Avaliação de metaloproteinases de matriz -2, -9 e timp-2 em polpas dentais humanas sadias e inflamadas

Orientadores: Alexandre Augusto Zaia, Sergio Roberto Peres LineTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: As metaloproteinases de matriz (MMPs) são enzimas zinco dependentes secretadas por diversas células e que possuem uma importante função no remodelamento da matriz extracelular tanto em processos fisiológicos quanto patológicos. Essas enzimas são secretadas na forma inativa (zimógeno) e sua atividade pode ser modulada por inibidores teciduais endógenos (TIMPs). As MMPs são subdivididas de acordo com seu substrato, sendo as MMPs -2 e -9 conhecidas como gelatinases por degradar gelatina, ou seja, colágeno denaturado. Em uma inflamação pulpar intensa ocorre degradação tecidual similar à qualquer outro processo inflamatório. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar polpas dentais humanas sadias e inflamadas quanto à expressão gênica de MMP-2, MMP-9 e TIMP-2 utilizando o PCR em tempo real; valores proteicos de TIMP-2 através do ELISA e atividade gelatinolítica de MMP-2 e MMP-9 por meio da técnica zimográfica. A técnica de quantificação de mieloperoxidase (MPO) também foi realizada em todas as amostras para identificar e quantificar a presença de células neutrofílicas na polpa. Foram utilizadas polpas sadias (n=20) de terceiros molares inclusos e polpas inflamadas (n=20), caracterizadas clinicamente. Os resultados mostraram uma expressão gênica 9 vezes maior para MMP-9 em polpas inflamadas quando comparadas a polpas sadias. Para a quantificação proteica, os valores absolutos evidenciaram maiores valores de TIMP-2 em polpas inflamadas quando comparadas com polpas sadias (p<0,0039). A atividade gelatinolítica para o grupo sadio evidenciou maior presença de bandas para pro-MMP-2, com ausência de MMP-9. Em polpas inflamadas, a proteína que apresentou maior atividade foi a MMP-9, com atividade significantemente maior (p=0,00081) quando comparada com MMP-2 ativa. O resultado da quantificação da proteina MPO evidenciou para algumas amostras inflamadas, caracterizadas clinicamente, um padrão similar ao encontrado para polpas sadias. E em amostras inflamadas com alto índice de MPO, caracterizando assim presença de muitos neutrófilos, houve presença de atividade gelatinolítica para MMP-9. Assim, pode-se concluir que a proteína MMP-2, em polpas inflamadas, tornou-se ativa mesmo com o aumento da produção de TIMP-2. Entretanto, o aumento em níveis proteicos para TIMP-2 na inflamação, não foi acompanhado do aumento do RNAm para este gene. Em processos inflamatórios, MMP-2 e MMP-9 foram encontradas de forma ativa, o que não ocorreu em polpas sadias. Não houve correlação entre sintomatologia e presença da proteína mieloperoxidase ou atividade gelatinolítica em polpas inflamadasAbstract: Matrix Metalloproteinases (MMPs) are members of a family of zinc-dependent endopeptidases which are involved in the degradation of extracellular matrix but also in a number of other biologic processes. Such as any other inflammatory process, the pulp inflammation is associated with tissue degradation which can be mediated by MMPs. MMP-2 and MMP-9, named gelatinases, are secreted in latent form (zymogen) and their activity can be modulated by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). The aim of this study was evaluated the role of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 in inflammatory human dental pulp tissues. Twenty dental pulp clinically diagnosed as inflammatory tissues and twenty healthy pulp tissues from enclosed third molars were harvested and evaluated to: gene expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 by real-time PCR; protein quantification of TIMP-2 by ELISA; gelatinolytic activity (MMP-2 and MMP-9) assessed by zymography technique, and neutrophils quantification by mieloperoxidase protein (MPO) assay. Data analysis showed an increased mRNA levels of MMP-9. Protein level of TIMP-2 in inflammatory pulp tissues was higher than healthy tissues (p<0,0039). The gelatinolytic activity for the healthy pulp tissues revealed a greater presence of bands for pro-MMP-2, with absence of MMP-9 bands. In inflammatory pulp tissues, MMP-9 demonstrated higher activity (p=0.00081) compared to MMP-2. Finally, the inflammatory pulp tissues with increased MPO protein levels were associated to the MMP-9 gelatinolityc activity. Taken together, these data suggest that MMP-2 in inflammatory pulp tissues was activated even at the presence of high levels of TIMP-2. However, the increased protein levels of TIMP-2 in inflammatory pulps were not followed by an increase of corresponding mRNA levels. During inflammatory process, MMP-2 and MMP-9 were found active, which did not occur in healthy pulps. Besides, it was not observed correlation between pain and the presence of mieloperoxidase protein or gelatinolytic activity in inflammatory pulp tissuesDoutoradoEndodontiaDoutor em Clínica Odontológic

