El DNA es pot manipular

Per comprendre les possibilitats que ofereix l'enginyeria genètica, es necessita primer conèixer les eines que permeten la manipulació dels àcids nucleics. En la primera part d'aquest capítol es farà un repàs d'algunes d'aquestes eines: els plasmidis, petites molècules de DNA que podem trobar en determinats organismes unicel·lulars; els enzims de restricció, proteïnes típicament bacterianes que fragmenten el DNA per punts concrets; la DNA-ligasa, proteïna vírica amb la capacitat d'unir-los de nou; l'electroforesi en gels d'agarosa, que pot separar per mides diferents fragments de DNA, i, per acabar, la PCR, que ens permet amplificar qualsevol DNA de seqüència coneguda. En la segona part es presenten alguns exemples de les aplicacions que poden tenir aquestes tècniques.To better understand the possibilities that come from genetic engineering, it is useful to know the main tools for the nucleic acid manipulation. In the first part of this chapter it will be done a revision of some of this tools: the plasmids, a little pieces of DNA of some microorganisms; the restriction enzymes, a typical bacterial protein with the capability to fragment DNA molecules in appropriate points; the DNA ligase from T4 phagus, a protein with the ability to regenerate joints between two DNA fragments; the electrophoreses, that allows to see the DNA and to separate by size; and lastly the PCR that could amplify any DNA of known sequence. In the second part of this chapter it will be presented some examples of real applications of these techniques

Expressió, purificació i assajos cristal·logràfics de la proteïna HMGA1b(1-90)

Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són un grup de proteïnes cromosòmiques no histones que van ser anomenades així degut a la seva mobilitat electroforètica. Aquest conjunt de proteïnes està dividit en tres grans subfamílies: les HMGA, les HMGB i les HMGN. Les proteïnes HMGA poden modificar la conformació espacial del DNA, regulant (positivament o negativament) l’expressió de nombrosos gens i influint en molts processos cel·lulars normals com ara el creixement, proliferació, diferenciació i mort cel·lular, i la reparació del DNA. També estan relacionades amb diferents processos patològics, entre ells l’obesitat, la diabetis, l’arteriosclerosi i el càncer. S’ha observat com, en molts tipus de càncers, hi ha una sobre-expressió d’aquestes proteïnes. Se sap que la interacció HMGA-DNA es dóna a través d’uns motius d’unió al DNA anomenats “AT-hooks”, els quals s’uneixen a regions riques en adenines (A) i timines (T) del DNA. En les proteïnes HMGA es troben tres motius AT-hook. Per a comprendre millor el mecanisme d’acció d’aquestes proteïnes, és important conèixer l’estructura tridimensional que formen els complexos DNA-proteïna. Amb aquesta finalitat es persegueix l’obtenció de co-cristalls de la proteïna HMGA1b(1-90) amb oligonucleòtids sintètics rics en seqüències ATs. En primer lloc, s’ha expressat la proteïna HMGA1b(1-90) a partir d’un cultiu bacterià d’Escherichia coli. Seguidament, s’ha purificat aquesta proteïna fins l’alt grau de puresa requerit utilitzant cromatografia de bescanvi iònic seguida de cromatografia de gel-filtració. Posteriorment, s’han realitzat assajos cristal·logràfics per a obtenir els co-cristalls necessaris per a poder resoldre, mitjançant difracció de raigs X, l’estructura tridimensional del complex oligonucleòtid-proteïna. Els dos oligonucleòtids sintètics emprats en aquest projecte són l’A2TA2T2AT2 i el G3A3T3C3. En una última etapa del projecte, s’han realitzat també assajos cristal·logràfics amb un pèptid sintètic que es correspon amb el tercer “AThook” de la proteïna d’estudi i l’oligonucleòtid A2TA2T2AT2

