Unlabeled Semen Analysis by Means of the Holographic Imaging

The morphology, the motility, and the biochemical structure of the spermatozoon have often been correlated with the outcome of in vitro fertilization and have been shown to be the sole parameters of the semen analysis in predicting the success of intracytoplasmic sperm injection and intracytoplasmic morphologically selected sperm injection. In this context, digital holography has demonstrated to be an attractive technique to perform a label-free, noninvasive, and high-resolution technique for characterization of live spermatozoa. The aim of this chapter is to summarize the recent achievements of digital holography in order to show its high potentiality as an efficient method for healthy and fertile sperm cell selection, without injuring the specimen and to explore new possible applications of digital holography in this field

VISEM-Tracking, a human spermatozoa tracking dataset

A manual assessment of sperm motility requires microscopy observation, which is challenging due to the fast-moving spermatozoa in the field of view. To obtain correct results, manual evaluation requires extensive training. Therefore, computer-assisted sperm analysis (CASA) has become increasingly used in clinics. Despite this, more data is needed to train supervised machine learning approaches in order to improve accuracy and reliability in the assessment of sperm motility and kinematics. In this regard, we provide a dataset called VISEM-Tracking with 20 video recordings of 30 seconds (comprising 29,196 frames) of wet sperm preparations with manually annotated bounding-box coordinates and a set of sperm characteristics analyzed by experts in the domain. In addition to the annotated data, we provide unlabeled video clips for easy-to-use access and analysis of the data via methods such as self- or unsupervised learning. As part of this paper, we present baseline sperm detection performances using the YOLOv5 deep learning (DL) model trained on the VISEM-Tracking dataset. As a result, we show that the dataset can be used to train complex DL models to analyze spermatozoa

Objective evaluation of ram and buck sperm motility by using a novel sperm tracker software

This work offers researchers the first version of an open-source sperm tracker software (Sperm Motility Tracker, V1.0) containing a novel suit of algorithms to analyze sperm motility using ram and buck sperm as models. The computer-assisted semen analysis is used in several publications with increasing trend worldwide in the last years, showing the importance of objective methodologies to evaluate semen quality. However, commercial systems are costly and versatility is constrained. In the proposed method, segmentation is applied and the tracking stage is performed by using individual Kalman filters and a simplified occlusion handling method. The tracking performance in terms of precision (number of true tracks), the percentage of fragmented paths and percentage of correctly detected particles were manually validated by three experts and compared with the performance of a commercial motility analyzer (Microptic's SCA). The precision obtained with our sperm motility tracker was higher than the one obtained with a commercial software at the current acquisition frame rate of 25 fps (P < 0.0001), concomitantly with a similar percentage of fragmentized tracks (P = 0.0709) at sperm concentrations ranging 25-37 106 cells/mL. Moreover, our tracker was able to detect trajectories that were unseen by SCA. Kinetic values obtained by using both methods were contrasted. The higher values found were explained based on the better performance of our sperm tracker to report speed parameters for very fast motile sperm. To standardize results, acquisition conditions are suggested. This open-source sperm tracker software has a good plasticity allowing researchers to upgrade according requirements and to apply the tool for sperm from a variety of species.Fil: Buchelly Imbachí, Francisco Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Zalazar, Lucia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Pastore, Juan Ignacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Greco, M.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Iniesta-Cuerda, M.. Universidad de Castilla-La Mancha; EspañaFil: Garde, J. J.. Universidad de Castilla-La Mancha; EspañaFil: Soler, A. J.. Universidad de Castilla-La Mancha; EspañaFil: Ballarin, Virginia Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Científicas y Tecnológicas en Electrónica. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ingeniería. Instituto de Investigaciones Científicas y Tecnológicas en Electrónica; ArgentinaFil: Cesari, Andreina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentin

Fluid-Induced Propulsion of Rigid Particles in Wormlike Micellar Solutions

In the absence of inertia, a reciprocal swimmer achieves no net motion in a viscous Newtonian fluid. Here, we investigate the ability of a reciprocally actuated particle to translate through a complex fluid that possesses a network using tracking methods and birefringence imaging. A geometrically polar particle, a rod with a bead on one end, is reciprocally rotated using magnetic fields. The particle is immersed in a wormlike micellar (WLM) solution that is known to be susceptible to the formation of shear bands and other localized structures due to shear-induced remodeling of its microstructure. Results show that the nonlinearities present in this WLM solution break time-reversal symmetry under certain conditions, and enable propulsion of an artificial "swimmer." We find three regimes dependent on the Deborah number (De): net motion towards the bead-end of the particle at low De, net motion towards the rod-end of the particle at intermediate De, and no appreciable propulsion at high De. At low De, where the particle time-scale is longer then the fluid relaxation time, we believe that propulsion is caused by an imbalance in the fluid first normal stress differences between the two ends of the particle (bead and rod). At De~1, however, we observe the emergence of a region of network anisotropy near the rod using birefringence imaging. This anisotropy suggests alignment of the micellar network, which is "locked in" due to the shorter time-scale of the particle relative to the fluid