Hydroxyapatite crystallinity does not affect the repair of critical size bone defects

OBJECTIVE: The physicochemical properties of hydroxyapatite (HA) granules were observed to affect the biological behavior of graft materials. The aim of this work was to analyze the tissue response of two HA granules with different crystallinity and Ca/P ratio in vivo. MATERIAL AND METHODS: The HA granules were produced in the Biomaterials Laboratory (COPPE/UFRJ). The testing materials were HA granules presenting a Ca/P molar ratio of 1.60 and 28% crystallinity (HA-1), and a Ca/P molar ratio of 1.67 and 70% crystallinity (HA-2). Both HAs were implanted into a critical-size calvaria rat defects. RESULTS: To note, in the control group, the bone defects were filled with blood clot only. Descriptive and histomorphometric analyses after 1, 3, and 6 months postoperatively showed mild inflammatory infiltrate, mainly comprising macrophage-like and multinucleated giant cells, and an increase in the volume density of the fibrous tissues (p<0.05), which was in contrast to the similar volume density of the newly formed bone and biomaterials in relation to the control group. CONCLUSION: Thus, we concluded that HA-1 and HA-2 are biocompatible and non-degradable, and that crystallinity does not affect bone repair of critical size defects

Caracterização físico-química e análise histológica do potencial osteocondutor de diferentes implantes xenogênicos no reparo de defeito ósseo de tamanho crítico na calvária de ratos (Rattus norvegicus)

