Sobre la formación de recursos humanos para la ciencia

La formación de recursos humanos para investigación científica irrumpió hace algunas décadas en las universidades argentinas como actividad ineludible para la continuidad de la carrera de docencia e investigación. El objetivo de esta revisión historiográfica fue rastrear los inicios de la relación científico-discípulo, así como los resultados emanados de tal asociación. A partir del Siglo XVII sobresalen por sus descubrimientos las figuras de discípulos como Ham, van Swieten, Auenbrugger, Schlemm, Langerhans, Ranvier, Sandström, Bernstein, Guérin, Allen, Price, Bertram, Huxley, Varela y Best, entre otros. Se describen los logros iniciales obtenidos por estos jóvenes, a veces emulando a sus tutores, así como su ulterior consolidación como científicos de renombre. Se concluye que la formación de recursos humanos existió a partir de los inicios de la “ciencia normal” y que su efecto multiplicador es altamente provechoso para el incremento del conocimiento. Se resalta el carácter azaroso de la admisión del discípulo, así como el imperfecto sistema de valoración del tutor, que privilegia la cantidad y no la calidad de los discípulos

網膜における視覚情報の符号化

学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 横澤 一彦, 東京大学教授 今水 寛, 東京大学准教授 村上 郁也, 立命館大学教授 立花 政夫, 日本医科大学教授 金田 誠University of Tokyo(東京大学

Charakterisierung der Wirkung und des Wirkmechanismus von pharmakologischen K2P- Kanalagonisten

Zwei- Porendomänen- Kaliumkanäle (K2P- Kanäle) sind die zuletzt entdeckte und am wenigsten erforschte Familie der Kaliumkanäle. Die Familie der K2P-Kanäle umfasst beim Menschen fünfzehn Mitglieder, welche nach Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenzen in sechs Subfamilien unterteilt werden. Der Name der Kanäle leitet sich aus ihrer Struktur ab, da sie pro Untereinheit zwei porenbildende Domänen und vier Transmembrandomänen besitzen. Funktionelle K2P-Kanäle assemblieren als Dimere, bei denen die insgesamt vier Porendomänen eine kaliumselektive Pore bilden. K2P- Kanäle sind im Menschen ubiquitär mit verschiedenen gewebespezifischen Mustern exprimiert und an diversen (patho-) physiologischen Prozessen beteiligt. Dazu gehören beispielsweise die Regulation der neuronalen Erregbarkeit, der zellulären Signaltransduktion, der Zellproliferation und die Beteiligung an diversen metabolischen Prozessen. K2P -Kanäle scheinen eine Rolle bei der Entstehung einer Reihe von Erkrankungen zu spielen, zu denen Depressionen, kardiale Arrhythmien, Hypertension und verschiedene endokrine Erkrankungen gehören. Daher stellen diese Kanäle potentielle Zielstrukturen für neue Pharmaka dar. Die Offenwahrscheinlichkeit der Kanäle wird durch eine große Bandbreite verschiedener Stimuli, wie Temperatur, Spannung, mechanischer Stress, pH- Wert und endogene Signalmoleküle, genauso wie durch synthetisierte Substanzen beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst verschiedene bekannte K2P- Kanalaktivatoren hinsichtlich ihrer Wirkung und Potenz auf K2P- Kanäle charakterisiert. Die untersuchten Substanzen sind 2- Aminoethoxydiphenylborat, Riluzol, Diphenylboranyloxy- (diphenyl) boran, 3-(3,6-Dichloro-carbazol-9-yl)-propan-1,2-diol, Drofenin und das als BL- 1249 bezeichnete (5,6,7,8-Tetrahydro-naphthalen-1-yl)-[2-(1H-tetrazol-5-yl)-phenyl]-amin. Anschließend wurden die Experimente auf die Aufklärung des Wirkmechanismus des hochaffin auf alle untersuchten Kanälen wirkende BL- 1249 konzentriert. Die Experimente wurden mit der Patch Clamp- Technik durchgeführt. Es wurden große inside- out- Membranpatche aus Xenopus laevis- Oozyten hergestellt, welchen einige Tage zuvor manuell die kanalspezifische mRNA injiziert wurde. Die unterschiedlichen Kanäle zeigten eine Subfamilien- spezifische reversible Aktivierung oder Inhibition bei Applikation der Chemikalien. Am ausführlichsten wurde in dieser Arbeit die Wirkung des Pharmakons BL- 1249 untersucht. Zudem wurde mit der Aufklärung der Bindungsstelle und des Wirkmechanismus von BL- 1249 am TREK- 1- Kanal begonnen; dieser Kanal wird von BL- 1249 sehr potent aktiviert. In K2P- Kanälen ist der Selektivitätsfilter die einzige ins Schaltverhalten involvierte Struktur. Das sogenannte „helix- bundle- crossing“ am intrazellulären Poreneingang beeinflusst die Kaliumleitfähigkeit dagegen nicht. Es wurden neben Kompetitionsexperimenten mit etablierten Kanalblockern einzelne Aminosäuren im Kanalprotein mutiert, um zu klären, ob der mutierte Aminosäurerest eine kritische molekulare Determinante für die Bindung oder den Signaltransfer zum Selektivitätsfilter darstellt. Die Ergebnisse lassen eine Lokalisation der BL- 1249- Bindungsstelle dicht unterhalb des Selektivitätsfilters annehmen. Experimente aus Kooperationen wie Computersimulationen zur molekularen Dynamik, Kristallstrukturen und weiterführende Patch- Clamp- Experimente brachten im Verlauf weitere Erkenntnisse zum Wirkmechanismus von BL- 1249 im Speziellen und allgemein zur Erforschung des Wirkmechanismus von niedermolekularen Substanzen an K2P- Kanälen

