Design of Surface Modifications for Nanoscale Sensor Applications

Nanoscale biosensors provide the possibility to miniaturize optic, acoustic and electric sensors to the dimensions of biomolecules. This enables approaching single-molecule detection and new sensing modalities that probe molecular conformation. Nanoscale sensors are predominantly surface-based and label-free to exploit inherent advantages of physical phenomena allowing high sensitivity without distortive labeling. There are three main criteria to be optimized in the design of surface-based and label-free biosensors: (i) the biomolecules of interest must bind with high affinity and selectively to the sensitive area; (ii) the biomolecules must be efficiently transported from the bulk solution to the sensor; and (iii) the transducer concept must be sufficiently sensitive to detect low coverage of captured biomolecules within reasonable time scales. The majority of literature on nanoscale biosensors deals with the third criterion while implicitly assuming that solutions developed for macroscale biosensors to the first two, equally important, criteria are applicable also to nanoscale sensors. We focus on providing an introduction to and perspectives on the advanced concepts for surface functionalization of biosensors with nanosized sensor elements that have been developed over the past decades (criterion (iii)). We review in detail how patterning of molecular films designed to control interactions of biomolecules with nanoscale biosensor surfaces creates new possibilities as well as new challenges

Microcavity supported lipid membranes: versatile platforms for building asymmetric lipid bilayers and for protein recognition

Microcavity supported lipid bilayers (MSLB) are contact-free membranes suspended across aqueousfilled pores that maintain the lipid bilayer in a highly fluidic state and free from frictional interactions with substrate. Such platforms offer the prospect of liposome-like fluidity with the compositional versatility and addressability of supported lipid bilayers and thus offer significant opportunity for modelling membrane asymmetry, protein-membrane interactions and aggregation at the membrane interface. Herein, we evaluate their performance by studying the effect of transmembrane lipid asymmetry on lipid diffusivity, membrane viscosity and cholera toxin- ganglioside recognition across six symmetric and asymmetric membranes including binary compositions containing both fluid and gel phase, and ternary phase separated membrane compositions. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy (FLCS) was used to determine the lateral mobility of lipid and protein, and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) enabled detection of protein-membrane assembly over the nanomolar range. Transmembrane leaflet asymmetry was observed to have profound impact on membrane electrochemical resistance where the resistance of a ternary symmetric phase separated bilayer was found to be at least 2.6 times higher than the asymmetric bilayer with analogous composition at the distal leaflet but where the lower leaflet comprised only 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC). Similarly, the diffusion coefficient for MSLBs was observed to be 2.5 fold faster for asymmetric MSLBs where the lower leaflet is DOPC alone. Our results demonstrate that interplay of lipid packing across both membrane leaflets and concentration of GM1 both affect the extent of cholera toxin aggregation and consequent diffusion of the cholera-GM1 aggregates. Given that true biomembranes are both fluidic and asymmetric, MSLBs offer the opportunity for building greater biomimicry into biophysical models and the approach described demonstrates the value of MSLBs in studying aggregation and membrane associated multivalent interactions prevalent in many carbohydrates mediated processes

Investigations of tethered bilayer lipid membranes for their potential use in biosensing devices

Tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) provide a model platform for the investigation ofvarious membrane related processes. They are especially suited to study the incorporation and function of ion channel proteins, where a high background resistance ofthe membrane is essential. In this study, the electrochemical sealing properties ofnew tBLMs are characterised and improved. Membranes of different compositions have been studied for their ability to host ion channels using Surface Plasmon Resonance Spectroscopy (SPR) and Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS). Several membrane proteins such as carriers, channels and pores were functionally incorporated. and investigated in different tBLM architectures. As a first test of the functionality of the membrane assembly the carrier valinomycin and the channel gramicidin were incorporated and their ion selectivity demonstrated with EIS. The transmembrane fragment M2 of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) was embedded into a tBLM by fusion of proteoliposomes with different monolayers. The pore was selective for small monovalent cations, while bulky ions could not pass the membrane. The tBLMs provide a platfonn for the study of ion transport phenomena and ligand interactions of channels such as the nAChR, as the presented method should be generally applicable to other membrane proteins. Incorporation of a-haemolysin, a toxin that leads to lysis of cells by formation of large pores in the cell m,e. mbrane, was achieved. The tBLM provides a fluidity that allows incorporating the pores, while at the same time providing a submembrane space between the solid support and the bilayer. This offers the ability to measure ion currents through the incorporated channels. A membrane architecture specially suited for an enhanced functionality ofthe pores was designed and characterised. Downsizing the membrane area on Jl-electrodes gave gigaohmic membrane resistances, showing sealing properties comparable to BLMs. This gigaseal allowed for highly f sensitive measurements ofcurrents through incorporated a-haemolysin pores. With this system, a biosensor with modified biological receptors as actual sensing units is feasible, whereas the high stability opens the perspective of long-term experiments and continuous monitoring. Thus, a major step towards the use of proteins as stochastic sensing elements in prospective biosensor applications has been accomplished.EThOS - Electronic Theses Online ServiceGBUnited Kingdo

Modified tethered bilayer lipid membranes for detection of pathogenic bacterial toxins and characterization of ion channels

EThOS - Electronic Theses Online ServiceGBUnited Kingdo

Recent Advances in Hybrid Biomimetic Polymer-Based Films: from Assembly to Applications

Biological membranes, in addition to being a cell boundary, can host a variety of proteins that are involved in different biological functions, including selective nutrient transport, signal transduction, inter- and intra-cellular communication, and cell-cell recognition. Due to their extreme complexity, there has been an increasing interest in developing model membrane systems of controlled properties based on combinations of polymers and different biomacromolecules, i.e., polymer-based hybrid films. In this review, we have highlighted recent advances in the development and applications of hybrid biomimetic planar systems based on different polymeric species. We have focused in particular on hybrid films based on (i) polyelectrolytes, (ii) polymer brushes, as well as (iii) tethers and cushions formed from synthetic polymers, and (iv) block copolymers and their combinations with biomacromolecules, such as lipids, proteins, enzymes, biopolymers, and chosen nanoparticles. In this respect, multiple approaches to the synthesis, characterization, and processing of such hybrid films have been presented. The review has further exemplified their bioengineering, biomedical, and environmental applications, in dependence on the composition and properties of the respective hybrids. We believed that this comprehensive review would be of interest to both the specialists in the field of biomimicry as well as persons entering the field

The Effect Of Liposome Phospholipid Content On The Formation Of Tethered Lipid Membranes

