Fast Direct Injection Mass-Spectrometric Characterization of Stimuli for Insect Electrophysiology by Proton Transfer Reaction-Time of Flight Mass-Spectrometry (PTR-ToF-MS)

Electrophysiological techniques are used in insect neuroscience to measure the response of olfactory neurons to volatile odour stimuli. Widely used systems to deliver an olfactory stimulus to a test insect include airstream guided flow through glass cartridges loaded with a given volatile compound on a sorbent support. Precise measurement of the quantity of compound reaching the sensory organ of the test organism is an urgent task in insect electrophysiology. In this study we evaluated the performances of the recent realised proton transfer reaction-time of flight mass-spectrometry (PTR-ToF-MS) as a fast and selective gas sensor. In particular, we characterised the gas emission from cartridges loaded with a set of volatile compounds belonging to different chemical classes and commonly used in electrophysiological experiments. PTR-ToF-MS allowed a fast monitoring of all investigated compounds with sufficient sensitivity and time resolution. The detection and the quantification of air contaminants and solvent or synthetic standards impurities allowed a precise quantification of the stimulus exiting the cartridge. The outcome of this study was twofold: on one hand we showed that PTR-ToF-MS allows monitoring fast processes with high sensitivity by real time detection of a broad number of compounds; on the other hand we provided a tool to solve an important issue in insect electrophysiology

Diel rhythm of volatile emissions from males and females of the olive fruit fly Bactrocera oleae using PTR-ToF and GC–MS

The olive fruit fly Bactrocera oleae, is the major key pest of olive groves worldwide. As an odor-driven species, its intraspecific communication has been thoroughly investigated, yielding a combination of spiroacetals, esters and hydrocarbons. However, its management with pheromone is still restricted to olean, the major pheromone component. Given the crucial role of circadian rhythm and pheromone blends in mediating flies reproductive behavior compared to single compounds, B. oleae headspace chemical profile was carefully examined, through the combination of Proton Transfer Reaction Time of Flight Mass Spectrometry (PTR-ToF) and Gas Chromatography coupled with Mass Spectrometry (GC–MS). This novel approach aimed at continuously investigating the temporal scale of volatilome profile of B. oleae individuals, as well as the determination of new candidate sexborne compounds (particularly those emitted in traces or having low molecular weight), that may be relevant to the fly’s chemical communication and were unreported due to limitations of frequently used analytical techniques. Our results describe the dynamics and diversity of B. oleae chemical profile, highlighting the emission of 90 compounds, with clear diel rhythm of release, of known pheromone components of B. oleae (e.g., olean, alphapinene and muscalure) and new candidates. In contrast to ammonia, acetaldehyde and muscalure, which were highly emitted during the afternoon by males and mixed groups, olean was mostly released by mature females and mixed groups, with a peak of emission during early-morning and afternoon. This emission of olean around dawn is reported for the first time, suggesting early-morning mating activity in B. oleae. Furthermore, esters, such as methyl tetradecanoate, which had been earlier identified as a pheromone for B. oleae, did not exhibit any discernible release patterns. These findings are the first to demonstrate the emission of chemicals, which are only produced when males and females are close to one another, with an emission peak during the afternoon (mating period), and that may have aphrodisiac properties for B. oleae males. These results emphasize the relevance of compounds with distinct diel rhythm and address their potential function as intraspecific messengers, according to their source and timing of releas

Insect olfaction as an information filter for chemo-analytical applications