Automated identification of flagella from videomicroscopy via the medial axis transform

Ubiquitous in eukaryotic organisms, the flagellum is a well-studied organelle that is well-known to be responsible for motility in a variety of organisms. Commonly necessitated in their study is the capability to image and subsequently track the movement of one or more flagella using videomicroscopy, requiring digital isolation and location of the flagellum within a sequence of frames. Such a process in general currently requires some researcher input, providing some manual estimate or reliance on an experiment-specific heuristic to correctly identify and track the motion of a flagellum. Here we present a fully-automated method of flagellum identification from videomicroscopy based on the fact that the flagella are of approximately constant width when viewed by microscopy. We demonstrate the effectiveness of the algorithm by application to captured videomicroscopy of Leishmania mexicana, a parasitic monoflagellate of the family Trypanosomatidae. ImageJ Macros for flagellar identification are provided, and high accuracy and remarkable throughput are achieved via this unsupervised method, obtaining results comparable in quality to previous studies of closely-related species but achieved without the need for precursory measurements or the development of a specialised heuristic, enabling in general the automated generation of digitised kinematic descriptions of flagellar beating from videomicroscopy.Comment: 10 pages, 5 figures. Author accepted manuscript. Supplementary Material available at https://doi.org/10.1038/s41598-019-41459-

Advanced methods in reproductive medicine: Application of optical nanoscopy, artificial intelligence-assisted quantitative phase microscopy and mitochondrial DNA copy numbers to assess human sperm cells

Declined fertility rate and population is a matter of serious concern, especially in the developed nations. Assisted Reproductive Technologies (ART), including in vitro fertilization (IVF), have provided great hope for infertility treatment and maintaining population growth and social structure. With the help of ART, more than 8 million babies have already been born so far. Despite the worldwide expansion of ART, there is a number of open questions on the IVF success rates. Male factors for infertility contribute equally as female factors, however, male infertility is primarily focused on the “semen quality”. Therefore, the search of new semen parameters for male fertility evaluation and the exploration of the optimal method of sperm selection in IVF have been included among the top 10 research priorities for male infertility and medically assisted reproduction. The development of imaging systems coupled with image processing by Artificial Intelligence (AI) could be the revolutionary step for semen quality analysis and sperm cell selection in IVF procedures. For this work, we applied optical nanoscopy technology for the analysis of human spermatozoa, i.e., label-based Structured Illumination Microscopy (SIM) and non-invasive Quantitative Phase Microscopy (QPM). The SIM results demonstrated a prominent contrast and resolution enhancement for subcellular structures of living sperm cells, especially for mitochondria-containing midpiece, where features around 100 nm length-scale were resolved. Further, non-labeled QPM combined with machine learning technique revealed the association between gradual progressive motility loss and the morphology changes of the sperm head after external exposure to various concentrations of hydrogen peroxide. Moreover, to recognize healthy and stress-affected sperm cells, we applied Deep Neural Networks (DNNs) to QPM images achieving an accuracy of 85.6% on a dataset of 10,163 interferometric images of sperm cells. Additionally, we summarized the evidence from published literature regarding the association between mitochondrial DNA copy numbers (mtDNAcn) and semen quality. To conclude, we set up the high-resolution imaging of living human sperm cells with a remarkable level of subcellular structural details provided by SIM. Next, the morphological changes of sperm heads resulting from peroxidation have been revealed by QPM, which may not be explored by microscopy currently used in IVF settings. Besides, the implementation of DNNs for QPM image processing appears to be a promising tool in the automated classification and selection of sperm cells during IVF procedures. Moreover, the results of our meta-analysis showed an association of mtDNAcn in human sperm cells and semen quality, which seems to be a relevant sperm parameter for routine clinical practice in male fertility assessment

Supervised and unsupervised spermatozoa detection, classification and tracking in imaging data

