The Montado agroforestry system microclimatic specificity in the context of global change

The effects of oak trees on microclimatic parameters in Quercus rotundifolia Lam. woodland in the Alentejo, Southern Portugal, are reported. Results show that oak tree create a marked differentiation in the grass matrix, between open and undercanopy areas. Compared to open areas, it presents lower soil moisture beneath the oak canopy, lower soil temperatures and lower photosynthetically active radiation (PAR). Soil temperatures outside trees canopy were generally higher than undercanopy areas, reaching twice its values during the winter. The decrease of soil water content is more rapid in areas outside the trees canopy action, but the replenishment starts early and is faster in those areas. PAR intercepted by tree canopy is greater than 60%, and affects dramatically herbaceous production. Different climatic conditions due to the presence of the tree, associated with greater variability in chemistry environment undercanopy, if combined with the IPCC forecasts for Mediterranean region, pose new challenges in the management of the montado areas

Desenvolvimento de um novo sistema de entrega de DNA plasmídico para futura aplicação na terapia do cancro

During the past few decades gene therapy has become a promising alternative for the treatment of many incurable diseases such as cancer. This extremely complex disease possesses characteristics that make most of the generally used treatments rather ineffective. The research work presented in this thesis attempts to take advantage of novel non-viral gene therapeutic approaches based on plasmidic DNA and nanoparticulated systems that might provide the foundation for the development of a novel therapeutic treatment from the production to a real application in the everyday life of cancer patients. Hence the production of an expression vector that encodes for a tumor suppressor, p53 was promoted in recombinant organisms. Subsequently the different plasmid DNA isoforms were isolated and the supercoiled isoform, the one biologically active and with enhanced transfection efficiency was purified by affinity chromatography. Following this purification and recovery the development of novel nanoparticle systems that could deliver the exogenous DNA into the malignant cells was promoted. Nanoparticulated systems produced with chitosan demonstrated small size ranges and suitable properties for the encapsulation of plasmidic DNA. Additionally, transfection of eukaryotic neoplastic cells revealed the suitability of the nanocarrier as a novel delivery system of p53 expression vectors to cancer

Social Eavesdropping in Zebrafish

Group living animals may eavesdrop on signalling interactions between conspecifics. This enables them to collect adaptively relevant information about others, without incurring in the costs of first-hand information acquisition. Such ability, aka social eavesdropping, is expected to impact Darwinian fitness and hence predicts the evolution of cognitive processes that enable social animals to use social information available in the environment.(...

Children exposure to multiple mycotoxins through food consumption: a holistic approach for risk assessment