Die Geruchswahrnehmung von Insekten ist an die spezifischen Anforderungen der Ökosysteme angepasst, in denen sie leben. Von Insekten wahrgenommene Volatile können Informationen über den Ort eines geeigneten Ovipositionsplatzes oder den physiologischen Zustand einer Wirtspflanze geben. Da der Geruchssinn der Insekten sich seit Millionen von Jahren an die Wahrnehmung bestimmter Volatile angepasst hat, können die wahrgenommenen Volatile als Markerstoffe angesehen werden, die zuverlässig einen Ökosystemzustand angeben können. Die Identifikation dieser Markerzustände und die Evaluation ihrer Nützlichkeit für spurenanalytische Anwendungen ist das Ziel dieser Arbeit. Es wurden drei Themen ausgewählt um die Verwendungsmöglichkeit des Insektengeruchssinns für Sensoranwendungen zu überprüfen: Fleischfrische, Todeszeitbestimmung (post mortem Intervall, PMI) und frühzeitige Feuererkennung. Spurenanalytik (GC-MS), Elektrophysiologie (EAG, GC-MS/EAD), Verhaltensversuche und Feldtests wurden angewandt, um die chemoökologische Interaktion der Schmeißfliege Calliphora vicina und der „Feuerkäfer“ Melanophila cuspidata, Merimna atrata and Acanthocnemus nigricans mit ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Die Resultate aus diesen Methoden erlaubten die Selektion von Volatilen, die drei Kriteria erfüllen: hohe Quantität, zuverlässige Emission und die ausschliessliche Emission von der untersuchten und keiner anderen Quelle. Diese drei Auswahlkriterien wurden aufgestellt um zu gewährleisten, dass die ausgewählten Markervolatile nicht nur zuverlässig mit dem physiologischen Status der Substrate (Alter von verderbendem Fleisch, PMI, Temperatur von erhitzten Spänen) korrelieren, sondern auch den Ansprüchen technischen Sensorsysteme genügen. Im Falle des alternden Fleisches unter warmen und trockenen Bedingungen ist Nonanal ein Zeiger für die korrekte Reifung des Fleisches zu Schinken. Dimethyl Trisulfid, Phenol und Indol zeigen das Verderben des Fleisches unter warmen und feuchten Bedingungen an. Bei niedrigen Temperaturen sind zunehmende 2,3 Butandiol Emission und abnehmende Nonanal Emission ein Zeiger für zunehmendes Verderben des Fleisches, sowohl unter trockenen als auch feuchten Bedingungen. Allerdings wurde 2,3 Butandiol nicht von C. vicina wahrgenommen, da die Fliege während der Vegetationszeit aktiv ist und unter diesen Bedingungen Dimethyl Trisulfid, Phenol und Indol emittiert werden. Nonanal, Hexanal, Dimethyl Disulfid, Dimethyl Trisulfid, Butan-1-ol und Phenol wurden als nützliche Volatile zur Eingrenzung der Leichenliegezeit ausgewählt. Die genannten Aldehyde sind typisch für die frühen Stadien der Verwesung, gefolgt von Butan-1-ol und den Schwefelsulfiden. Phenol wird hauptsächlich in den späteren Verwesungsstadien emittiert. Allerdings werden Phenol und 1-Butanol nicht von der Fliege wahrgenommen, da diese ein Generalist ist und nicht zwischen dem geblähten und aktivem Stadium der Verwesung unterscheiden muss. Daher wird zusätzlich die Geruchswahrnehmung des Speckkäfers Dermestes maculans betrachtet. Die Untersuchung anderer necrophager Insekten können weitere Einblicke in die Zeitabhängigkeit der Volatilemissionen während der Vertebratenverwesung geben. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse erlauben eine Korrelation zwischen Emissionen und Leichenliegezeit und können eine Grundlage für eine volatilenbasierte post mortem Zeitbestimmung für Polizeikräfte sein. Terpene, aliphatische Aldehyde, Furfural und Methoxyphenole werden von erhitztem Holz emittiert. Komponenten aus all diesen Stoffklassen werden von M. cuspidata und M. atrata wahrgenommen, da diese Käfer den Erhitzungszustand von Baumstämmen nach einem Feuer erkennen können, um einen geeigneten Ovipositionsplatz zu finden. A. nigricans nimmt vor allem Methoxyphenole wahr, wohingegen M. atrata und M. acuminata Furfural zur Orientierung verwenden. Diese Unterschiede komplementieren das bekannte Verhalten dieser Käfer in ihrer natürlichen Umgebung, da A. nigricans auf verkohlten Stämmen, die große Mengen von Methoxyphenolen emittieren, seine Eier ablegt, und M. atrata und M. cuspidata auf Stämmen ihre Eier ablegen, die vom Feuer zwar äußerlich verkohlt, aber innerlich nur erhitzt wurden und daher Furfural emittieren. Halbleitergassensoren, die Furfural mit einer ausreichenden Selektivität vermessen können, können Holzbrände schon während ansteigender Temperatur und damit vor der Entzündung detektieren. Derartige Sensoren können sowohl als neuartige Frühwarnsysteme für die holzverarbeitende Industrie als auch für Waldbrandwarnsysteme oder den Haushalt dienen

Taimelehtede lenduvühendite emissiooni induktsioon osooni ja metüül jasmonaadi mõjul