Isolation of the Cytosolic C-Terminus Segment of Mammalian Kca Channel a Subunit

The last 20 years of research into ion channels has unraveled unexpected features of the BKca channel as a rheostast for cell activity in excitable tissues and homeostatically fine tuning many biological activation processes in the cell. Great attention has been dedicated to the allosteric regulatory mecanisms by which the BKca channel is activated or inhibited. Most of these mechanisms point to the involvment of cytoplasmic, C-terminal, ‘tail’ domain of the channel. Many laboratories have cloned portions of the ‘tail’ domain in an attempt to to study specific regulatory sites. Very little is known about the BK ‘tail’ structure, and functional studies have been the leading approach into understanding the diversity of modulation present in the ‘tail’ domain. Our lab was interested in isolating a natively expressed BKcafrom a GH3 cells. Immunoblots using lystes of GH3 cells unexpectedly revealed a 70 kDa BK ‘tail’ like protein because it reacted with anti-BK antibodies. We determined that the high-speed supernatant fraction of these GH2 cell lysates was enriched with this 70 kDa protein. We then endeavored to isolate this protein using immunoprecipitation and affinity chromatography. Results show that our affinity column using the dye Cibacron blue and elution NAD buffer at low pH was able to isolate this 70 kDa protein. Further investigation is needed to determine the pH dependence of this affinity column approach and the sequence of this protein. If proven to be the ‘tail’ of the BKca channel, purification of this protein will open doors for subsequent biological experiments to determine how different ligands such as diatomic gases may interact with the channel, and elucidate mechanisms regarding the channel’s sensitivity to gaseous ligands, amongst others. xi

Structural and Functional Studies of SLO K+ Channels: Mechanisms of Gating by Intracellular Signaling

