Diseño y validación de un array de SNPs para la detección de enfermedades monogénicas

Motivación: Las enfermedades monogénicas actualmente afectan a más de 20 millones de personas sólo en los Estados Unidos, causando una tasa de mortalidad infantil superior a 20%. La era científica en que vivimos nos permite conocer la carga genética de un embrión y la posibilidad de evitar nacimientos con enfermedades concretas que suponen una importante pérdida en la calidad de vida tanto del niño afecto, como del ambiente que le rodea. Sin embargo, las técnicas utilizadas hasta ahora para diagnóstigo genético preimplantacional resultan costosas y sólo permiten analizar un número pequeño de enfermedades siendo más habituales principalmente en aquellos casos en los que se presentan antecedentes familiares. En este contexto surge el Array Recombine, con el que podemos detectar en los progenitores, sin necesidad de conocer antecedentes familiares, 152 de las enfermedades monogénicas de mayor penetrancia, a través del análisis de 940 mutaciones. Métodos: Utilizamos una plataforma de Illumina (Illumina Infinium HD Assay) la cual permite el análisis de porlimorfismos de un nucleótido. El uso de esta plataforma implica mejoras tanto en la velocidad de análisis, como en la cantidad de mutaciones que se pueden analizar y el coste, el cual se reduce notablemente. Hemos elegido un array debido a que la técnica es bien conocida, de alta precisión y que ofrece call rates mayores del 99%. El Infinium Assay consiste en la hibridación de fragmentos de DNA genómico con cebadores sintéticos, los cuales están unidos a perlas de sílice, hasta un punto determinado en el que se añade una base en una reacción que emite una fluorescencia específica para A o T, con lo que permite conocer el genotipo en un punto concreto, relacionado con el desarrollo de una enfermedad genética en la progenie de una pareja portadora de dicho genotipo alterado. Las enfermedades incluídas se determinan siguiendo las recomendaciones de la ACOG y ACMG, así como la incidencia y el impacto de determinadas enfermedades genéticas. Resultados: Al comparar los resultados obtenidos mediante el array, con genotipos estudiados por secuenciación, se confirma que este ensayo es válido como prueba de diagnóstico genético preconcepcional, al no haber obtenido en ninguno de los casos falsos positivos o negativos, confirmando así una precisión del 100% para esta prueba. Conclusiones: El conocimiento de portadores de mutaciones puntuales permite evitar nacimientos de niños con graves enfermedades genéticas

Desarrollo de una nueva herramienta diagnóstica para redefinir la firma molecular de la receptividad endometrial

Motivación: La implantación embrionaria es un proceso que tiene lugar durante un breve periodo de tiempo donde el tejido endometrial alcanza un estado receptivo y donde se expresan moléculas que son necesarias para el proceso de implantación y posterior invasión del embrión. Este periodo se conoce como ventana de implantación y tiene lugar alrededor del día 20-21 del ciclo menstrual. El endometrio receptivo ha sido ampliamente estudiado desde el punto de vista histológico y molecular, y se conocen gran número de marcadores que forman parte de la firma molecular del endometrio receptivo, lo cual ha servido para desarrollar herramientas moleculares genómicas para el diagnóstico de la receptividad endometrial con utilidad clínica. Sin embargo, hasta ahora no se ha tenido en cuenta que la capacidad receptiva del endometrio tiene un componente inmunológico importante que facilita la entrada del tejido embrionario en el tejido materno. Este estudio pretende caracterizar el endometrio a nivel molecular, teniendo en cuenta tanto factores necesarios para la receptividad endometrial como para el control de la respuesta inmunológica.Métodos: 1 y 2. Selección de los marcadores de receptividad endometrial y respuesta inmunitaria tras revisión bibliográfica exhaustiva. Se seleccionaron 192 marcadores moleculares. 3. Diseño de los oligonucleótidos para la realización del test, compatibles con la novedosa plataforma Fluidigm, las cuales están siendo validadas en la Universidad para el posterior estudio de expresión. 4. Estudio prospectivo de la expresión de dichos marcadores en muestras las humanas que desde el principio del proyecto se han estado recogiendo. 5. Análisis de los datos obtenidos.Resultados: De momento se están validando las sondas de oligonucleótidos diseñadas para el Fluidigm. Una vez acabado este paso se iniciará el estudio con las muestras tomadas. Lo que esperamos es determinar los mejores marcadores para la receptividad endometrial, incluyendo algunos nuevos, y que el Fluidigm funcione como nueva plataforma para el desarrollo de la nueva herramienta diagnóstica de la receptividad endometrial en la que estamos trabajando.Conclusiones: La mejor y más exhaustiva caracterización del proceso de receptividad endometrial permitirá un mayor éxito en los tratamientos de fertilidad a los que se ven sometidas cada vez más parejas, y el uso del Fluidigm, además, redundará en una disminución de los costes económicos y el trabajo del investigador