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2012Biyolojik membranlar, oldukça karmaşık ve dinamik yapısıyla, hücre canlılığının çok önemli bir bileşenidir. Hücre canlılığının ve özgün hücre işlevlerinin sürekliliğini mümkün kılan çok önemli bazı fonksiyonları yerine getirir. Karmaşık yapılarından dolayı, farklı membran bileşiklerinin çalışılabilmesi için yeni yapay lipit membran modellerinin geliştirilmesi çok önemlidir. Katı bir yüzeye bağlı lipit membran modeli (tBLMs), çift katmanlı lipit membranların taklit edilmesi için uygun bir ortam sağlar. Bu yapay lipit membran modelinde, çift katmanlı lipit membran yüzeyden hidrofilik bir ara tutucu molekülle ayrılır. Böylece lipit membranın katı yüzeyden etkilenmesi ve stabilitesinin artması amaçlanır. tBLMs, biyosensör uygulamaları veya biyomembranların ve membran proteinlerinin yapı ve fonksiyonlarının araştırılmasında kullanılan bir yapay lipit membran modelidir. Memeli hücre membranları 1000 değişik fosfolipid çeşidi içerir. Bu kadar çeşitli fosfolipid miktarı, membranın akışkanlığını ve membrana gömülü olan proteinlerin işlevlerini belirler. Bir çok memeli hücresinin plazma membranında, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE) ve fosfatidilserin (PS) en çok bulunan fosfolipitlerdir. Bunlardan sadece PS negatif yük taşır, diğer ikisi fizyolojik pH’ta elektriksel olarak nötr haldedir: bir negatif bir de pozitif yük taşırlar (zwitteriyonik). Fosfatidilkolin (PC), en çok bulunan fosfolipid çeşididir ve memeli hücre membranlarının %40-50’sini oluşturur. PC, primer hücre membran bileşiklerinin üretilmesinde rol oynar, aynı zamanda asetilkolin sentezindeki başlıca bileşendir. Fosfatidiletanolamin (PE), ikinci en sık bulunan fosfolipid çeşididir ve memeli hücre membranlarının %20-50’sini oluşturur. PE, membranlarda çok sayıda yapısal rol oynar. Fosfatidilserin (PS), nicel olarak az sayıda bulunur ve memeli hücre membranlarının %2-10’unu oluşturur. PS, sinir sistemi ve görme duyusunun oluşumunda çok önemli rol oynar. Ayrıca, programlı hücre ölümünde (apoptoz) kullanılan bileşenlerden biridir. Normalde, sitosolik plazma membranında hapsedilmiş olarak bulunan fosfatidilserin, apoptoz esnasında hücredışı tek katmanına yer değiştirir. Hücre yüzeyinde açıkta kalan PS, çevredeki makrofaj gibi hücrelere sinyal gönderir ve bu şekilde hücrenin parçalanmasına katkıda bulunur. Yüzey plasmon rezonans (SPR), moleküller arası etkileşimlerin araştırılmasında ve kimyasal ve biyolojik analitlerin tespit edilmesinde kullanılan optik bir cihazdır. SPR cihazının çalışma prensibinin temeli olan polarize ışık, yüzeyi altın kaplı bir prizmaya gönderildiğinde ışığın bir kısmı absorplanmakta, bir kısmı da yansımaktadır. Yansıyan ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı denir. Metal yüzeyiyle temas halinde ortamın özelliklerinin değişmesi veya yüzeyde madde birikimi olması durumunda rezonans açısı değişmekte ve bu değişiklik yüzeyde olan değişikliklerin anlaşılmasında kullanılabilmektedir. Kuvars kristal mikroterazi (QCM-D), kütlesel değişiklikleri, bir elektrik sinyaline çevirebilen çok kullanışlı bir yaklaşımdır. QCM-D cihazının bünyesinde bulunan kuvars kristalin piezoelektrik özelliği çalışma prensibinin temelidir. Piezoelektrik etki, asimetrik bir kristalin elektrik potansiyelinin uygulanmasıyla deformasyona uğramasıdır. Kuvars kristaller mekanik olarak deforme olduğunda, yüzeyinde elektiriksel bir potansiyel oluşur ve uygun bir elektrik devresine bağlanırsa kristalin kütlesine ve şekline bağlı olan sabit bir frekansta titreşim yapar. Yüzeydeki kütle değişimleri, rezonans frekansındaki sapmaya dönüştürülerek yorumlanır. Rezonans frekansına ek olarak, yüzeye bağlanan katmanların viskoelastik özellikleri, enerji yitimi (D) parametresiyle ölçülür. ∆D değerindeki artış yüzeyde vizkoelastisitesi yüksek analitlerin bulunduğunu; bu değerdeki düşme ise yüzeyde daha katı (rijit) bir yapının