In silico modeling of chemical and biological interactions at different scales

En les últimes dècades, molts països han imposat regulacions sobre els efectes potencials de les substàncies químiques envers la salut humana i els criteris mediambientals. A més a més, tenint en compte el temps necessari per a les proves d’avaluació dels efectes de gran nombre de productes químics i el seu cost ha produït un ràpid augment en el nombre de models computacionals, que relacionen l'estructura de les substàncies químiques amb la seva activitat biològica. Actualment existeixen els models de relació estructura-activitat (SAR) per a productes químics, utilitzant un enfocament similar s’ha desenvolupat un nou model i generat conjunts d'alertes metabòliques que es puguin utilitzar juntament amb els mètodes Q(SAR). Aquest treball presenta regles SAR per a la predicció de mutagenicitat in vitro, juntament amb alertes metabòliques per a la predicció in vivo. Permetent, obtenir una idea preliminar sobre si un producte químic exhibeix el mateix comportament mutagènic in vitro i in vivo. Entre els compostos químics, les nanopartícules, també s'estan utilitzant cada cop més a través de diferents classes de productes usats pels consumidors. En un context fisiològic, la corona de les proteïnes constitueix la interfície entre les nanopartícules i les cèl·lules. En aquest treball, s'han utilitzat les propietats fisicoquímiques de la corona de les proteïnes per tal de desenvolupar un model capaç de predir l'associació cel·lular. Finalment, aquesta tesi es centra en el tema de la resistència als fàrmacs en els bacteris, que s'ha convertit en un assumpte d'interès global. Amb l'augment de la resistència dels bacteris als antibiòtics, és important disposar d'informació sobre la resposta que les noves proteïnes bacterianes tindrien sobre els antibiòtics actualment disponibles. Pel qual, en aquest treball s'ha desenvolupat un mètode d'alineació lliure per millorar la classificació en perfils de resistència de les proteïnes bacterianes, en base a les seves propietats fisicoquímiques.En las últimas décadas, muchos países han impuesto regulaciones sobre los efectos potenciales de las sustancias químicas con respecto a la salud humana y a criterios medio ambientales. Además, el tiempo necesario para las pruebas de evaluación de los efectos de un gran número de productos químicos y su coste ha producido un rápido aumento en el número de modelos computacionales que relacionan la estructura de las sustancias químicas con su actividad biológica. Actualmente existen los modelos de relación estructura-actividad (SAR) para productos químicos, utilizando un enfoque similar se ha desarrollado un nuevo modelo para generar conjuntos de alertas metabólicas que puedan utilizarse junto con los métodos Q(SAR). Este trabajo presenta reglas SAR para la predicción de mutagenicidad in vitro, junto con alertas metabólicas para la predicción también in vivo. Permitiendo, además, obtener una idea preliminar de si un producto químico exhibe el mismo comportamiento mutagénico in vitro e in vivo. Entre los compuestos químicos, las nanopartículas, también se están utilizando cada vez más en diferentes clases de productos usados por los consumidores. En términos fisiológicos, la corona de las proteínas constituye la interfaz entre las nanopartículas y las células. En este trabajo se ha desarrollado un modelo con las propiedades físico-químicas de la corona de las proteínas para predecir la asociación celular. Por último, esta tesis se centra en el tema de la resistencia a los fármacos en las bacterias, que se ha convertido en un asunto de interés global. Con el aumento de la resistencia de las bacterias a los antibióticos, es importante disponer información sobre la respuesta que las nuevas proteínas bacterianas tendrán sobre los antibióticos actualmente disponibles. Por esto se ha desarrollado un método de alineación libre para mejorar la clasificación en perfiles de resistencia de las proteínas bacterianas en base a sus propiedades físico-químicas.In the past decades, government, society and industry at large have taken keen interest in the impact at different scales that exposure to chemicals has on humans and environment. Many countries governments have imposed regulations as per which it has become important to establish the potential effects of these chemical entities with respect to human health and environmental endpoints. Given the time taken by traditional tests, costs and large number of chemicals to be evaluated, there has been a rapid growth in the number of computational models that link the structure of chemicals to their biological activity. To extend the basis of knowledge that currently exists in Structure Activity Relationship (SAR) models for chemicals, a similar approach was used to develop a new model and generate sets of metabolic triggers which can be used together with Q(SAR) methods. This thesis presents SAR rules for prediction of mutagenicity in vitro, along with metabolic triggers for prediction of mutagenicity in vitro and in vivo. Along with chemical compounds, nanoparticles are also being used increasingly across different classes of consumers’ products. Since, in physiological context, the protein corona constitutes the interface between the nanoparticle and cells, it plays a fundamental role in nanoparticle-cell association. In this thesis, the physicochemical properties of protein corona were used to develop a model to predict cell association. Lastly, this thesis focuses on the topic of drug resistance in bacteria, which has become a matter of global concern. With bacteria growing resistant to antibiotics at a faster pace than discovery of new antibiotics, information on the response that new bacterial proteins would have to the currently available antibiotics, based on their similarity with the known antibiotic-resistant proteins is necessary. An alignment-free method was developed to improve the resistance profile classification of bacterial proteins based on their physicochemical properties