Food ingestion is considered a major route of human exposure to chemical contaminants, namely mycotoxins. Considering their toxic and carcinogenic effects, mycotoxins exposure assessment assumes particular importance, especially when vulnerable populations as children, are involved. Although there are increasing evidences of mycotoxins co-contamination in food, scarce data are available concerning children exposure to multiple mycotoxins, their bioaccessibility and the potential toxic effects resulting from intestinal exposure. Addressing these considerations, this thesis main objectives were: to characterize Portuguese children (under 3 years old) exposure to multiple mycotoxins through food consumption; to determine mycotoxins bioaccessibility in foods usually consumed by children; to evaluate intestinal toxic effects associated to mycotoxins exposure; and, to characterize the risk associated to the consumption of foods, considering data from exposure assessment, bioaccessibility and intestinal toxicity assays. The present thesis applied for the first time a holistic approach, gathering results obtained through different first-line methodologies, comprising probabilistic tools to estimate mycotoxins daily intake and in vitro assays to determine bioaccessibility and toxic effects. Results revealed a potential health concern for aflatoxins exposure with regard to the high percentiles of children intake. For the first time, a potential synergism was described relatively to the combined intestinal toxic effects of patulin and ochratoxin A, two known enterotoxins. The obtained results reinforce the importance to use a holistic approach to multiple mycotoxins risk assessment, especially for vulnerable populations as children. Particular attention should be dedicated to evaluate the consequences of intestinal exposure to mycotoxins, in particular to their impact on the development of intestinal diseases; RESUMO: EXPOSIÇÃO DE CRIANÇAS A MÚLTIPLAS MICOTOXINAS ATRAVÉS DO CONSUMO DE ALIMENTOS: UMA ABORDAGEM HOLÍSTICA À AVALIAÇÃO DE RISCO A ingestão de alimentos é considerada a principal via de exposição humana a contaminantes químicos, dos quais se destacam as micotoxinas. Em virtude dos seus efeitos tóxicos e carcinogénicos, é fundamental avaliar a exposição a estes compostos, particularmente em populações vulneráveis, como é o caso das crianças. Nos últimos anos, alguns estudos têm dedicado especial atenção à co-contaminação de alimentos por micotoxinas. No entanto, são ainda escassos os dados disponíveis relativos à exposição das crianças a múltiplas micotoxinas assim como a sua bioacessibilidade e potenciais efeitos tóxicos a nível intestinal. Neste contexto, a presente Tese teve como principais objetivos: caracterizar a exposição das crianças portuguesas (idade inferior a 3 anos) a múltiplas micotoxinas através da alimentação; determinar a bioacessibilidade das micotoxinas nos alimentos habitualmente consumidos pelas crianças; avaliar os efeitos tóxicos intestinais associados à exposição simultânea a micotoxinas; e, caracterizar o risco associado ao consumo de alimentos, coligindo resultados da avaliação da exposição, bioacessibilidade e toxicidade intestinal. A presente Tese desenvolveu pela primeira vez uma abordagem holística, reunindo resultados obtidos através de diferentes metodologias, nomeadamente ferramentas probabilísticas para estimar a ingestão diária de micotoxinas e ensaios in vitro para determinar a bioacessibilidade e efeitos tóxicos. Os principais resultados revelaram, pela primeira vez, que a exposição a aflatoxinas pode representar um risco potencial para as crianças que apresentaram os percentis mais elevados de ingestão. Foram também descritos efeitos sinérgicos inéditos decorrentes da exposição intestinal simultânea a duas enterotoxinas: patulina e ocratoxina A. Os resultados obtidos reforçam a importância da implementação de uma abordagem holística para a avaliação de risco de misturas de micotoxinas, em especial quando envolvidas populações vulneráveis como as crianças. As potenciais consequências da exposição intestinal a micotoxinas deverão ainda ser ponderadas, principalmente no que respeita às implicações no desenvolvimento de doenças intestinais