oluştuğunu gösterir. Bu çalışmada, farklı kompozisyonlarda ve farklı konsantrasyonlarda lipozomlar üretilerek katı bir yüzeye bağlı lipit zar modeli (tBLMs) oluşturuldu ve yüzeye tutunum kinetiklerinin belirlenmesi için yüzey plazmon rezonans (SPR) ve kuvars kristal mikroterazi (QCM-D) yöntemleri kullanıldı. Lipozomları oluştururken 3 farklı fosfolipit molekülü kullanıldı (fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE) ve fosfatidilserin (PS)). Lipit kompozisyonunun, çift katmanlı lipit membranın viskoelastik özelliklerini etkileyeceği düşünüldü ve bu özellik QCM-D cihazı ile tanımlandı. tBLMs, çalışma grubumuzun optimize ettiği prosedüre göre oluşturuldu. Buna göre; altın kaplı SPR ve QCM yüzeyleri dimetil sülfoksitte (DMSO) çözünmüş 3, 3′-dithiodipropionic acid di(N-hydroxy succinimide ester) (DTSP) molekülü ile aktive edildi (DMSO 1mM). DTSP, altın yüzeye tiyol grubu ile kendi kendine bağlanan bir moleküldür ve sistemimizin birinci katmanını oluşturur. İkinci katmanın oluşturulmasında; fosfat kafasına polietilenglikol bağlanmış ve bu uçta bir amino grubu taşıyan bir fosfolipit molekülü (DSPE-PEG), DTSP kaplı yüzey ile inkübe edildi. Bu molekül, tBLMs ile yüzey arasına bir mesafe konulması amacı ile kullanıldı. Üçüncü ve son katman, farklı kompozisyonlarda ve farklı konsantrasyonlarda lipozomların yüzeye gönderilmesiyle oluşturuldu. Lipozomlar zwitteriyonik (çift kutuplu) (PC/PE) ve anyonik yapıda (PC/PS) ve farklı konsantrasyonlarda (90:10, 75:25, 50:50 ve tam tersi) olmak üzere, 100 nm gözenekli membranlar kullanılarak ekstrüzyon yöntemiyle oluşturuldu. İlk olarak, çalışma grubumuz tarafından adsorbsiyon kinetiği ve tBLMs oluşumu daha önce gözlenen PC lipozomların tBLMs oluşumuna etkisi gözlendi. Daha sonra, elde edilen veriler PC/PE ve PC/PS lipozomlarının tBLMs oluşumu üzerindeki etkisinin araştırılması için referans olarak kullanıldı. Zwitteriyonik PC/PE lipozomların araştırılması sırasında, PC lipozomlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek refraktif indeks artışı gözlemlendi. Elde edilen verilerin daha iyi yorumlanabilmesi için ayrıca QCM-D analizleri ile bütünleştirildi. 75PC/25PE ve PE lipozomlardan alınan QCM sonuçlarına göre, PE konsantrasyonu arttıkça ∆D değerinde artış ve ∆f değerinde düşüş gözlemlendi. Bu sonuçlar gösteriyor ki, artan PE konsantrasyonu lipozomların yüzeyde bozulmadan kalmasına yolaçmaktadır. Ayrıca, çift katman oluşumu daha düşük PE konsantrasyonunda daha avantajlıdır. Anyonik PC/PS lipozomların tBLMs oluşumu üzerindeki etkisi incelendiğinde, PC lipozomlara göre oldukça yüksek refraktif index değerlerinin alındığı görüldü. Buna ek olarak, 75PC/25PS ve PS lipozomların QCM-D tekniği ile ölçümleri gerçekleştirildi. QCM-D sonuçlarına göre, lipozom içeriğindeki PS miktarı arttıkça büyük miktarlarda ∆D değerinde artış ve ∆f değerinde düşüş olduğu görüldü. Buna ek olarak, yüzeyde bağlanmadan kalan lipit moleküllerinin uzaklaştırılması için yapılan yıkama sonrasında ∆f ve ∆D sinyallerinde değişim olmadığı gözlendi. Yıkama sırasında frekanstaki artma lipozomların yüzeye yayıldığını ve içinde hapsolan suyun sistemden uzaklaştığını göstermektedir. Bu durumda, yıkama sonrasında frekansta değişimin olmaması ve ∆f-∆D değerlerinin beklenenden çok yüksek olması, lipozomların yüzeyde bozulmadan kaldığını belirtir. PC/PS lipozomların yüzeye yayılmasını ve tBLMs oluşumunu tetiklemek amacıyla yıkama sonrasında yüzeye % 70 etanol çözeltisi gönderildi ve etkisi SPR ile gözlendi. Fakat bu koşullarda yüzeydeki lipozomların tamamen yıkanmadığı gözlemlendi. Lipozom içeriğinden farklı olarak ayrıca lipozom boyutunun sistem üzerindeki etkisi de SPR cihazı kullanılarak incelendi. Bunun için, 50 nm çaplı 90PC/10PE ve 75PC/25PE lipozomlar kullanıldı. Sonuç olarak, her iki konsantrasyonda da lipozomların yüzeye gönderildiği sırada refraktif indekste artış olduğu, fakat daha sonra yıkama yapılmamasına rağmen