Biosíntesi de glicolípids de membrana en Mycoplasma genitalium: expressió, purificació i caracterització d'una glicosiltransferasa processiva en la formació de glicosildiacilglicerols

Aquesta tesi se centra en l’estudi de les possibles glicosiltransferases de Micoplasma genitalium involucrades en la síntesi de glicolípids. Aquests compostos formen part de la membrana plasmàtica del microorganisme, únic envolcall que el protegeix del seu entorn ja que no disposa de paret cel•lular. La hipòtesi sobre la qual s’ha desenvolupat el treball és la possibilitat que aquests glicolípids i els enzims encarregats de la seva producció, les glicosiltransferases, siguin essencials per a la viabilitat del micoplasma i per tant, la seva inhibició sigui una forma d’eradicar les infeccions causades pel patògen. De les tres seqüències classificades com a glicosiltrasferases en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 i mg517, s’ha determinat que mg025 és l’únic dels tres gens que no és essencial per al bacteri, tot i que s’ha observat que els tres s’expressen tant a la fase exponencial com a la fase estacionària del seu creixement. La funció de mg025 i mg060 és encara desconeguda, mentre que mg517 és la glicosiltransferasa encarregada de la síntesi dels dos principals glicolípids del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) i el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En aquesta tesi s’ha desenvolupat un protocol d’expressió per a la glicosiltransferasa codificada per mg517, anomenada GT-MG517, el qual fa ús d’una coexpressió amb xaperones i solubilitza la proteïna amb detergents, glicerol i una elevada força iònica. Aquesta metodologia ha estat necessària ja que GT-MG517 és una proteïna associada a membrana i la seva expressió recombinant en E.coli presenta dificultats. La proteïna s’ha purificat mitjançant cromatografia d’afinitat per Ni, tot i que el grau de puresa assolit no ha estat suficient per a intentar la seva cristal•lització. Les diverses proves realitzades usant cromatografia d’exclusió molecular han permès determinar que GT-MG517 forma oligòmers d’alt pes molecular. A partir de la proteïna purificada s’ha realitzat un estudi cinètic de la seva doble activitat glicosildiacilglicerolsintasa. D’aquest estudi s’extreu que GT-MG517 pot transferir un sucre, Glc o Gal, a una molècula principalment hidrofòbica, com és el DOG, i a una molècula molt més hidrofílica, com el MGlcDG. Ambdós compostos però posseeixen un alcohol primari sobre el qual té lloc la transferència creant l’enllaç (16). Amb qualsevol dels substrats acceptors provats, l’enzim presenta activitats específiques superiors si el substrat donador és UDP-Gal. L’acceptor preferit de GT-MG517 és el lípid DOG, però la glicosiltransferasa és capaç d’elongar, ja sigui amb una Glc o amb una Gal, glicolípids com el MGlcDG i el MGDEG, preferint en aquest cas el compost amb una Gal a l’extrem no reductor. Tot i això, l’afinitat de l’enzim és superior per a donadors amb Glc (KM inferiors a les dels donadors amb Gal). D’altra banda, s’ha demostrat que el lípid aniònic DOPG es comporta com a activador de l’activitat enzimática. GT-MG517 posseeix un teòric domini d’unió d’UDP-Glc a l’extrem N-terminal. Aquesta zona presenta similitud de seqüència amb altres glicosiltransferases i permet la classificació de GT-MG517 dins de la família GT-2. En canvi, el seu extrem C-terminal presenta una seqüència particular que no s’alinea amb altres proteïnes. En aquesta tesi es formula la hipòtesi que aquesta zona podria ser d’interacció amb la membrana i, a més, que aquesta interacció podria regular l’activitat enzimàtica. Per això es preparen diverses formes truncades de GT-MG517, en les quals s’eliminen alguns aminoàcids de l’extrem C-terminal, i una forma en la qual només es conserva l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc. Aquestes noves proteïnes s’expressen, solubilitzen i purifiquen aplicant el protocol establert per a la forma completa. Amb l’anàlisi dels glicolípids sintetitzats s’estableix que els deu últims aminoàcids de GT-MG517 són prescindibles per a la seva activitat, ja que les formes truncades