Proimmunotoxin: a novel design strategy of immunotoxins applied to breast cancer

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Breast cancer is the second leading cause of death among female cancer patients. One of the most used therapies against receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 (HER2)+ metastatic breast cancer is the monoclonal antibody Trastuzumab. This antibody can be used in therapy either alone or in conjugation with chemotherapeutics. Though it has shown to lead to an increase in patient’s overall survival, this therapy may also lead to the acquirement of resistance in patients with prolonged usage. Immunotoxins have been pursued for a long time as a new and innovative type of biopharmaceutical against cancer because they combine the cytotoxicity of a variety of toxins with the specificity of antibodies. An immunotoxin combining Ricin A-chain [Ricin A] and an antibody targeting breast cancer has already been tried as a therapeutic. However, the observed non-specific toxicity prevented further studies. To address the problem of nonspecific toxicity observed in immunotoxins, one possible solution could be the neutralization of the active toxin during blood circulation. Recently, variable domain from alpacas heavy chain antibody (VHH), targeting Ricin A, have been described to effectively neutralize Ricin toxin in vitro and to protect mice from Ricin toxicity in vivo. Taking in consideration these concepts, a new type of immunotoxin could be envisioned. A proimmunotoxin which comprises Trastuzumab linked to a Ricin A neutralizing VHH, may be capable of delivering Ricin A toxin with high specificity to HER2+ breast cancer cells, while neutralizing its activity during blood circulation, overcoming the non-specific toxic side effects of a normal immunotoxin and resistance to Trastuzumab. The results here presented show that this new type of immunotoxin retains the specificity of the antibody Trastuzumab towards HER2, shows affinity towards Ricin A, and most importantly, it can protect HER2- cells, while retaining the ability to deliver Ricin A toxin to HER2+ breast cancer cells, decreasing cell viability. The possibility of clustering HER2 at the cell membrane to enhance the internalization and trafficking of the proimmunotoxin was also studied by constructing one with two different binding sites to HER2. Preliminary results show that this proimmunotoxin has a quicker internalization by the cells, shown by an enhanced decrease in cell viability.De acordo com a American Cancer Society, é estimado que o cancro da mama provoque aproximadamente 40,920 mortes em 2018, apenas nos Estados Unidos da América. Este tipo de cancro é a segunda maior causa de morte entre mulheres diagnosticadas com cancro, mas pode também afetar homens. A doença pode ser classificada em diversos subtipos, sendo que o cancro da mama HER2+ afeta entre 20% a 30% das mulheres que sofrem desta doença. Este é caracterizado pela sobrexpressão ou amplificação do gene c-erbB-2, que codifica para o recetor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico humano, cuja função principal é a regulação do crescimento celular. A sobrexpressão de HER2 leva a um crescimento celular descontrolado que aumenta a probabilidade de metastização de células cancerígenas, aumentando a taxa de mortalidade e levando a um pior prognóstico dos doentes diagnosticados com cancro da mama HER2+. A terapia mais recorrente em doentes com cancro da mama HER2+ é o anticorpo monoclonal Trastuzumab, sendo que esta terapia pode ser feita com ou sem a administração de outros fármacos. Este anticorpo exerce o seu efeito terapêutico ligando-se ao recetor HER2 impedindo a transdução de sinal através da via PI3K/Akt e aumentando a sua internalização e possível degradação. Este anticorpo promove também o recrutamento de células imunitárias, como por exemplo as células Natural Killer (NK), através de um mecanismo mediado pelo recetor CD16. O principal problema com a utilização deste tratamento é a necessidade de um uso recorrente do mesmo, o que leva muitas vezes à aquisição de resistência à terapia por parte destes doentes. De forma a aumentar a citotoxicidade de anticorpos monoclonais utilizados na terapia contra o cancro, tem-se recorrido a técnicas de biologia molecular para combinar anticorpos ou fragmentos dos mesmos com toxinas - estas novas moléculas são denominadas de imunotoxinas. A vantagem destas imunotoxinas na terapêutica contra o cancro é que comparativamente aos anticorpos terapêuticos que as constituem, conseguem promover um aumento da citotoxicidade através da junção de uma grande variedade de toxinas, mantendo a especificidade para os seus alvos terapêuticos, permitindo assim a sua distribuição às células cancerígenas. De entre as toxinas que podem ser utilizadas para a construção de imunotoxinas, a Ricina, proteína de origem vegetal extraída da planta Ricinus communis L., é uma das que mostra maior relevância devido à sua potente citotoxicidade. Esta proteína é constituída por duas cadeias polipeptídicas, a cadeia A é conhecida pela sua capacidade de depurinação de uma base de adenina na subunidade 28 do RNA ribossomal, causando a inativação dos ribossomas e consequentemente à paragem da síntese proteica, levando à morte das células por apoptose. Sendo a cadeia A a componente tóxica desta toxina, a cadeia B está encarregue da entrada da toxina na célula, através da sua ligação a resíduos de galactose presentes na superfície das células. Até hoje já foram testadas várias imunotoxinas que combinam a toxina Ricina com anticorpos que têm como alvo o cancro da mama e, apesar de mostrarem bons resultados iniciais, os efeitos de toxicidade não-específica observados