refraktif indeksin ilk baştaki değere düştüğü gözlendi. Lipozom boyutunun yarıya düşürülmesinin lipozomların yüzeyle etkileşmesine rağmen bu etkileşimin çok kararlı olmamasına ve büyük ihtimalle elastisitesi daha az olan bu lipozomların yüzeye yayılmayarak hızla yıkanmasına yol açtığı düşünüldü.Biological membranes are vital structures for cell life. Because of the complexity of biological membranes, it is very important to develop model membrane systems to study membrane components. Tethered lipid bilayer membranes (tBLMs) on planar surfaces provide an important media to mimic the lipid bilayer membrane in vitro. tBLMs can be used for applications such as biosensors or as a model system to study the structure and function of biomembranes and membrane proteins. Techniques such as surface plasmon resonance (SPR) and quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D) provide important information about adsorption kinetics of liposomes on the surface by using refractive index and dissipation (∆D) -and frequency (∆f) change values. In addition, ∆D and ∆f values allow determining viscoelastic properties of lipid components on the surface. In this work, the properties of tethered lipid bilayer membranes (tBLMs) constructed by different phospholipids (saturated phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) and phosphotidylserine (PS)) were studied and the whole process was followed by SPR. Lipid composition is expected to affect the bilayer properties like viscoelastic properties. This characteristic was determined by the help of QCM-D. tBLMs were formed according to the procedure optimized in our group. In order to construct tBLMs, either SPR gold covered slides or QCM gold covered crystals were activated with 3, 3′-dithiodipropionic acid di(N-hydroxy succinimide ester) (DTSP) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 1mM). DTSP self-assembled on Au surfaces via its thiol groups. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino poly ethyleneglycol)-2000] (DSPE-PEG) was then incubated with DTSP covered surfaces to form second layer on the surface and it was attached on it to serve as tethers for the tBLMs. To construct final layer, liposomes with different composition and different compounds (PC/PE and PC/PS: 90:10, 25:75, 50:50 and vice versa) were produced by the help of an extruder using 100 nm membranes and spread over the modified surface. PC/PE liposomes showed higher refractive index and ∆D and ∆f values than PC liposomes. This states that, increasing PE concentration affects membrane fluidity and led liposomes to stably attach to the surface without forming bilayer, whereas bilayer formation was more favored in lower PE ratios. Likewise, adding PS to PC liposomes caused the formation of intact multi-vesicles layer on the surface. This can be predicted from SPR and QCM-D results, because refractive index value of PC/PS liposomes was significantly higher than PC and PC/PE liposomes and ∆D and ∆f values increased by adding more PS to PC liposomes. There was no change in frequency values even after rinsing. In addition, 70% of ethanol solution was used to trigger vesicle fusion on 25PC/75PS liposomes. Unfortunately, the whole unattached lipids were washed off from the system at this concentration. Additionally, the effect of vesicle size on the formation of tBLMs was investigated. Fot this, 50 nm diameter of liposomes (90PC/10PE and 75PC/25PE) were prepared. Decreasing vesicle size from 100 nm to 50 nm affected vesicle adsorbtion to the surface negatively. In conclusion, the phospholipid content of liposomes have a great impact on the behavior of liposomes and different parameters like the size, fluidity and interaction with different ions affect this behavior. Since the cell membrane of different tissues have different compositions, these parameters should be investigated in more detail.Yüksek LisansM.Sc