O objetivo deste trabalho foi caracterizar algumas propriedades físico-químicas do osso bovino misto (OBM) e analisar comparativamente o potencial osteocondutor do OBM em relação ao osso bovino inorgânico medular (Bio-Oss® e Gen-Ox®), tendo o coágulo como controle negativo. O OBM foi analisado por meio de termogravimetria, espectroscopia no infravermelho, calorimetria exploratória diferencial, determinação da porosidade e tamanho de poros, microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-X e cristalinidade. Para esta análise foram feitos defeitos críticos (9 mm de diâmetro) na calvária de ratos (n=5/período - material), preenchidos de acordo com o grupo experimental e recobertos com membrana de cortical óssea bovina Gen-Derm®. Ao final dos períodos de 1, 3, 6 e 9 meses póscirúrgicos, as calotas foram coletadas, fixadas em formalina 10% tamponada,radiografadas e processadas para análise histológica. As análises físico-químicas evidenciaram grupamentos característicos de colágeno e de hidroxiapatita no osso bovino misto. Na análise microscópica comparativa observamos que: a) não ocorreu o completo fechamento do defeito em quaisquer dos grupos estudados; b) em todos os grupos a membrana foi reabsorvida antes do período de 1 mês; c) no grupo controle a ossificação ocorreu na borda do defeito, sendo a região central preenchida por tecido conjuntivo fibroso; d) no grupo tratado com Bio-Oss ocorreu ossificação na borda do defeito, com denso fibrosamento ao redor das partículas; e) no grupo tratado com Gen-Ox houve neoformação óssea ao redor das partículas do biomaterial; f) no grupo tratado com OBM o infiltrado inflamatório persistiu no primeiro mês, sendo substituído por tecido conjunto fibroso ao redor das partículas.Concluímos que: a) o OBM apresenta frações orgânica (cerca de 15%) e inorgânica (cerca de 75%); b) nenhum dos materiais testados foi capaz de induzir o fechamento completo da lesão de tamanho crítico; c) o Gen-Ox inorgânico demonstrou a maior capacidade osteocondutora dentre os materiais testados; d) o OBM e o Bio-Oss, no modelo experimental utilizado, não apresentaram propriedades osteocondutoras e, e) nenhum dos materiais foi reabsorvido no período de 9 meses.The aim of this study was to evaluate the physicochemical properties of mixed bovine bone (MBB) and analyze the osteoconductive potential of MBB compared to woven inorganic bovine bone (Bio-Oss® e Gen-Ox®), having as a control the blood clot, in rat calvariae. MBB was analyzed by means of thermogravimetry, infrared spectroscopy, differential exploratory calorimetry, pore size and porosity determination, scanning electron microscopy, X-ray diffraction and cristalinity. Critical size defects (9-mm diameter) were made in rat calvariae (n=5/period - material), filled according to the experimental group and covered with bovine cortical bone membrane (Gen-Derm®). At the end of the study periods (1, 3, 6 and 9 months postoperatively), the skulls were collected, fixed in 10% formalin, radiographed and processed for histological analysis. Physicochemical analysis showed characteristic collagen and hydroxyapatite groups in the MBB. The comparative microscopic evaluation showed that: a) there was no complete closure of the defects in any study group; b) in all groups, the membrane was resorbed before 1 month; c) in the control group, ossification took place on the periphery of the defect, and the central region of the defect was filled with connective fibrous tissue; d) in the group treated with Bio-Oss there was ossification on the periphery of the defect and dense fibrous tissue surrounding the graft particles; e) in the group treated with Gen-Ox there was bone formation surrounding the biomaterial particles; f) in the group treated with MBB the inflammatory infiltrate persisted in the first month and was then substituted by fibrous connective tissue surrounding the particles. In conclusion: a) MBB is composed by organic (15%) and inorganic (75%) fractions; b) none of the tested materials was able to induce the complete cleasure of the critical size defects; c) Gen-Ox was the most osteoconductive material among those tested; d) neither MBB nor Bio-Oss, in this experimental model, showed osteoconductive properties and e) none of the materials was resorbed in 9 month

Caracterização físico-química e análise histológica do potencial osteocondutor de diferentes implantes xenogênicos no reparo de defeito ósseo de tamanho crítico na calvária de ratos (Rattus norvegicus)