em pacientes após a administração destes biofármacos impedem a sua comercialização. Uma possível solução aos efeitos observados pode passar pela neutralização da toxina ativa durante a sua circulação sanguínea. A descoberta de anticorpos formados apenas pela sua cadeia pesada em camelídeos revolucionou o conceito de anticorpo monoclonal e permitiu a construção de novos fragmentos de anticorpo, os fragmentos variáveis da cadeia pesada de camelídeos, ou em inglês variable domain of camelid heavy chain antibody (VHH). Os VHH além de manterem a especificidade dos anticorpos monoclonais têm como vantagem adicional a sua reduzida dimensão, o que permite um grande número de aplicações que não seriam possíveis com anticorpos monoclonais. Vance D. J. e os seus colaboradores construíram recentemente monómeros e heterodímeros de VHHs que são capazes de neutralizar eficazmente a Ricina in vitro e proteger ratinhos da sua toxicidade in vivo, tendo como alvo quer a cadeia A como a cadeia B desta toxina. Através dos conceitos apresentados acima, é possível idealizar um novo conceito de imunotoxina. Em vez de utilizar a convencional construção de imunotoxina, cujo anticorpo se encontra diretamente ligado à toxina, o anticorpo irá encontrar-se ligado a VHHs anti-toxina que irão não só neutralizar a mesma durante a sua circulação sanguínea, mas também entregar especificamente a toxina às células. Neste projeto apresentamos um novo conceito de imunotoxina, uma proimunotoxina, que irá fundir o anticorpo Trastuzumab a dois homodímeros VHH anti-Ricina A, que será capaz de entregar a cadeia A da toxina Ricina especificamente a células de cancro da mama HER2+, tentando desta forma evitar os efeitos de toxicidade não específica. A criação de uma proimunotoxina permitiu em paralelo o estudo de uma construção similar com o objetivo de aumentar a sua internalização através do clustering de recetores HER2 à superfície da célula, de forma similar ao que foi feito por Moody, P. R. et al. Inicialmente procedeu-se à construção de dois anticorpos, Tras-VHH-R, constituído pelo anticorpo Trastuzumab em formato scFv-Fc que se encontra ligado pela região Fc a dois homodímeros VHH anti-Ricina A e o anticorpo Tras-VHH-R-H, constituído também pelo anticorpo Trastuzumab no mesmo formato ligado a dois heterodímeros, constituídos por um VHH anti-Ricina A e um VHH anti-HER2, que na presença de Ricina A constituem a proimunotoxina 1 (PIT1) e proimunotoxina 2 (PIT2), respetivamente. Estes anticorpos foram produzidos em células 293-F FreeStyle™ e eficazmente purificados através de cromatografia de afinidade com colunas de Proteína A Sepharose. A afinidade relativa dos anticorpos Tras-VHH-R e Tras-VHH-R-H para com a cadeia A da toxina Ricina foi estudada utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), revelando baixos valores EC50 para ambos os anticorpos demonstrando uma alta afinidade à cadeia A de Ricina, que se deve exclusivamente aos VHHs anti-Ricina A presentes na sua constituição. O estudo da especificidade destes anticorpos para com o recetor HER2 foi estudado através de citometria de fluxo, demonstrando resultados similares entre os anticorpos contruídos neste projeto e o anticorpo Trastuzumab, com valores superiores a 95 % de células marcadas para a linha celular SKBR3 (HER2+) e inferiores a 2 % para a linha celular HeLa P4 (HER2-), para concentrações de anticorpo superiores a 0.8 nM. Por último, a citotoxicidade das proimunotoxinas foi testada através de um ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium). Células SKBR3 e HeLa P4 foram incubadas com Ricina A, anticorpo (Tras-VHH-R ou Tras-VHH-R-H) e PIT 1 ou 2 a diferentes concentrações separadamente, durante períodos de 48 ou 72 h. Os resultados de viabilidade celular obtidos confirmam a existência de concentrações de PIT 1 e 2 para as quais a viabilidade celular na linha celular SKBR3 é inferior a 60% mantendo a viabilidade celular superior a 90 % na linha celular HeLa P4, demonstrando que as PIT construídas neste projeto são capazes de matar células cancerígenas HER2+, protegendo as células HER2-. Comparando a PIT1 com a PIT2 é possível perceber uma diferença significativa na viabilidade celular entre as duas PIT, sendo que a PIT2 demonstra resultados de viabilidade celular inferiores à PIT1 em diferentes concentrações. Com base nestes resultados preliminares é possível concluir que o clustering de recetores HER2 à superfície da célula é capaz aumentar a internalização de proimunotoxinas e possivelmente ajudar no seu tráfico intracelular e por consequência na libertação da toxina dentro da célula. A aplicação deste conceito noutros veículos de transporte biológico de toxinas ou fármacos por anticorpos pode ser muito importante no aumento da sua eficácia e diminuição da sua toxicidade inespecífica. No futuro esperamos poder continuar com ensaios de internalização celular e microscopia confocal de forma a compreender melhor o modo como estas proimunotoxinas são internalizadas e o seu percurso no interior da célula. Ensaios de morte celular serão posteriormente realizados de forma a perceber quais as vias de morte celular que são ativadas aquando da libertação da toxina. Seria também muito importante começar os estudos em linhas celulares resistentes ao Trastuzumab de forma a poder viabilizar este novo biofármaco ao maior conjunto de pacientes possível. O que torna este conceito de proimunotoxina tão interessante é a possibilidade de ser aplicado a um grande conjunto de anticorpos e toxinas, mas também ao transporte de fármacos. Desta forma, esperamos que as experiências efetuadas neste trabalho possam contribuir para o avanço da disponibilização de novos e potentes biofármacos contra o cancro da mama