In Situ Monitoring of the Catalytic Activity of Cytochrome c Oxidase in a Biomimetic Architecture

AbstractCytochrome c oxidase (CcO) from Paracoccus denitrificans was immobilized in a strict orientation via a his-tag attached to subunit I on a gold film and reconstituted in situ into a protein-tethered bilayer lipid membrane. In this orientation, the cytochrome c (cyt c) binding site is directed away from the electrode pointing to the outer side of the protein-tethered bilayer lipid membrane architecture. The CcO can thus be activated by cyt c under aerobic conditions. Catalytic activity was monitored by impedance spectroscopy, as well as cyclic voltammetry. Cathodic and anodic currents of the CcO with cyt c added to the bulk solution were shown to increase under aerobic compared to anaerobic conditions. Catalytic activity was considered in terms of repeated electrochemical oxidation/reduction of the CcO/cyt c complex in the presence of oxygen. The communication of cyt c bound to the CcO with the electrode is discussed in terms of a hopping mechanism through the redox sites of the enzyme. Simulations supporting this hypothesis are included

Chemoelectromechanical Actuation in Conducting Polymer Hybrid with Bilayer Lipid Membrane

Biological and bio-inspired systems using ion transport across a membrane for energy conversion has inspired recent developments in smart materials. The active mechanism in bioderived materials is ion transport across an impermeable membrane that converts electrochemical gradients into electrical and mechanical work. In addition to bioderived materials, ion transport phenomenon in electroactive polymers such as ionomeric and conducting polymers produces electromechanical coupling in these materials. Inspired by the similarity in transduction mechanism, this thesis focuses on integrating the ion transport processes in a bioderived material and a conducting polymer for developing novel actuation systems. The integrated membrane has a bilayer lipid membrane (BLM) formed on a conducting polymer, and the proteins reconstituted in the BLM regulate ion transport into the conducting polymer. The properties of the polymer layer in the integrated device are regulated through a control signal applied to the bioderived layer and hence the hybrid membrane resembles an ionic transistor. Due to the bioderived nature of this device, it is referred to as a ‘bioderived ionic transistor’. The research carried out in this thesis will demonstrate the fabrication, characterization and design limitations for fabricating a chemoelectromechanical actuator using the BIT membrane. The BIT membrane has been fabricated using BLM (DPhPC) reconstituted with protein (alamethicin) to gate Na$^+$ transport into conducting polymer membrane (PPy(DBS)). In this membrane, the bioderived layer is fabricated with proteins by vesicle fusion method and conducting polymer is fabricated by electropolymerization. The bioderived layers, the conducting polymer layers and the hybrid membrane are characterized using electrochemical measurements such as cyclic voltammetry, chronoamperometry, and electrochemical impedance spectroscopy. The fabrication, characterization and design effort presented in this thesis focuses on the integration of ion transport through the bioderived membrane into volumetric expansion and bending actuation. The characterization efforts are supported by empirical and physics-based models to represent the input-output relationship for both PPy(DBS) actuator and bioderived membrane, and design rules for the proposed actuation platforms are specified. The electropolymerized PPy(DBS) actuator is anticipated to be used in a bicameral device with the chambers kept separated by the DPhPC-alamethicin bioderived membrane. The relationship between the gradient potential, ionic current through the gate, ion concentration, ion transport coefficient in the conducting polymer layer, and the induced tip displacement in the polymer has been concluded from experiments and fitted to the actuation system model. This thesis will also address future directions for this research and anticipated applications for this hybrid actuation concept, such as artificial muscle, drug delivery