corresponents continuen tenint la capacitat de sintetitzar glicolípids. No obstant, l’eliminació d’un nombre superior de residus, inactiva la proteïna. La purificació de l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc posa de manifest que forma oligòmers, de la mateixa forma que ho fa la proteïna completa.Esta tesis se centra en el estudio de las posibles glicosiltransferasas de Mycoplasma genitalium involucradas en la síntesis de glicolípidos. Estas moléculas constituyen parte de la membrana plasmática del miroorganismo, única estructura de protección frente al entorno ya que los micoplasmas carecen de pared celular. La hipótesis sobre la cual se ha desarrollado el trabajo es la posibilidad que los mencionados glicolípidos y las enzimas encargadas de su producción, las glicosiltransferasas, sean esenciales para la viabilidad del micoplasma y, por tanto, su inhibición sea una forma de erradicar las infecciones causadas por el patógeno. De las tres secuencias clasificadas como glicosiltransferasas en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 y mg517, se determinó que mg025 es el único de los tres genes que no es esencial para la bacteria, aunque se observó que los tres se expresan tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de su crecimiento. Se desconoce todavía la función de mg025 y mg060. En cambio, se conoce que mg517 es la glicosiltransferasa responsable de la síntesis de los dos principales glicolípidos del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) y el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En esta tesis se desarrolló un protocolo de expresión para la glicosiltransferasa codificada por mg517, llamada GT-MG517, el cual emplea una coexpresión con chaperonas y solubiliza la proteína con detergentes, glicerol y una fuerza iónica elevada. Dicha metodología fue necesaria ya que GT-MG517 es una proteína asociada a membrana y su expresión recombinante en E.coli presenta dificultades. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad por Ni pero el grado de pureza obtenido no fue suficiente para intentar su cristalización. Distintas pruebas realizadas usando cromatografía d’exclusión molecular permitieron determinar que GT-MG517 forma oligómeros de alto peso molecular. Con la proteína purificada se realizó un estudio cinético de su doble actividad glicosildiacilglicerolsintasa. De este estudio se extrae que GT-MG517 puede transferir un azúcar, Glc o Gal, a una molécula principalmente hidrofóbica, como es el DOG, y a una molécula mucho más hidrofílica, como el MGlcDG. Pese a su diferencia, los dos compuestos poseen un alcohol primario sobre el que tiene lugar la transferencia creándose el enlace (16). Con cualquiera de los sustratos aceptores probados, la enzima presenta actividades específicas superiores si el sustrato dador es UDP-Gal. El aceptor preferido de GT-MG517 es el lípido DOG, aunque la glicosiltransferasa es capaz de elongar, ya sea con una Glc o con una Gal, glicolípidos como el MGlcDG y el MGDEG, prefiriendo en este caso el compuesto con una Gal en el extremo no reductor. Aún así, la afinidad de la enzima es superior para dadores con Glc (KM inferiores a las de los dadores con Gal). Por otro lado, se demostró que el lípido aniónico DOPG se comporta como activador de la actividad enzimática. GT-MG517 posee un dominio teórico de unión de UDP-Glc en su extremo N-terminal. Esta zona presenta similitud de secuencia con otras glicosiltransferasas y permite la clasificación de GT-MG517 dentro de la familia GT-2. En cambio, su extremo C-terminal presenta una secuencia particular que no se alinea con otras proteínas. En esta tesis se formula la hipótesis que dicha zona podría ser de interacción con la membrana y, además, que dicha interacción podría regular la actividad enzimática. Por eso se prepararon distintas formas trucadas de GT-MG517, en las cuales se eliminaron algunos aminoácidos del extremo C-terminal, y una forma en la cual sólo se conservó el hipotético dominio de unión de UDP-Glc. Las nuevas proteínas se expresaron, solubilizaron y purificaron aplicando el protocolo establecido para la forma completa. Con el análisis