Tese de mestrado. Bioinformática e Biologia Computacional (Biologia Computacional). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A aplicação da matemática na pesquisa em biologia tem vindo a ganhar relevância nas últimas décadas. Vários estudos teóricos e quantitativos têm contribuído para o progresso da biologia celular, da biologia do desenvolvimento e da imunologia. Os modelos matemáticos são particularmente úteis em casos onde a regulação genética afecta as propriedades biofísicas da célula e um exemplo é o estudo da biomecânica e hidrodinâmica dos espermatozóides. No entanto, a inexistência de comparações quantitativas rigorosas entre estes modelos e os dados experimentais torna este processo difícil e enviesado. Isto é devido à comparação maioritariamente qualitativa e visual, onde os parâmetros são mudados até o modelo e os dados serem semelhantes. As simulações de células contêm toda a informação geométrica dos objectos que descrevem pelo que podem ser rigorosamente comparadas com as imagens e filmes. Por outro lado, a reconstituição de células é dificultada pelos processos de análise de imagens actuais, que têm um fraco desempenho e que necessitam de supervisão humana. Este último ponto torna a análise de grande quantidade de dados difícil e introduz subjectividade e enviesamento na análise. Desta forma, os avanços na biologia celular quantitativa dependem do desenvolvimento de novos métodos automáticos de análise de imagem. Os sistemas de análise de espermatozóides assistida por computação (CASA) são um bom exemplo onde a bioimagiologia e a sua análise automática foram combinadas com sucesso. Estes sistemas apareceram nos anos 70 e são baseados na análise populacional dos parâmetros de motilidade dos espermatozóides. A sua popularidade advém da sua importância nos sectores médico e económico, uma vez que um em cada seis casais é subfértil e metade dos casos são de origem masculina. A motilidade espermática é essencial para a fertilização. Na viagem até ao ovo, as células espermáticas têm que nadar numa extensão milhares de vezes o seu comprimento através de uma geometria interna complexa cheia de fluídos altamente viscosos e de células imunes potencialmente hostis. Começando com uma população de centenas de milhões, a grande maioria não chegará às trompas de Falópio e muito menos chegarão ao local onde ocorre a fertilização. Adicionalmente, a capacitação espermática e a reacção acrossómica são dois eventos que ocorrem durante esta viagem que podem ser usados para definir a capacidade de fertilização, uma vez que também são essenciais para que esta ocorra. A capacitação prepara a membrana do espermatozóide para receber futuras pistas de localização do óvulo enquanto que a reacção acrossómica liberta enzimas para que o espermatozóide possa penetrar na camada protectora do óvulo enquanto também prepara a membrana espermática para a fusão das duas células. Para além da motilidade espermática, uma abordagem prática para estudar a fertilização tem sido medir a taxa de resposta dos espermatozóides à indução da reacção acrossómica. Actualmente, esta habilidade é medida manualmente em preparações de células espermáticas fixadas e coradas de forma a visualizar o acrossoma, um complexo derivado do Golgi localizado no ápice da célula. Sendo um parâmetro comum e frequentemente usado em pesquisa científica, neste trabalho desenvolvemos um processo automático de classificar os espermatozóides de acordo a reacção acrossómica. O nosso classificador baseia-se na análise de discriminantes, um método que define funções de fronteira entre duas ou mais classes, de acordo com os factores providenciados. Definimos duas classes: Capacitadas, que são células que sofreram capacitação mas que ainda não passaram por nenhum estado de reacção acrossómica, e Reagidas, que já reagiram ou que ainda estão a reagir. Como características escolhemos a intensidade média de sete sub-áreas da cabeça do espermatozóide, dispostas ao longo do seu eixo maior. Primeiro testámos se a Análise de Discriminantes Lineares (LDA) e Análise de Discriminantes Quadráticos (QDA) seriam aceitáveis para classificar este tipo de reacção em células detectadas manualmente. A classificação por QDA teve resultados melhores do que a por LDA, classificando correctamente 98.0% das células, tendo sido seleccionado como modelo de classificação. Tendo em vista uma verdadeira automatização, testámos o mesmo método com células detectadas por segmentação automática da imagem, onde estimámos os parâmetros do módulo de detecção (filtragem de objectos) e classificámos correctamente 94.7% dos objectos que correspondiam a um e apenas um espermatozóide cuja classe era conhecida. No entanto, o processo automático classifica todos os objectos detectados resultando numa classificação todos esses objectos obtivemos um erro de 28.1% na frequência relativa de espermatozóides Reagidos, que é uma diferença significativa. Este erro é maioritariamente devido aos espermatozóides anotados manualmente cuja classe era dúbia, pelo que não foram atribuídos a nenhuma classe. É razoável assumir que todos os espermatozóides dúbios sejam na verdade células que começaram recentemente a reagir e que deverão pertencer à classe Reagidos. Desta forma o erro na frequência de Reagidos obtido é de apenas -2.4%. A eficiência na classificação dos objectos detectados automaticamente cujas classes eram conhecidas e o facto de o classificador ter classificado as dúbias como Reagidas apoia esta hipótese. Provavelmente, é necessário treinar o modelo de classificação com dados anotados por um especialista na área da