What are the best policies to reduce public debt?: a comparative analysis of four case studies

The financial crisis of 2008 constituted an asymmetrical external shock of tremendous proportions that gravely affected the Eurozone. In the face of a deep recession, the coordinated introduction of expansionist monetary and fiscal policies became imperative. However, the resulting extraordinary increase in public debt raised the alarm about a generalized sovereign debt crisis. Firstly, this thesis aims to assess in what extent and under what conditions have policies succeeded in guaranteeing a sustainable public debt trajectory. In addition, is discussed the relevance of complementary dimensions such as the structural reforms, the role of the counter-cyclical policies and potential impacts that size and composition have on successful adjustments. A comparative analysis of four case studies - Germany, Ireland, Portugal and Sweden - is conducted to evaluate the significance of each dimension in their respective public debt trajectories between 2000 and 2016. We find that, for this group of countries, the most determinant condition for a successful debt stabilization is a favourable growth dynamic followed by the Eurozone's membership. Furthermore, we find that the impacts of welfare state and labour market structural reforms on debt stabilization are quite limited. As for countercyclical policies, the adequate approach should comprise consolidations during a boom and expansions during a recession. Although, in the current context of the Eurozone the latter is substantially restricted. Finally, aspects related with the size and composition does not affect the outcome of adjustments directly but only indirectly through changes in economic growth.A crise financeira de 2008 constituiu um choque assimétrico de grandes dimensões que afetou severamente a Zona Euro. Perante uma recessão profunda, a introdução coordenada de políticas monetárias e fiscais expansionistas tornou-se indispensável. Contudo, a escalada de dívida pública que daí adveio fez crescer o receio de uma crise soberana generalizada. O principal objetivo desta Tese passa por avaliar em que extensão e sob que condições houve políticas bem-sucedidas na estabilização da dívida. Para além disso, é discutida a relevância de dimensões complementares como é o caso das reformas estruturais, o papel das políticas anti cíclicas e o potencial impacto da dimensão e composição no sucesso dos ajustamentos. Nesse sentido, é desenvolvida uma análise comparativa entre quatro casos de estudo - Alemanha, Irlanda, Portugal e Suécia - para avaliar a importância que cada dimensão teve nas respetivas trajetórias de dívida entre 2000 e 2016. Para este grupo de países concluímos que a condição mais determinante para uma estabilização bem-sucedida é uma dinâmica de crescimento favorável, seguida da afiliação na Zona Euro. Por outro lado, os impactos resultantes das reformas do estado social e do mercado de trabalho parecem ter sido bastante limitados. Em relação às políticas anti cíclicas, as políticas de consolidação devem ser aplicadas nos períodos de crescimento e as expansionistas nos períodos de recessão. No entanto, esta última opção encontra-se amplamente restringida no contexto atual da Zona Euro. Por fim, a dimensão e composição parece não ter influência direta no resulto dos ajustamentos, mas somente indireta por provocar alterações no crescimento económico