A Thesis for applying for the degree of Doctor of Philosophy in Plant PhysiologyPlants biosynthesized a wide variety of volatile organic compound (BVOCs) consisting of volatile isoprenoids, LOX products, saturated aldehydes, benzenoids, and several hydrocarbon volatiles. BVOCs have a considerable impact on biosphere–atmosphere interactions. BVOCs play key roles in attraction of pollinators, plant growth and development, plant defense against herbivores and pathogens, plant-plant signaling and protect plants against abiotic stresses such as high light, temperature and oxidative stress. Nevertheless, not all plants constitutively emit BVOCs, but all plant species can be triggered to release induced BVOCs by abiotic and biotic stress. Although a rich body of literature focuses on volatile emission in response to many abiotic stresses, the overall impact of oxidative stresses such as acute O3 and exogenous methyl jasmonate (MeJA) treatments on volatile release from leaf surface structures and mesophyll cells and their time- and dose-dependent emission kinetics is poorly understood. Exposure of plants to high concentrations of O3 significantly disturbs plant growth and development as well as productivity both in a short and long term basis. As a strong polar oxidant, O3 enters plants mainly through the stomata. Thus, stomatal conductance has a dramatic impact on the degree of damage caused by elevated O3 in plant cells regardless of the concentration of O3 around the leaf surface. Reduced stomatal conductance limits CO2 uptake and thus, declines net assimilation rate. In addition, leaf surface reactions of O3 provide another way of scavenging O3 and also act as a sink for O3 to some extent before it enters the leaf. For example, semi-volatile organic compounds exuded by the glandular trichomes of Nicotiana tabacum act as an efficient O3 sink. Once O3 enters the leaf, it can instantly react with the plasmalemma and trigger the release of reactive oxygen species (ROS) which alter several cellular functions and eventually cause cellular damage or death associated with hypersensitive reactions. Apart from abiotic stress, biotic stresses such as herbivore attack or pathogens invasion also induce VOC release from vegetative tissues into the air. Additionally, endogenous jasmonic acid (JA) and its methyl ester, methyl jasmonate (MeJA) bursts were typically observed after wounding and herbivore damage from some plants. Once released into the air, MeJA has been shown to act as a long-distance airborne signal to trigger defense responses in non-impacted parts of the damaged plant or in neighboring plants. Thus, exogenous application of MeJA has often been used to simulate the impact of a biotic stress on elicitation of jasmonate-dependent defenses. Aims of the study The overall objective of this thesis is to study the impacts of O3 and methyl jasmonate (MeJA) treatments on foliage volatile emission from a diverse set of plant species in order to gain insight into possible dose- and time-dependent modifications of the release of volatiles from both leaf surface structures, primarily glandular and non-glandular tichomes and mesophyll cells. The specific aims of the Thesis were: 1. To investigate the effects of O3 and MeJA treatments on leaf photosynthetic characteristics and BVOC emissions from a diverse set of plant species (Papers I-III). 2. To evaluate the possible protective role of non-glandular and glandular trichomes against O3 stress (Paper II). 3. To test the hypothesis that stomatal closure due to darkness and pre-exposure to lower O3 concentration protects leaves against the leaf injury induced by higher O3 exposure in Phaseolus vulgaris (Paper I). 4. To estimate how different O3 and MeJA doses alter the total amount of volatiles emission responses and how it modifies the kinetics of volatile release after initial stress applications and through recovery phase (Papers I and III). Main results Exposure of leaves to acute O3 stress caused severe visible leaf injuries and remarkable reductions in leaf physiological activities including net assimilation rate (A), stomatal conductance to water vapor (gs) and the maximum dark-adapted photosystem II (PSII) quantum yield (Fv/Fm), but the degree of changes in photosynthetic characteristics were significantly determined by O3 dose and exposure conditions (Paper I and II). Non-glandular and glandular