de los glicolípidos sintetizados se determinó que los diez últimos aminoácidos de GT-MG517 eran prescindibles para su actividad, ya que las correspondientes formas truncadas conservaban su capacidad de sintetizar glicolípidos. No obstante, la eliminación de un número superior de residuos inactiva la proteína. La purificación del hipotético dominio de unión de UDP puso de manifiesto que forma oligómeros, de la misma forma en que lo hace la proteína completa.This thesis is focused on the glycolipid producing glycosyltransferases from Mycoplasma genitalium. Glycolipids are part of the microorganism plasma membrane, which is the external covering of mycoplasmas since they lack a cell wall. Our working hypothesis is that glycolipids and the enzymes responsible for their production are essential to mycoplasma. Thus, glycosyltransferase inhibition could be a way to eradicate this pathogen caused infections. There are three genes described as putative glycosyltransferases in Mycoplasma genitalium genome, mg025, mg060 and mg517. We determined that mg025 is the only one essential to the bacteria, although the three of them are expressed both during the exponential and stationary growth phases. The function of mg025 and mg060 still remains unknown, whereas mg517 codifies for the glycosyltransferase responsible for monoglycosyldiacylglycerol (MGlcDG) and diglycosyldiacylglycerol (DGlcDG) synthesis, main mycoplasma glycolipids. In this work an expression protocol for mg517 codified glycosyltransferase was designed. The protocol included chaperone coexpression and protein solubilization with detergents, glycerol and high ionic strength. This methodology was necessary since GT-MG517 is a membrane associated protein and its recombinant expression in E.coli presents some difficulties. GT-MG517 was purified by Ni affinity chromatography. However, a suitable purity degree to attempt protein crystallization was not achieved. Some experiments using size exclusion chromatography revealed that GT-MG517 forms high molecular weight oligomers. A kinetic study of the protein double glycosyldiacylglycerol synthase activity was performed. From this study we learned that GT-MG517 is able to transfer a sugar moiety, Glc or Gal, both to a hydrophobic molecule such as DOG or to a more hydrophilic compound such as MGlcDG. These acceptor substrates share a primary alcohol where the sugar transfer takes place forming a (16) bond. The enzyme presents higher specific activities when UDP-Gal acts as reaction donor, regardless of the acceptor tested. DOG is the preferred acceptor although the enzyme is able to transfer Glc or Gal moieties to glycolipids such as MGlcDG and MGDEG. In this case, the reaction is faster with acceptors with Gal in the non-reducing end. As for donor substrate, enzyme’s affinity is higher for Glc containing molecules, with lower KM values than for Gal donors. In addition, our study proved the anionic lipid DOPG to act as an enzymatic activity enhancer. GT-MG517 has a putative binding domain for UDP-Glc in the N-terminal end. This sequence is similar to other glycosyltransferases and allows its classification in Cazy’s GT-2 family. On the contrary, the C-terminal end has a particular sequence which does not match up with any other protein. Our hypothesis was that this C-terminal end of GT-MG517 could contain a membrane interaction sequence, which could at the same time modulate enzymatic activity. To test this hypothesis some truncated forms of GT-MG517, where C-terminal aminoacids had been removed, were prepared. Moreover, a form where only the putative UDP-Glc binding domain was conserved was also expressed. All these proteins were expressed, solubilized and purified with the same protocol used for the full-length form of GT-MG517. Glycolipids produced by truncated forms were analysed and results implied that the last ten aminoacids were not involved in the enzyme’s activity. Elimination of a higher number of aminoacids caused protein inactivation. When the putative UDP-binding domain was purified, it showed high molecular weight oligomers such as those developed by the complete form of the protein