Influence of litter layer removal on the soil thermal regime of a pine forest in a Mediterranean climate

A remoção da manta morta nos pinhais portugueses pode reduzir o risco de incêndio florestal, mas tal prática pode influenciar o regime térmico do solo, afectando desta forma a actividade biológica do solo, a decomposição da manta morta e a dinâmica de nutrientes. Num solo arenoso (Haplic Podzol) sob um pinhal foram medidos perfis térmicos com termopares a várias profundidades até 16 cm, com ou sem manta morta. A manta morta actuou como um isolador térmico, reduzindo a amplitude da variação periódica da temperatura na camada de solo subjacente e aumentando as profundidades de amortecimento, sobretudo a teores baixos de humidade do solo. À superfície do solo mineral a redução das amplitudes foi de cerca de 2,5ºC no ciclo anual e de 5 a 6,7ºC no ciclo diário, dependendo da humidade do solo. A manta morta aumentou em cerca de 1- 1,5ºC as temperaturas médias diárias do solo mineral quando este se encontrava mais frio e mais húmido. A melhoria das condições térmicas do solo sob a manta morta recomenda a sua retençãocomo regra a seguir enquanto prática de ordenamento florestal

A escrita expressiva e criativa no contexto terapêutico: Dos diferentes conceitos ao desenvolvimento de programas de escrita terapêutica

One of the main aims of this scoping selective review is to clarify the differences between expressive and creative writing in the mental health context, not only at a conceptual level but also regarding its therapeutic effects. The other one is to identify the more efficient ways to develop therapeutic creative writing programs for a clinical population. Considering these specific aims, we employed a selective review on the writing therapeutic literature. We found that, although expressive writing is clearly defined and its benefits on mental health empirically well established, creative writing lacks a consistent conceptualization in clinical settings. Similarly, we reported several studies focusing in the therapeutic benefits of poetry, but other writings genres receive much less attention and are even more insufficiently defined. Since some studies support the idea that giving a significant content to a text is more beneficial, and considering that writing creatively offers new perspectives and meanings to the information, we propose that the development of creative writing programs should be tried. Aiming to develop such programs in the future, we give some suggestions based on already studied expressive writing methods.Um dos principais objectivos desta revisão selectiva da literatura no campo da escrita terapêutica consiste em clarificar as diferenças entre escrita expressiva e escrita criativa no contexto da saúde mental. Um outro objectivo visa identificar os procedimentos mais eficazes para desenvolver programas de escrita criativa para uma população clínica. Considerando estes objectivos específicos, utilizámos uma revisão selectiva focada no campo específico do estudo sobre escrita terapêutica. Verificámos que apesar de a escrita expressiva se encontrar claramente definida e os seus benefícios na saúde mental terem recebido um extenso suporte empírico, a escrita criativa apresenta lacunas de uma conceptualização consistente no contexto clínico. De forma similar, encontrámos vários estudos focados nos benefícios terapêuticos da poesia; todavia, outros géneros literários recebem muito menos atenção e encontram-se ainda mais insuficientemente definidos. Uma vez que alguns estudos apoiam a ideia de que dar um conteúdo com significado a um texto é mais benéfico, e dado que escrever criativamente implica oferecer novas perspectivas e significados à informação, propomos que o desenvolvimento de programas de escrita criativa deve ser experimentado. Com o objectivo de desenvolver estes programas no futuro, damos algumas sugestões baseadas em métodos de escrita expressiva já estudados