poco se sabe acerca de la dinámica de VRK1, su regulación y sus sustratos durante el desarrollo. Los objetivos de mi tesis doctoral han sido situar a VRK-1 dentro del contexto del desarrollo de órganos de C. elegans, caracterizar la dinámica de la localización de VRK-1 tanto en C. elegans como en las células humanas e identificar nuevos sustratos de esta quinasa.La primera parte de mi tesis se concentra en la caracterización de la localización y la movilidad de VRK1 tanto en se centra C. elegans como en las células humanas. Con el fin de caracterizar la dinámica de VRK1 y garantizar los niveles de expresión uniformes hemos utilizado los sistemas MosSCI y Flp-ln para generar nuevas cepas transgénicas de C. elegans y líneas celulares humanas, que expresan solo una copia de los transgenes. Hemos observado que las nuevas cepas muestran la expresión de VRK-1 no sólo en las células previamente reportadas (neuronas, células hipodérmica y células precursoras de la vulva), sino también en las celulas del utero y la célula ancla. Ademas, hemos observado que VRK1 humano es nuclear durante la interfase y en mitosis se asocia con los cromosomas condensados, igual a lo descrito para los embriones de C. elegans (Gorjanacz et al., 2007). Por otra parte, una mutagénesis dirigida a tres argininas conservadas en la región carboxyl terminal identificó un nuevo motivo conservado, responsable de la localización de VRK1 en cromatina durante la mitosis. La recuperación de fluorescencia posterior al foto-blanqueamiento (FRAP) sugiere una asociación transitoria de VRK1 con la cromatina. Se observaron cinéticas idénticas en interfase y en la mitosis, lo que sugiere que VRK1 puede interactuar con las mismas proteínas de la cromatina durante todo el ciclo celular. La segunda parte de mi tesis se concentra en la relación entre VRK1 y las vías de señalización implicadas en el desarrollo de C. elegans. Durante el desarrollo de la vulva la AC se fusiona con células uterinas para formar el utse. Los defectos en la formación de utse producen un fenotipo conocido como vulva protuberante (Pvl). Hemos demostrado que la AC no se fusiona en los mutantes de vrk-1, muy probablemente debido a la pérdida de VRK-1 en el tejido uterino,lo cúal, esta perdida se caracteriza por defectos en la proliferación y la diferenciación en las células uterinas. La tercera parte de esta tesisen la identificación de las proteínas que interaccionan con VRK1. Hemos expresado y purificado VRK1 de células humanas asincrónicas y mitóticas, seguido por espectrometría de masas de alta resolución. Algunos de los principales candidatos identificados fueron miembros del complejo de pasajeros cromosómica (CPC) - Aurora B, Borealin y survivin. Experimentos en curso servirán para confirmar la interacción de VRK1 con el CPC. En conclusión, en esta tesis hemos destapado nuevos dominios reguladores de la proteína quinasa VRK1 y proteínas que interaccionan con VRK1. Estos resultados son importantes para comprender las actividades moleculares de esta quinasa, que está vinculada a la organogénesis, así como a los cánceres humanos y a trastornos neurológicos.Peer Reviewe

Nuclear organization in stress and aging

This article belongs to the Special Issue Nuclear Organisation.The eukaryotic nucleus controls most cellular processes. It is isolated from the cytoplasm by the nuclear envelope, which plays a prominent role in the structural organization of the cell, including nucleocytoplasmic communication, chromatin positioning, and gene expression. Alterations in nuclear composition and function are eminently pronounced upon stress and during premature and physiological aging. These alterations are often accompanied by epigenetic changes in histone modifications. We review, here, the role of nuclear envelope proteins and histone modifiers in the 3-dimensional organization of the genome and the implications for gene expression. In particular, we focus on the nuclear lamins and the chromatin-associated protein BAF, which are linked to Hutchinson–Gilford and Nestor–Guillermo progeria syndromes, respectively. We also discuss alterations in nuclear organization and the epigenetic landscapes during normal aging and various stress conditions, ranging from yeast to humans.Work in the M.A.-S. and P.A. laboratories is funded by the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (BFU2016-79313-P to P.A. & MDM-2016-0687 to P.A. and M.A.-S.), the European Research Council (ERC-2011-StG-281691 to M.A.-S.) and the European Regional Development Fund.Peer reviewe

Supercritical carbon dioxide hops extracts with antimicrobial properties

Extracts obtained from hops (Humulus lupulus L., Cannabaceae) by supercritical fluid extraction (SFE), SFE followed by isomerization, as well as by conventional technique, were investigated for their chemical composition and antibacterial activity against selected foodborne pathogens and microorganisms capable to cause the food spoilage. The antibacterial activity of the extracts was compared with the antibacterial activity of xanthohumol, compound known for its broad pharmacological properties, isolated from the raw material remained after the SFE. Xanthohumol (XH, 96%) proved to posses the most prominent activity against all the tested strains, with the MIC values ranged between 2.5 and 20 mu g mL(-1). Supercritical hops extract and potassium isomerized supercritical hops extract showed strong antibacterial activity against the tested strains as well. Escherichia coli was not affected by the extracts, meaning that their oral admission would not cause the same problem as antibiotic application in intestinal flora. The chemical composition of the investigated hops extracts was analysed by GC-MS. Contents of a-acids, beta-acids, iso-alpha-acids and xanthohumol in the samples were determined by HPLC

Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development

Glutathione is the most abundant thiol in the vast majority of organisms and is maintained in its reduced form by the flavoenzyme glutathione reductase. In this work, we describe the genetic and functional analysis of the Caenorhabditis elegans gsr-1 gene that encodes the only glutathione reductase protein in this model organism. By using green fluorescent protein reporters we demonstrate that gsr-1 produces two GSR-1 isoforms, one located in the cytoplasm and one in the mitochondria. gsr-1 loss of function mutants display a fully penetrant embryonic lethal phenotype characterized by a progressive and robust cell division delay accompanied by an aberrant distribution of interphasic chromatin in the periphery of the cell nucleus. Maternally expressed GSR-1 is sufficient to support embryonic development but these animals are short-lived, sensitized to chemical stress and have increased mitochondrial fragmentation and lower mitochondrial DNA content. Furthermore, the embryonic lethality of gsr-1 worms is prevented by restoring GSR-1 activity in the cytoplasm but not in mitochondria. Given the fact that the thioredoxin redox systems are dispensable in C. elegans, our data support a prominent role of the glutathione reductase/glutathione pathway in maintaining redox homeostasis in the nematode

Improved clinical investigation and evaluation of high-risk medical devices: the rationale and objectives of CORE-MD (Coordinating Research and Evidence for Medical Devices)

: In the European Union (EU) the delivery of health services is a national responsibility but there are concerted actions between member states to protect public health. Approval of pharmaceutical products is the responsibility of the European Medicines Agency, whereas authorizing the placing on the market of medical devices is decentralized to independent 'conformity assessment' organizations called notified bodies. The first legal basis for an EU system of evaluating medical devices and approving their market access was the medical device directives, from the 1990s. Uncertainties about clinical evidence requirements, among other reasons, led to the EU Medical Device Regulation (2017/745) that has applied since May 2021. It provides general principles for clinical investigations but few methodological details-which challenges responsible authorities to set appropriate balances between regulation and innovation, pre- and post-market studies, and clinical trials and real-world evidence. Scientific experts should advise on methods and standards for assessing and approving new high-risk devices, and safety, efficacy, and transparency of evidence should be paramount. The European Commission recently awarded a Horizon 2020 grant to a consortium led by the European Society of Cardiology and the European Federation of National Associations of Orthopaedics and Traumatology, that will review methodologies of clinical investigations, advise on study designs, and develop recommendations for aggregating clinical data from registries and other real-world sources. The CORE-MD project (Coordinating Research and Evidence for Medical Devices) will run until March 2024; here we describe how it may contribute to the development of regulatory science in Europe

Analyse comparative du rôle des normes et pratiques journalistiques à la télévision dans la couverture de la campagne électorale fédérale canadienne de 1997

Quelles sont les normes et les pratiques journalistiques dans la couverture d’une campagne électorale ? Les journalistes appliquent-ils les normes auxquelles ils souscrivent dans l’abstrait ? Cet article compare les normes et les pratiques des journalistes de deux réseaux de télévision, public et privé, durant la campagne électorale fédérale canadienne de 1997. Il démontre que les journalistes dont les patrons édictent des normes professionnelles explicites ne produisent pas une couverture différente de celle des journalistes qui ne reçoivent pas de consignes de travail bien définies. Il analyse les raisons de la non-correspondance entre les normes et les pratiques.What are the journalistic standards and practices in the coverage of an election campaign ? Do journalists apply the standards to which they subscribe in the abstract ? This article compares the standards and practices of journalists from two networks, one private, one public, during the 1997 federal election campaign. It shows that journalists who work under strict professional standards laid out by their bosses do not produce coverage which is different from those who work under no such strictly spelled out guidelines. The article analyses the reasons for the incompatibility between standards and practices.¿Cuáles son las normas y prácticas periodísticas cuando se cubre una campaña electoral? ¿Aplican los periodistas los principios a los que se adhieren en abstracto? Este artículo compara las normas y prácticas de los periodistas de las dos redes de televisión, pública y privada, durante la campaña electoral federal canadiense de 1997. El artículo demuestra que los periodistas, cuyos jefes dictan las normas profesionales explícitas, no cubren las campañas de manera diferente a como lo hacen los periodistas que no reciben consignas de trabajo bien definidas. En este artículo también se analizan las razones de lo que no corresponde entre las normas y prácticas

Analyse comparative du rôle des normes et pratiques journalistiques à la télévision dans la couverture de la campagne électorale fédérale canadienne de 1997

What are the journalistic standards and practices in the coverage of an election campaign ? Do journalists apply the standards to which they subscribe in the abstract ? This article compares the standards and practices of journalists from two networks, one private, one public, during the 1997 federal election campaign. It shows that journalists who work under strict professional standards laid out by their bosses do not produce coverage which is different from those who work under no such strictly spelled out guidelines. The article analyses the reasons for the incompatibility between standards and practices