Eukaryotic K+ channels from the SLO family (SLO1, SLO2 and SLO3) provide a link between intracellular signaling and the electrical activity of a cell. The opening and closing (gating) of the three different SLO homologs is controlled by the synergistic action of membrane voltage and specific intracellular cues: Ca2+ binding in SLO1, Na+ binding in SLO2 and pH increase in SLO3. It is known that intracellular signals activate SLO channels by acting on the large cytoplasmic domains (CTDs) of these proteins, which follows the transmembrane ionconduction pore. However, a molecular description of the mechanisms of intracellular gating in SLO channels is still lacking. In this thesis, I present biochemical, structural and functional studies aiming at understanding how the activity of SLO1 and SLO3 channels is controlled by intracellular Ca2+ binding and pH increase, respectively. First, I describe recombinant methods for the large-scale expression and purification of functional SLO channels, paving the way for a more complete biochemical and structural analysis of these proteins. Then, I report the crystal structures of the large cytoplasmic domains (CTDs) from two different SLO1 channels. Structures of the Ca2+-bound CTDs from human and zebrafish SLO1 channels define the precise molecular architecture of SLO1’s Ca2+-sensing module: CTDs from the four subunits of a tetrameric SLO1 channel assemble in a so-called gating ring structure at the intracellular face of the membrane. In conjunction with other studies, these results describe how Ca2+ binding affects the conformation of one layer of the SLO1 gating ring, which can explain the Ca2+-driven opening of SLO1’s ion conduction pore. Next, I present the crystal structure of the human SLO3 gating ring. A comparison with the SLO1 structures suggests that the hSLO3 structure represents the open conformation of the hSLO3 gating ring. Finally, I describe functional mutagenesis studies on the mouse SLO3 ortholog, which reveal a possible mechanism for pH sensing in the mouse SLO3 channel. Surprisingly, the mechanism I propose appears not to be conserved in SLO3 channels from other species. This could be a dramatic example of how new functional mechanisms can easily evolve within the very versatile scaffold of a gating ring structure. Altogether, the results presented in this thesis provide a molecular framework to understand the mechanisms of intracellular gating in SLO channels

The effects of Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy on the Neuromuscular System in Humans

Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy (CIDP) is an inflammatory autoimmune peripheral nerve disorder. CIDP is associated with demyelination, slow motor nerve-conduction velocity, and distal muscle weakness. CIDP is under-recognized due to its heterogeneous presentation and the limitations of clinical diagnostic criteria. Using a combination of electrophysiology and muscle imaging techniques the four studies outlined in this thesis systemically investigate the impacts of this demyelinating disease on motor nerves and their innervated muscles. The first two studies examine the neuronal consequences of demyelination caused by CIDP and the following two studies investigate how skeletal muscle is affected by these neuronal complications. Specifically, the purpose of study 1 was to investigate whether patients with CIDP demonstrate motor unit loss, and to determine the neuromuscular transmission stability of motor units. Results showed patients with CIDP have reduced motor unit number estimates (MUNEs), in addition to motor unit instability and transmission blocking in the tibialis anterior (TA) muscle. The purpose of study 2 was to investigate modifications to motor unit discharge characteristics of affected motor units. The results indicate CIDP leads to axonal or neuromuscular block and abnormally high motor unit firing rates of early recruited motor units as a compensatory mechanism to mitigate the frank neuronal loss in the TA. The purpose of studies 3 and 4 was to assess the consequences of peripheral axon loss and motor unit instability on muscle quality and quantity in patients with CIDP. It is critical to investigate whether these neuronal changes precipitate uniform alterations in musculature. Study 3 showed that patients with CIDP have less overall muscle mass and more non-contractile tissue infiltration in the TA of the anterior leg compartment. Study 4, demonstrated that muscles in the posterior leg compartment, that differ functionally from the TA and are innervated by a different portion of the sciatic nerve undergo similar morphological changes to the TA. In combination, these neuronal deficits and skeletal muscle structural abnormalities likely lead to muscle weakness and functional impairment seen in patients with CIDP. Together these studies form a foundational understanding of how CIDP impacts both nervous and muscle tissue at a systems level

Aktivität der Rumpfmuskulatur nach einem Schlaganfall mit akuter bzw. persistierender Hemisymptomatik