Evaluación de la calidad seminal en pilotos de vuelos internacionales transoceánicos

Motivación: El factor masculino en reproducción está presente en la mitad de los casos de infertilidad, un problema de salud pública en auge en las ultimas décadas. Muchos estudios han demostrado que la calidad seminal se ha visto afectada por los contaminantes ambientales y los cambios en el estilo de vida, que pueden inducir procesos de fragmentación del DNA espermático o inducir estrés oxidativo(1). El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la calidad seminal de un grupo concreto, los pilotos de vuelos transoceánicos que, por su profesión, pueden suponer un grupo de riesgo de problemas de fertilidad debido a sus condiciones laborales. Los cambios constantes de presión, temperatura y estación, pueden ocasionar daños a nivel celular con afectación del DNA, que implique procesos de fragmentación masiva y, consecuentemente, una disminución o pérdida de la fertilidad con el subsecuente fracaso en el embarazo. Este trabajo también pretende poner de manifiesto la necesidad de un seminograma avanzado, mas allá de los parámetros básicos analizados convencionalmente.Métodos:Se llevó a cabo un seminograma estándar para evaluar concentración, volumen, motilidad, morfología y vitalidad, con ayuda de sistemas informáticos (SCA) para los ensayos de concentración y motilidad, microscopía tanto de campo claro como de fluorescencia, así como el kit Vitaltest para el ensayo de vitalidad.Para el análisis de fragmentación de DNA se realizaron 2 ensayos: el SCD (Sperm Chromatin Dispersion) para evaluar la fragmentación total (2) y el ensayo COMET, el cual identifica específicamente las roturas de cadena doble(3). Ambos se realizaron mediante la utilización de kits comerciales (Halotech DNA) y microscopía de fluorescencia para su recuento.Asimismo se realizó un ensayo para medir el estrés oxidativo, también mediante el uso de un kit comercial para un análisis colorimétrico (Halotech DNA).Conclusiones: A pesar de no tener aún los resultados necesarios, hay muchos estudios que demuestran que la calidad seminal, sobre todo respecto al DNA, se ve afectada por múltiples factores, ya sean ambientales, genéticos o referentes al estilo de vida, por lo que cabe esperar que este grupo concreto se vea afectado negativamente debido a sus condiciones laborales. Cada vez van surgiendo mas casos en los que el DNA espermático está tan dañado, que el ovocito es incapaz de reparar ese daño, con lo que se justifica el uso de un seminograma avanzado que estudie el material genético

Análisis de la expresión de marcadores tumorales en muestras de tumores humanos

Motivación: Los últimos datos de la OMS muestran una incidencia de 14,1 millones de casos nuevos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en el mundo, siendo el cáncer de pulmón el principal causante de muerte por cáncer en hombres y el cáncer de mama en mujeres (1). En la actualidad existen varios test genómicos que han identificado huellas genómicas de tipos específicos de cáncer como Ampliseq, Oncotype Dx o MammaPrint, pero sólo unos pocos incluyen datos clínicos a parte de los genéticos. El análisis de expresión de los marcadores que forman dichos test permiten predecir la evolución del tumor o la respuesta a tratamiento (2). El objetivo del proyecto es generar un test genómico basado en una huella genómica de cáncer de mama de 40 genes y otro basado en una huella de 36 genes de adenocarcinoma de pulmón. Estos test permitirán estratificar a los pacientes en tres grupos de riesgo y predecir la supervivencia de los mismos (3). En paralelo pretendemos analizar la expresión de genes que codifican bombas de detoxificación implicadas en la resistencia a quimioterapia (MDR, multidrug resistance).Métodos: De los 75 genes incluidos en el análisis de expresión se seleccionaron por un lado 32 genes de cáncer de mama, 30 genes de adenocarcinoma de pulmón y 6 genes de expresión constitutiva usados en los test genómico-clínicos patentados de Dueñas y col. (3); por otro lado, se hizo una revisión bibliográfica para seleccionar genes de transportadores ABC. A partir de ADNc de las biopsias y los primers diseñados se analizará la expresión de los marcadores en una plataforma BioMark 96.96 IFC Dynamic Array (Fluidigm). Esta plataforma es barata, sencilla y permite analizar la expresión de hasta 96 genes de forma simultánea mediante PCR cuantitativa.Resultados: De momento hemos diseñado los primers para todos los marcadores y hemos amplificado mediante PCR estándar 65 de los 75 marcadores. A continuación, los productos de PCR serán secuenciados para confirmar que corresponden a los marcadores y se analizará su expresión en cada muestra tumoral mediante PCR cuantitativa.Conclusiones: El análisis estadístico de los datos de qRT-PCR de las muestras de tumores humanos permitirá conocer que genes se encuentran sobre-expresados y cuales reprimidos en cada tumor; pudiendo predecir la evolución de la enfermedad en cada paciente y diseñar protocolos de quimioterapia más eficientes, acercándonos a la medicina personalizada