O objetivo deste trabalho foi caracterizar algumas propriedades físico-químicas do osso bovino misto (OBM) e analisar comparativamente o potencial osteocondutor do OBM em relação ao osso bovino inorgânico medular (Bio-Oss® e Gen-Ox®), tendo o coágulo como controle negativo. O OBM foi analisado por meio de termogravimetria, espectroscopia no infravermelho, calorimetria exploratória diferencial, determinação da porosidade e tamanho de poros, microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-X e cristalinidade. Para esta análise foram feitos defeitos críticos (9 mm de diâmetro) na calvária de ratos (n=5/período - material), preenchidos de acordo com o grupo experimental e recobertos com membrana de cortical óssea bovina Gen-Derm®. Ao final dos períodos de 1, 3, 6 e 9 meses póscirúrgicos, as calotas foram coletadas, fixadas em formalina 10% tamponada,radiografadas e processadas para análise histológica. As análises físico-químicas evidenciaram grupamentos característicos de colágeno e de hidroxiapatita no osso bovino misto. Na análise microscópica comparativa observamos que: a) não ocorreu o completo fechamento do defeito em quaisquer dos grupos estudados; b) em todos os grupos a membrana foi reabsorvida antes do período de 1 mês; c) no grupo controle a ossificação ocorreu na borda do defeito, sendo a região central preenchida por tecido conjuntivo fibroso; d) no grupo tratado com Bio-Oss ocorreu ossificação na borda do defeito, com denso fibrosamento ao redor das partículas; e) no grupo tratado com Gen-Ox houve neoformação óssea ao redor das partículas do biomaterial; f) no grupo tratado com OBM o infiltrado inflamatório persistiu no primeiro mês, sendo substituído por tecido conjunto fibroso ao redor das partículas.Concluímos que: a) o OBM apresenta frações orgânica (cerca de 15%) e inorgânica (cerca de 75%); b) nenhum dos materiais testados foi capaz de induzir o fechamento completo da lesão de tamanho crítico; c) o Gen-Ox inorgânico demonstrou a maior capacidade osteocondutora dentre os materiais testados; d) o OBM e o Bio-Oss, no modelo experimental utilizado, não apresentaram propriedades osteocondutoras e, e) nenhum dos materiais foi reabsorvido no período de 9 meses.The aim of this study was to evaluate the physicochemical properties of mixed bovine bone (MBB) and analyze the osteoconductive potential of MBB compared to woven inorganic bovine bone (Bio-Oss® e Gen-Ox®), having as a control the blood clot, in rat calvariae. MBB was analyzed by means of thermogravimetry, infrared spectroscopy, differential exploratory calorimetry, pore size and porosity determination, scanning electron microscopy, X-ray diffraction and cristalinity. Critical size defects (9-mm diameter) were made in rat calvariae (n=5/period - material), filled according to the experimental group and covered with bovine cortical bone membrane (Gen-Derm®). At the end of the study periods (1, 3, 6 and 9 months postoperatively), the skulls were collected, fixed in 10% formalin, radiographed and processed for histological analysis. Physicochemical analysis showed characteristic collagen and hydroxyapatite groups in the MBB. The comparative microscopic evaluation showed that: a) there was no complete closure of the defects in any study group; b) in all groups, the membrane was resorbed before 1 month; c) in the control group, ossification took place on the periphery of the defect, and the central region of the defect was filled with connective fibrous tissue; d) in the group treated with Bio-Oss there was ossification on the periphery of the defect and dense fibrous tissue surrounding the graft particles; e) in the group treated with Gen-Ox there was bone formation surrounding the biomaterial particles; f) in the group treated with MBB the inflammatory infiltrate persisted in the first month and was then substituted by fibrous connective tissue surrounding the particles. In conclusion: a) MBB is composed by organic (15%) and inorganic (75%) fractions; b) none of the tested materials was able to induce the complete cleasure of the critical size defects; c) Gen-Ox was the most osteoconductive material among those tested; d) neither MBB nor Bio-Oss, in this experimental model, showed osteoconductive properties and e) none of the materials was resorbed in 9 month

Vascular hyper-reactivity following arterial balloon injury: distant and delayed effects

The adverse functional effects of balloon angioplasty include simple procedure failure, compromise of vessel lumen (rupture), and restenosis. A much less well-defined repercussion of balloon injury to arteries is a paradoxical alteration in vascular reactivity at an anatomically distant site. The paper by Accorsi-Mendonça in the current issue presents new data showing that, following balloon injury to the rat left common carotid artery, there is a delayed hyperreactivity to both phenylephrine and angiotensin II in the contralateral artery. The pharmacological basis of these effects is unknown, although the authors demonstrate that products of cyclooxygenase (COX) 1 or 2 are responsible for the hyperreactivity to angiotensin II and phenylephrine, respectively. The absence of delayed hyperreactivity to these agents in the aorta of injured rats would suggest that a humoral factor is not involved