trichomes were both present on the leaf surfaces of the 24 species studied, but there was no clear-relationship observed between non-glandular trichome density and the percentage of non-stomatal O3 deposition on leaf surface. However, the glandular trichome density was strongly correlated with the percentage of non-stomatal O3 deposition. Therefore, O3 dose threshold triggering acute physiological responses was scaled with increasing glandular trichome density. In addition, clear-changes in leaf damage and LOX product emissions caused by leaf O3 uptake were strongly linked to glandular trichome density demonstrating that species with low glandular trichome density were more sensitive to O3 stress than those species with high glandular trichome density (Paper I). Emissions bursts of methanol, LOX volatiles and methyl salicylate (MeSA) were observed during and after the exposure of P. vulgaris to O3, but enhanced MeSA emission was not detected in any of the leaves treated with pre-exposure to lower O3 concentrations (Paper II). All elicited volatile emissions exhibited a sigmoidal rise to a peak value and then, decayed to near pre-fumigation values. The emission of methanol and LOX products was dose-dependent, but MeSA emission was not strictly dose-dependent. Overall, the emission responses after all stress treatments were typical and long-lasting (Papers I and II). The changes in stomatal conductance are an important factor regulating O3 entry into leaves, and thus, it determines the extent of necrotic damage in plants caused by fumigation treatments. In Phaseolus vulgaris, the quantity of methanol and LOX products released into the atmosphere suggested that stomatal closure due to darkness and pre-exposure to low O3 protects leaves against O3-induced physiological damage (Paper II). MeJA treatment resulted in a burst of methanol, LOX products, and monoterpene and sesquiterpene emissions, but emission of these volatiles demonstrated a strong relationship between stress dose vs. emission responses. In addition, strong relationships among stress dose, and the kinetics and magnitude of volatile emission were observed in both O3 and MeJA treated leaves indicating the importance of biotic and abiotic stress severity in deciphering the downstream events of biological impacts (Papers I and III).Taimed biosünteesivad mitmesuguseid lenduvaid orgaanilisi ühendeid (BVOCs) nagu näiteks isoprenoidid, lipoksügenaasirajaproduktid (LOX-d) ehk rohulõhnakomponendid, küllastunud aldehüüdid, bensenoidid, ning erinevad süsivesinikud. Kõikidel eelpool nimetatud BVOC-del on oluline roll biosfääri ning atmosfääri vahelistes suhetes. Biogeensed lenduvühendid kaitsevad taime abiootilise stressi eest, milleks võib olla üleliigne valgus, temperatuur ja oksüdatiivne stress. Lisaks meelitavad biogeensed lenduvühendid tolmeldajaid ning pakuvad kaitset patogeenide ja kahjurputukate rünnaku eest. Mainimata ei saa jätta ka biogeensete lenduvühendite rolli taimede kasvus ja arengus ning taimede omavahelistes suhetes. Kõik taimed ei emiteeri lenduvühendeid pidevalt, kuid nii abiootilised või biootilised stressitekitajad võivad põhjustada pideva lenduvühendite emissiooni kõikidel taimedel. Üldiselt on abiootiliste stressitekitajate mõju taimede lenduvühenditele laialdaselt uuritud. Kuid oksüdatiivse stressori nagu näiteks osooni (O3) ja eksogeennse stressori nagu metüül jasmonaadi (MeJA) üldine mõju lehepinnalt või mesofüllist emiteeruvatele ühenditele, või O3-i ja MeJA-i dooside mõju lenduvühendite kineetikale, on palju vähem uuritud. Kõrge O3-i kontsentratsioon mõjutab taimede kasvu ja arengut ning seetõttu kannatab ka saagikus. Keemiliselt on O3 tugev polaarne oksüdeerija, mis siseneb taimelehte peamiselt õhulõhede kaudu. Seetõttu mõjutab taime õhulõhede juhtivus O3-stressi kulgemist taimerakkudes oluliselt, sest stressi ulatus taimes ei sõltu O3-i kontsentratsioonist väljapool taimelehte. Vähenenud õhulõhede juhtivus takistab süsihappegaasi (CO2) sisenemist taimelehte, mis omakorda vähendab fotosünteesi kiirust. Lisaks eelpool kirjeldatule võivad taime lehepinnal asetleidvad O3-ga seotud reaktsioonid alandada taimelehtedesse sisenevat O3-i kogust. Näiteks vääristubaka (Nicotiana tabacum) näärmekarvad sisaldavad poollenduvaid orgaanilisi ühendeid, mis reageerivad O3-ga. Selle tagajärjel siseneb taimelehte vähem O3-i. Taimelehes reageerib O3 koheselt rakumembraanidega