Análisis bioinformático de la expresión génica del endometrio tras el tratamiento con DIU

Motivación: El conocimiento de los niveles de expresión génica (y su posterior análisis funcional) de células endometriales tras el tratamiento con DIU puede jugar un papel fundamental en la búsqueda de drogas/fármacos que emulen el papel anticonceptivo del DIU y que de esta forma puedan ser usados en el tercer mundo como una opción anticonceptiva más barata que las usadas en paises desarrollados. Métodos: El trabajo parte de una publicación realizada en el año 2006 en la cual se realiza el estudio de microarrays para observar como varíaban perfiles de expresión génica endometriales tras la exposición de los mismos a un DIU. Los resultados mostraron que un total de 145 genes variaban de forma significativa su expresión tras la exposición al DIU. Ahora lo que buscamos es realizar el analisis funcional de los mismos, a través de tres métodos: 1-Gene Ontology, que permite la clasificación de los mismos; 2-Pubmatrix, que muestra la incidencia de dichos genes en otras publicaciones existentes, y por tanto su peso; 3-STRING, herramienta para la elaboración de redes neuronales que muestran de forma visual las interacciones intergénicas de los genes que resultaron significativos, según diversos criterios. Resultados: Los resultados del estudio inicial mostraron que, tras la inserción del DIU y su posterior retirada al mes, no se recuperaban los valores de expresión génica iniciales, si no que se mantenían y no se recuperaban hasta pasado un año. Los resultados del análisis funcional de los genes que se vieron afectados por la introducción del DIU son expuestos en forma de gráficas y figuras, con una pequeña reflexión a nivel biológico de lo que se encuentre más significativo como conclusión de lo actualmente trabajado

Cognition and schizophrenia: from neurocognition to social cognition

Los déficit neurocognitivos en la esquizofrenia han sido descritos desde las primeras descripciones del trastorno. Su influencia en la funcionalidad y en la calidad de vida ha sido puesta de manifiesto en múltiples estudios. La iniciativa Measurement and Treatment Research to Improve Cognition in Schizophrenia (MATRICS) del National Institute of Mental Health (NIMH) de Estados Unidos fue puesta en marcha para impulsar el desarrollo de una batería cognitiva de consenso que pudiera ser empleada en ensayos clínicos de fármacos para mejorar la neurocognición en la esquizofrenia. Aunque en el momento de consensuar los diferentes dominios cognitivos que deberían ser incluidos en dicha batería, la denominada cognición social no cumplía con los requisitos para ser incluida, se decidió finalmente incluir este dominio dada la importante relación con la funcionalidad que presentaba. Estudios posteriores han demostrado el acierto de incluir dicho dominio cognitivo, dada la relevancia que la cognición social ha demostrado en relación a la funcionalidad y calidad de vida de los pacientes con esquizofrenia; bien como variable per se, o bien como variable mediadora entre la neurocognición y la funcionalidad

Application of functional genomics to primate endometrium: insights into biological processes