reacção acrossómica para poder generalizar o nosso modelo correctamente. É ainda de salientar que, pelo nosso processo, detectámos apenas 49.0% das células, uma vez que muitas detecções tratavam-se de facto de agregados celulares. Este agregados foram filtrados antes da classificação pois iriam enviesar a classificação. Para evitar este problema, propomos o uso de preparações com menos densidade celular, diminuindo o número e tamanho das agregações e permitindo melhor detecção e resultados mais fiáveis. A maioria dos métodos actuais de detecção de espermatozóides (i.e. incluindo o nosso) sofrem do mesmo problema: resolver as células quando estão agregadas. Com o intuito de ultrapassar as suas limitações, desenvolvemos um novo algoritmo de detecção. O nosso método visa tirar partido da informação do espermatozóide, como conhecimento a priori, e da informação contida em imagens de série temporal, podendo ser também aplicado em imagens isoladas, como demonstramos. A ideia base é aplicar uma função que descreva a forma e movimento do espermatozóide ao longo do tempo à célula na imagem, estimando os parâmetros dessa função através da posição e forma de potenciais objectos nessas imagens. Se o melhor ajuste da função for bom, é muito provável que um espermatozóide se encontra nas posições e com as formas modeladas. Devido à complexidade em desenvolver, ajustar e validar um modelo baseado em equações diferenciais, neste trabalho tabelámos a posição, rotação e conformação flagelar dum espermatozóide de ouriço-do-mar da espécie Lytechinus pictus. Para validar o nosso método, tentámos detectar o espermatozóide tabelado usando apenas uma imagem (i.e. ajuste local) e ainda rastreá-lo ao longo do tempo (i.e. ajuste global). Tanto a detecção como o rastreamento foram eficazes. Para generalizar este modelo, usámos um filme de um espermatozóide de Strongylocentrotus purpuratus (i.e. outro ouriço-do-mar) e conseguimos detectar e rastrear essa mesma célula, tendo havido apenas uma pequena acumulação de erro nos últimos tempos de amostragem que poderá ser devido à diferença inter-espécie ou a este espermatozóide não ter uma dinâmica estacionária (i.e. a nadar em círculos com a frequência flagelar constante). Podemos iterar o processo global em todas as imagens e seleccionar as instâncias do modelo correspondentes ao mesmo espermatozóides, ou seja, a mesma célula mas fitado localmente em imagens/tempos diferentes, de forma a obter o melhor modelo do espermatozóide nesse filme. Este processo de ajuste local pode ser usado em imagens isoladas (i.e. independência espacial) e, consequentemente, para detectar os espermatozóides humanos usados na classificação, desde que o espermatozóide tabelado seja ajustado. Uma questão interessante é se o nosso modelo consegue aumentar a resolução temporal e espacial da microscopia. Analisando uma sub-amostra temporal conseguimos detectar e rastrear a célula correctamente, tendo o nosso modelo sido coerente com os tempos de amostragem não usados para ajustar os parâmetros. De modo semelhante, conseguimos ainda obter boas estimativas da posição do flagelo em imagens onde apenas a informação da cabeça estava disponível (i.e. os flagelos não eram visíveis). No entanto, das várias instâncias do modelo referentes a esse espermatozóide, não conseguimos escolher a que mais se aproximava à célula, pelo que é necessário um método de selecção diferente que inclua mais informação. Os métodos desenvolvidos podem ser integrados em modelos morfodinâmicos, onde forma, mecânica e sinalização são combinados, e revolucionar os sistemas CASA, que estão até à data por integrar motilidade e processos bioquímicos.Recent advances in microscopy, by allowing to visualize cells and tissues in their natural physiological context, expanded the research possibilities to unprecedented domains. However, progress is hindered by the virtual absence of automatic image analysis methods that extract quantitative information from images. At best, image analysis is based on semi-automatic methods that require human supervision which is subjective and biased. This is how spermatozoa research stands at the moment and here we address three major computational issues in sperm imaging research: classification, detection and tracking. Sperm capacitation, acrosomal reaction and motility play an important role in fertility, which is a subject of growing medical and economic importance. In sperm research, acrosomal reaction is commonly measured by image analysis but, since no automatic classifier exists, it is performed manually. We developed and compared a method based on Discriminant Analysis capable of distinguishing capacitated cells which have not undergone acrosomal reaction from cells which are reacting or have reacted with over 94% of efficiency. The major difficulty encountered was automatic spermatozoa detection and a method to detect and track was devised - detect while tracking. This method uses a model of a sperm cell as a priori knowledge and can define well the sperm flagella position. We showed it can also predict sperm cells and their flagella at higher temporal resolution than the image sequence under study. It also has the potential to estimate flagellar conformations when only the sperm head positions are available but more sources of information are required in order to get the right conformation. Our methods modules can be easily adapted to any experimental setting (i.e. different labelling or sperm cell model) and the methods themselves can be combined to each other or to other available methods in order to facilitate sperm research