Ein Schlaganfall führt häufig durch Störungen der Extremitätenmotorik zu einer Beeinträchtigung alltäglicher Aktivitäten. In vielen Arbeiten wurden häufig interindividuell sehr unterschiedliche Gehstörungen nach einem Schlaganfall mit Fokus auf die untere Extremität identifiziert. Dass eine zentrale Schädigung auch Auswirkungen auf die funktionell bedeutsame Rumpfmuskulatur hat, ist seit dem noch mehr anzunehmen, bisher jedoch noch unklar. An 36 Patienten (13 Frauen, 54 ± 29 Jahre; 23 Männer, 54 ± 34 Jahre) mit Hemisymptomatik unterschiedlicher Ausprägung wurden daher mittels Oberflächen-Elektromyographie sowohl statische, als auch dynamische Messungen im Rumpfbereich vorgenommen. Die Ergebnisse aus der statischen Untersuchung zeigten lediglich Veränderungen der Aktivität der Rückenmuskulatur während der Vorkippung in Form von höheren Amplituden bei stärkeren Belastungen und Seitendifferenzen insbesondere im Thorakalbereich auf der nicht gelähmten Seite. Letztere wird sehr wahrscheinlich mit der häufig vorliegenden einseitigen Armparese zusammenhängen, als möglicher Ausdruck des Aktivierungsdefizites der paretischen Seite und Kompensation durch die gesunde. Während des Gehens zeigte die paravertebrale Muskulatur im Vergleich zu Gesunden ein Beibehalten der spezifischen Aktivitätscharakteristik auf segmentaler Ebene. Zusätzlich wurden häufig Abweichungen von der durch die Lokomotion bedingten, physiologischen Seitendifferenz nachgewiesen. Bei einer Subgruppe von Patienten, bei denen der Schlaganfall bereits über sechs Monate zurücklag, konnten in der Dynamik von der Norm abweichende Amplituden auf der nicht betroffenen Seite der Rückenmuskulatur mit verminderter Aktivität der paretischen Seite nachgewiesen werden, als ebenfalls mögliche Form der Kompensation. Die vorgestellten Ergebnisse identifizieren auf unterschiedlichen Ebenen Störungen der motorischen Leistungsfähigkeit der Rumpfmuskulatur nach einem Schlaganfall

Pharmacological and functional regulation of two-pore domain potassium channels

Two pore domain potassium (K2P) channels underlie the background potassium leak currents of excitable cells. In this study, the whole cell patch clamp technique was used with transiently transfected human embryonic kidney cells, and cerebellar granule neurones (CGNs) in primary culture, to compare the pharmacological properties of acid sensitive K2P channels. Zn2+, La3+, Cu2+, ruthenium red and Ru-360 blocked TASK-1 and TASK-3 channel currents. Substitution of external sodium ions with N-methyl-D-glucamine and choline also caused a significant reduction in TASK-1 and TASK-3 currents, demonstrating that maximal conductance through these potassium channels requires the presence of external sodium ions. Whilst Cu2+ blocked TASK-1 and TASK-3 channel currents, TASK-2 currents were not affected by the ion. Mannitol, a scavenger of hydroxyl radicals, did not alter Cu2+ block of TASK-3 currents showing hydroxyl radical production was not the underlying mechanism. Application of thiol oxidant, DTNB (5’,5’-dithio-bis(2 nitrobenzoic acid)), showed a potent block, mimicking that of Cu2+ in size and reversibility. DTNB and Cu2+ block were reversed by disulphide-reducing DTT (dithiothreitol), suggesting thiol rich cysteine residues played a fundamental role in <y, TASK-3 current block by Cu . The standing-outward, voltage-insensitive potassium current in CGNs also showed DTNB and copper sensitivity. Substitutions of TASK-3 cysteine residues to alanine and serine retained copper sensitivity while whole cell current amplitude diminished and a sensitivity to alkaline pH (8.4) was introduced to TASK-3. Point mutation of cysteine 110 was found to be key in facilitating the pH 8.4 potentiation of current. Cu2+ and DTNB were applied to a TASK-2/TASK-3 chimera channel where a robust, albeit reduced, block was observed. The central role of the TASK channels in neuronal excitability is demonstrated by their extensive physiological and cross-species distribution and varied mechanisms of regulation. In this study, the interaction of essential trace element Cu2+ was shown to be a significant mechanism of TASK regulation.Open acces