Pla integral de gestió dels residus de l’Escorxador Municipal de Carhuaz (Perú)

Des de l’any 2003, s’està portant a terme un projecte pioner al Perú de separació en origen i posterior tractament dels residus sòlids urbans (RSU) per part de l’ONG Ciudad Saludable al poble de Carhuaz, a la regió d’Ancash. Anteriorment a aquesta iniciativa, els RSU s’abocaven de forma incontrolada a les immediacions del riu Santa, que passa per aquesta localitat, el qual presentava unes condicions d’insalubritat alarmants. L’any 2005, després de dos anys de posada en marxa del projecte, el riu presentava una millora considerable però amb alguns punts negres, que feien necessària una nova intervenció per tal de fer efectiva la recuperació del riu. El més important d’aquests punts, és l’escorxador de la localitat, que seguia abocant al riu la totalitat dels residus que generava. En el present document, es realitza una caracterització del tipus, quantitat i estacionalitat dels abocaments que es donen a l’escorxador de forma sistemàtica, així com de la forma en què aquests tenen lloc. Aquesta tasca s’elabora a partir d’un treball de camp efectuat anteriorment i de l’estudi de bibliografia especialitzada. A continuació s’identifiquen les problemàtiques generades per l’escorxador, s’avaluen diferents propostes de gestió per tal de solucionar-les, i s’elabora un pla de gestió en tres etapes consecutives, de les quals només es desenvolupa extensament la primera i breument les següents. Aquestes fases són: · Fase I: Segregació dels diferents tipus de residus sòlids i líquids, i gestió d’aquests; pla d’estalvi de l’aigua consumida; reforma del sistema de clavegueram, amb la inclusió d’un sistema de desbast i una canalització fins al riu. · Fase II: Disseny d’un sistema de tractament d’aigües consistent en una fossa sèptica com a tractament primari, un estany facultatiu com a secundari, i un aiguamoll o filtre de grava subsuperficial horitzontal com a terciari. D’aquesta fase només es fa un primer dimensionat (són necessaris els resultats finals de la Fase I). · Fase III: Disseny d’un digestor anaeròbic de cúpula flotant per a produir gas per al consum de l’escorxador. D’aquesta fase només es fa un primer dimensionat. Per acabar, s’elabora un manual per a la gestió dels canvis introduïts. El present document pretén servir de referència perquè es realitzin canvis en la infraestructura i en la gestió de l’escorxador municipal de Carhuaz, que són totalment necessaris per garantir la salut de la població i complir la normativa mediambiental vigent

Guia per a la prevenció i el control de la legionel·losi

Malaltia dels legionaris; Pneumònia; EpidemiologiaLegionnaires disease; EpidemiologyEnfermedad de los legionariosLa Guia per a la prevenció i el control de la legionel·losi actualitza la informació sobre la malaltia, integra la normativa vigent sobre el control de les instal·lacions relacionades amb la legionel·losi i aposta pel futur amb capítols relacionats amb la prevenció primària als hospitals o els mètodes de desinfecci