Endometrium is a dynamic tissue that responds on a cyclic basis to circulating levels of the ovarian-derived steroid hormones, estradiol and progesterone. Functional genomics has enabled a global approach to understanding gene regulation in whole endometrial tissue in the setting of a changing hormonal milieu. The proliferative phase of the cycle, under the influence of estradiol, has a preponderance of genes involved in DNA synthesis and cell cycle regulation. Interestingly, genes encoding ion channels and cell adhesion, as well as angiogenic factors, are also highly regulated in this phase of the cycle. After the LH surge, different gene expression profiles are uniquely observed in the early secretory, mid-secretory (window of implantation), and late secretory phases. The early secretory phase is notable for up-regulation of multiple genes and gene families involved in cellular metabolism, steroid hormone metabolism, as well as some secreted glycoproteins. The mid-secretory phase is characterized by multiple biological processes, including up-regulation of genes encoding secreted glycoproteins, immune response genes with a focus on innate immunity, and genes involved in detoxification mechanisms. In the late secretory phase, as the tissue prepares for desquamation, there is a marked up-regulation of an inflammatory response, along with matrix degrading enzymes, and genes involved in hemostasis, among others. This monograph reviews hormonal regulation of gene expression in this tissue and the molecular events occurring therein throughout the cycle derived from functional genomics analysis. It also highlights challenges encountered in using human endometrial tissue in translational research in this context

Base de datos multicéntrica de hemorragia subaracnoidea espontánea del Grupo de Trabajo de Patología Vascular de la Sociedad Española de Neurocirugía: presentación,criterios de inclusión y desarrollo de una base de datos en internet = Spontaneous Subarachnoid Haemorrhage multicenter database from the Group for the Study of Vascular Pathology of the Spanish Society for Neurosurgery: Presentation, inclusion criteria and development of an internet-based registry

Introducción. La hemorragia subaracnoidea (HSA) continúa siendo una de las enfermedades de interés neuroquirúrgico de más alta morbilidad y mortalidad. Su estudio es clave a la hora de mejorar la atención de estos enfermos en nuestro medio. Con este fin el Grupo de Trabajo de Patología Vascular de la SENEC decidió la creación de una base de datos multicéntrica para su estudio. Material y métodos. Se incluyen en esta base de datos todos los casos de hemorragia subaracnoidea espontánea ingresados en los centros participantes de forma prospectiva desde Noviembre del año 2004 hasta Noviembre del 2007. Se decidieron de forma consensuada los campos a recoger incluyendo edad, antecedentes personales, características clínicas, características radiológicas y del aneurisma, tipo de tratamiento y complicaciones de la enfermedad, evolución según la escala de evolución de Glasgow (GOS) al alta y a los seis meses así como el resultado angiográfico del tratamiento. Todos los campos se recogieron en un formulario rellenable a través de una página web segura. Resultados. En los tres años en los que ha estado activa la base se han recogido un total de 1149 casos de HSA espontánea recogidos por 14 centros participantes. Se ha estimado que es necesario aproximadamente un tiempo de 3.4 minutos para rellenar cada caso. En cuanto a sus características generales la serie es similar a otras series hospitalarias no seleccionadas. La edad media de los enfermos incluidos es de unos 55 años y la relación mujer:hombre 4:3. En cuanto a la gravedad del sagrado inicial un 32% de los enfermos se encontraba en mal grado clínico (WFNS = 4 ó 5). El 5% de los pacientes fallecieron antes de realizarse una angiografía que confirmara el origen aneurismático del sangrado. Se confirmó el origen aneurismático en el 76% de los pacientes mientras que en el 19% no se encontró ninguna lesión vascular responsable del sangrado, siendo clasificados como HSA idiopática. En los pacientes en los que se detectó un aneurisma su tratamiento fue endovascular en el 47% de los casos, quirúrgico en el 39, mixto en el 3% y no recibieron tratamiento de su aneurisma el 11% de los pacientes por fallecimiento precoz. En cuanto a su evolución, la mortalidad global de la serie se sitúa en el 22%. Sólo el 40% de los enfermos con HSA aneurismática presentaron una buena evolución (GOS=5). Conclusiones. La HSA espontánea continúa siendo una enfermedad con alta morbilidad y mortalidad. Esta base de datos puede ser un instrumento para conocer mejor sus características en nuestro medio y mejorar sus resultados, ya que se trata de una serie multicéntrica hospitalaria no seleccionada. Sería pues recomendable que esta base constituyera el germen de un registro nacional de HSA espontánea. Introduction. Subarachnoid haemorrhage is one of the most severe neurosurgical diseases. Its study is crucial for improving the care of these patients in our environment. With this goal the Group for the Study of Neurovascular Pathology of the Spanish Society for Neurosurgery (SENEC) decided to create a multicenter registry for the study of this disease. Materials and methods. In this database we have prospectively included all cases with spontaneous subarachnoid haemorrhage admitted to the participant hospitals from November 2004 to November 2007. The fields to be included in the database were selected by consensus, including age, past medical history, clinical characteristics at admission, radiological characteristics including presence or absence of an aneurysm and its size and location, type and complications of the aneurysm treatment, outcome assessed by the Glasgow Outcome Scale (GOS) at discharge and six months after the bleeding as well as the angiographic result of the aneurysm treatment. All fields were collected by means of an electronic form posted in secure web page. Results. During the three years of study a total of 1149 patients have been included by 14 Hospitals. The time needed to fill in a patient in the registry is approximately 3.4 minutes. This series of patients with spontaneous SAH is similar to other non-selected in-hospital series of SAH. The mean age of the patients is 55 years and there is a 4:3 female to male ratio. In relation to the severity of the bleeding 32% of the patients were in poor clinical grade at admission (WFNS 4 or 5). 5% of the patients died before angiography could be performed. An aneurysm was confirmed as the origin of the bleeding in 76% of the patients (aSAH), while in 19% of the patients no lesion was found in the angiographic studies and were thus classified as idiopathic subarachnoid hemorrhage (ISAH). Of those patients with aSAH, 47% were treated endovascularly, 39% surgically, 3% received a combined treatment and 11% did not receive any treatment for their aneurysm because of early death. Regarding outcome, there is a 22% mortality in the series. Only 40% of the patients with aSAH reached a good outcome at discharge (GOS = 5). Conclusions. Spontaneous SAH continues to be a disease with high morbidity and mortality. This database can be an ideal instrument for improving the knowledge about this disease in our environment and to achieve better results. It would be desirable that this database could in the future be the origin of a national registry of spontaneous SAH