ning käivitab reaktiivsete hapnikuühendite (ROS-de) vabanemise, mis muudavad rakukomponentide funktsioneerimist ning lõpuks kahjustavad rakke või hävitavad need. Erinevalt abiootilisest stressist kutsuvad ka biootilise stressi tekitajad, nagu näiteks kahjurputukate või patogeenide rünnak, esile lenduvühendite emissiooni taime vegetatiivsetest osadest. Peale taime mehaanilist vigastamist või kahjurite poolt tekitatud kahjustusi, on leitud mõnede taimede emissioonidest jasmoonhapet (JA) ja selle metüülestrit, MeJA. Stressis taimelt lendunud MeJA on kui signaal stressist puutumata naabertaimedele, sest ta aktiveerib viimastes kaitsevõime. Seetõttu töödeldakse taimi MeJA-ga ka välispidiselt, et vallandada biootilisest stressist tulenevaid ja JA-st sõltuvaid kaitsereaktsioone. Töö eesmärk: Doktoritöö üldine eesmärk oli uurida O3-i ja MeJA-i mõju erinevate taimeliikidele, et saada ülevaade lenduvühendite varieeruvusest sõltuvalt mesofüllist ja lehepinnal asetsevatest näärmekarvadest ja mehaanilistest kattekarvadest. Doktoritöö eesmärgid väljatoodult: 1. Uurida, kuidas mõjutab O3 ja MeJA erinevate taimede fotosünteesi ja lenduvate ühendite emissioone (I-III) 2. Hinnata, kas lehe kattekarvad ja näärmekarvad kaitsevad taime O3-i eest (I). 3. Testida hüpoteesi, et madal õhulõhede juhtivus, mis tekib taime hoidmisel pimedas ja taime eeltöötlemisel madala O3-i kontsentratsiooniga, kaitseb hariliku aedoa (Phaseolus vulgaris) lehti kõrge O3-i kontsentratsiooni poolt tekitatavate kahjude eest (II). 4. Hinnata, kuidas erinevad O3-i ja MeJA-i kogused mõjutavad taimede lenduvühendite emissioone ning milliseks kujuneb lenduvühendite emissioon kohe peale stressi rakendamist ja hiljem stressist taastumise ajal (I, III). Põhilised tulemused: Akuutne O3 põhjustas tõsiseid ja nähtavaid kahjustusi taimelehtedel ning vähendas märkimisväärselt lehe füsioloogilist aktiivsust sealhulgas fotosünteesi kiirust, õhulõhede juhtivust ja fotosüsteem II tootlikkust (Fv/Fm), kuid kõigi fotosünteesinäitajate muutuste ulatus sõltus O3--i kontsentratsioonist ja selle rakendamise tingimustest (I, II). Kõigil 24 uuritud taimeliigil esinesid nii näärmekarvad kui ka mehaanilised kattekarvad. Uuringust selgus, et erinevalt mehaaniliste kattekarvade tiheduset sõltus lehepinna kaudu sisenenud O3-i hulk näärmekarvade tihedusest. O3-doosidest tingitud akuutse füsioloogilise reaktsooni ulatus oli seda suurem, mida suurem oli näärmekarvade tihedus taimelehel. Lisaks oli O3-st tekkinud lehepinna kahjustuste ulatus seotud LOX-de emissiooniga, mis näitab seda, et madalama näärmekarvade tihedusega taimeliigid olid O3-stressile vastuvõtlikumad kui tihedamate näärmekarvadega taimeliigid (I). O3-ga töötlemise ajal ning peale O3-i kasutamist emiteeris harilik aeduba P.vulgaris metanooli, LOX-e ja MeJA-i. Juhul kui enne kõrge O3-i kontsentratsiooni kasutamist oli taimelehte hoitud madala O3-i kontsentratsiooniga keskkonnas, MeJA-i emissioon ei suurenenud (II). Teatud ajahetkel saavutas kõigi eelpool nimetatud lenduvühendite emissioon maksimumi ja seejärel langes stressieelsele tasemele. Erinevalt MeJA-st sõltus metanooli ja LOX-de emissioon O3-i doosist. Üldiselt põhjustas O3 talle omase lenduvühendite emissiooni, lisaks olid emissioonid pikaajalised (I, II). See, kuivõrd ulatuslik on taimelehe kärbumine peale taime fumigeerimist O3-ga, sõltub õhulõhede juhtivusest taime osoneerimise ajal. Hariliku aedoa poolt emiteeritud metanooli ja LOX-de tase viitab sellele, et pimeduse ja madala O3-i kontsentratsiooniga eeltöötlemise poolt tingitud õhulõhede sulgumine kaitseb taime hilisemate O3-i kahjustuste eest, mida tekitab O3-i kõrge kontsentratsioon (II). Taime töötlemine MeJA-ga põhjustas metanooli, LOX-de ning mono- ja seskviterpeenide emissiooni. Kõigi eelpool nimetatud volatiilide emissioonide tase sõltus MeJA-i doosist. Lenduvühendite emissiooni tase ja emissiooni kineetika oli seotud nii O3-i kui ka MeJA-i doosiga (I, III).Publication of this thesis is supported by the Estonian University of Life Science and by the Doctoral School of Earth Science and Ecology created under the auspices of European Social Fund. This study was supported by the Estonian Ministry of Science and Education (institutional grant IUT-8-3), the European Commission through the European Regional Development Fund (Centre of Excellence EcolChange, TK 131), and the European Research Council (advanced grant 322603, SIP-VOL+)