Estudis estructurals de complexos de les proteïnes HMG amb DNA

High Mobility Group proteins (HMG) are architectural factors involved in modulating chromatin structure and influencing a myriad of cellular processes such as transcription, replication and DNA repair. Altered levels of expression and mislocalization of these proteins have several pathological outcomes such as cancer and inflammatory processes. Understanding how the different HMG proteins recognize DNA and which changes can induce in it is still a challenge, and will be of great importance to interpret their activities in vivo. For this purpose, the aim of this work is to obtain the atomic structure of HMG proteins in complex with DNA using X-ray crystallography. In this work, we have studied two HMG families: HMGA and HMGB. Both bind to the minor groove of the DNA but are distinguished by their binding motifs: AT-hook motif (HMGA) and HMG-box motif (HMGB). AT-hooks are short positively charged flexible segments that bind preferentially to AT rich regions whereas HMG-box domains contain ~75 amino acids and have a characteristic L-shaped fold consisting of three a-helices and bind to DNA with limited or no sequence specificity. We have expressed and purified the HMGA1a protein, the fragment HMGA1b(1-79), the fragments Box A, Box B and Box A+B of the HMGB1 and the NHP6A (yeast HMGB). We have performed crystallographic assays of the complexes of AT rich oligonucleotides with these proteins (as well as with synthetic peptides corresponding to the AT-hook motif). We have studied the packing of some of the obtained crystals. As a major contribution of this thesis, we report the crystal structure of the HMGB1 Box A domain bound to the oligonucleotide ATATCGATAT at a resolution of 2 Å. It demonstrates a new mode of DNA recognition for HMG-box proteins. Two Box A domains act together kinking the DNA by 85º. In this unusual configuration the Phe37 of both domains stack together and intercalate the same CG base step. This duplex shows the greater distortion in just a base pair step that we have evidence for complexes with HMG-box domains.Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són considerades com a factors arquitectònics del DNA que modifiquen l'estructura de la cromatina afectant així diversos processos cel·lulars com la transcripció, la replicació i la reparació del DNA. L'alteració en els nivells d'expressió normals d'aquestes proteïnes i la seva deslocalització estan relacionades amb nombrosos processos patològics com ara el càncer o la inflamació. Per a poder interpretar l'activitat de les proteïnes HMG in vivo és molt important entendre els mecanismes de reconeixement en la unió al DNA que presenten les diferents famílies d'HMG així com els canvis que poden provocar en aquest, fet que representa encara un repte. Amb aquesta finalitat, en aquest treball ens hem proposat obtenir l'estructura atòmica dels complexos de diverses proteïnes HMG amb DNA mitjançant cristal·lografia de raigs X. Hem treballat amb dues famílies de proteïnes HMG: les HMGA i les HMGB. Ambdues s'uneixen al solc menor del DNA però es diferencien pels seus motius d'unió: motiu AT-hook (les HMGA) i motiu HMG-box (les HMGB). Els AT-hooks són cadenes curtes bàsiques i flexibles que s'uneixen preferentment a regions riques en ATs, mentre que els dominis HMG-box, compostos per uns 75 aminoàcids, presenten una forma d'L constituïda per tres hèlixs alfa i una especificitat de seqüència d'unió al DNA reduïda o inexistent. Durant el transcurs d'aquest treball s'han expressat i purificat la proteïna HMGA1a, el fragment HMGA1b(1-79), els fragments corresponents al Box A, Box B i Box A+B de l'HMGB1 i la proteïna NHP6A (HMGB de llevat) i s'han dut a terme assajos cristal·logràfics dels complexos d'oligonucleòtids rics en ATs amb aquestes proteïnes (així com amb pèptids sintètics corresponents als motius AT-hook). S'ha pogut estudiar l'empaquetament d'alguns dels cristalls obtinguts d'aquests complexos. L'aportació més important d'aquesta tesi és la resolució de l'estructura tridimensional d'un complex del domini Box A de l'HMGB1 amb l'oligonucleòtid ATATCGATAT a una resolució de 2 Å. Aquesta demostra un nou mode de reconeixement de DNA lineal per part dels dominis HMG-box. En l'estructura, dos dominis Box A s'uneixen a un mateix dúplex de DNA provocant un doblegament d'aquest de 85º. En aquest mode d'unió inusual, les Phe37 d'ambdós dominis s'intercalen en el mateix pas CG. Aquesta estructura presenta un dúplex amb la major distorsió en un únic pas de la que tenim constància per un complex del domini HMG-box