Early Developing Pig Embryos Mediate Their Own Environment in the Maternal Tract

The maternal tract plays a critical role in the success of early embryonic development providing an optimal environment for establishment and maintenance of pregnancy. Preparation of this environment requires an intimate dialogue between the embryo and her mother. However, many intriguing aspects remain unknown in this unique communication system. To advance our understanding of the process by which a blastocyst is accepted by the endometrium and better address the clinical challenges of infertility and pregnancy failure, it is imperative to decipher this complex molecular dialogue. The objective of the present work is to define the local response of the maternal tract towards the embryo during the earliest stages of pregnancy. We used a novel in vivo experimental model that eliminated genetic variability and individual differences, followed by Affymetrix microarray to identify the signals involved in this embryo-maternal dialogue. Using laparoscopic insemination one oviduct of a sow was inseminated with spermatozoa and the contralateral oviduct was injected with diluent. This model allowed us to obtain samples from the oviduct and the tip of the uterine horn containing either embryos or oocytes from the same sow. Microarray analysis showed that most of the transcripts differentially expressed were down-regulated in the uterine horn in response to blastocysts when compared to oocytes. Many of the transcripts altered in response to the embryo in the uterine horn were related to the immune system. We used an in silico mathematical model to demonstrate the role of the embryo as a modulator of the immune system. This model revealed that relatively modest changes induced by the presence of the embryo could modulate the maternal immune response. These findings suggested that the presence of the embryo might regulate the immune system in the maternal tract to allow the refractory uterus to tolerate the embryo and support its development

Human Endometrial CD98 Is Essential for Blastocyst Adhesion

BACKGROUND: Understanding the molecular basis of embryonic implantation is of great clinical and biological relevance. Little is currently known about the adhesion receptors that determine endometrial receptivity for embryonic implantation in humans. METHODS AND PRINCIPAL FINDINGS: Using two human endometrial cell lines characterized by low and high receptivity, we identified the membrane receptor CD98 as a novel molecule selectively and significantly associated with the receptive phenotype. In human endometrial samples, CD98 was the only molecule studied whose expression was restricted to the implantation window in human endometrial tissue. CD98 expression was restricted to the apical surface and included in tetraspanin-enriched microdomains of primary endometrial epithelial cells, as demonstrated by the biochemical association between CD98 and tetraspanin CD9. CD98 expression was induced in vitro by treatment of primary endometrial epithelial cells with human chorionic gonadotropin, 17-β-estradiol, LIF or EGF. Endometrial overexpression of CD98 or tetraspanin CD9 greatly enhanced mouse blastocyst adhesion, while their siRNA-mediated depletion reduced the blastocyst adhesion rate. CONCLUSIONS: These results indicate that CD98, a component of tetraspanin-enriched microdomains, appears to be an important determinant of human endometrial receptivity during the implantation window