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Ewing-Sarkom mit primÀrer Lungenmetastasierung:Analyse der Daten von 182 Patienten aus den (EI)CESS-Studien ; Patientencharakteristik, Therapiestrategien und prognostische Faktoren
Seit den 80er Jahren wurden in den (EI)CESS-Studien 182 paediatrische Patienten mit Ewing-Sarkom und pulmonaler Metastasierung dokumentiert. Die Arbeit bietet einen Ăberblick ĂŒber die Patientencharakteristik und stellt als prognostische Faktoren insbesondere eine beidseitige Lungenbestrahlung und eine intensive Chemotherapie als gĂŒnstige Faktoren heraus. Die Daten der Analyse trugen wesentlich zur Konzeption des Therapieschemas der internationalen Ewing-Sarkom-Studie Euro-E.W.I.N.G 99 bei
Evaluation einer Anwendung von EWS-FLI1 Fusionstranskripten als nicht-invasive Tumormarker beim Ewing-Sarkom
Background & aims: For Ewing sarcoma, unlike many other tumors, there is currently no meaningful target as liquid biopsy. However, tumor burden is of considerable importance for prognosis and therapy. Cell free nucleic acids show high potential as biomarker of cancer. The use of cell free tumor DNA (ctDNA) already provides a minimally invasive method to monitor tumor burden. Individual assays are necessary to quantify tumor specific fusion transcripts (e.g. EWS-FLI1). An advantage of RNA based detection methods is the use of one assay for a variety of samples. Results in vitro have shown to be promising, investigations in vivo have so far been unsuccessful.
Material & methods: Optimization of isolation and detection methods of exosomal RNA was performed on cell culture supernatant of Ewing sarcoma cell lines. To simulate pre-analytical impact factors, a stress situation was induced by reducing the fetal calf serum (FCS) concentration in vitro. In addition, healthy donorsâ plasma samples were used to analyze the integrity of exosomes depending on storage time and storage temperature. Subsequently, the detection of EWS-FLI1 fusion transcripts in Ewing sarcoma patientsâ plasma samples was investigated. In addition, a Ewing sarcoma Xenograft model allowed an evaluation of plasma samples using murine, human and EWS FLI1 specific primers. Fusion transcripts were quantified by Droplet Digital PCR.
Results: In vitro, the percentage of EWS-FLI1 specific transcripts showed an average of 6.9 % compared to the human housekeeping gene h.B2M. Even after inducing stress, no enhanced release of EWS-FLI1 specific transcripts was detected in cell culture supernatant. Furthermore, the integrity of exosomes was ensured in vivo depending on storage time and storage temperature. Despite high tumor infiltration as well as sample volumes up to 4000 ”l, no EWS-FLI1 fusion transcripts were detectable in present plasma samples. Finally, a xenograft model showed that EWS-FLI1 specific transcripts are only a minimal portion of less than 0.3 % compared to the amount of B2M in plasma samples.
Conclusions: Not only low amounts of EWS-FLI1 specific transcripts in plasma samples but also high levels of background signals due to wild type transcripts affect detection rates despite of optimized methods. With a range of up to several hundred milliliters of blood, even increasing sample volumes could not solve that problem. In summary, this dissertation showed for the first time why exosomal RNA has not been established as liquid biopsy for Ewing sarcoma so far.Hintergrund & Ziele: FĂŒr das Ewing-Sarkom gibt es bislang im Gegensatz zu vielen anderen Tumoren keinen aussagekrĂ€ftigen Serummarker. Die Tumorlast ist hier jedoch von erheblicher Bedeutung fĂŒr die Prognose und Therapie. Zellfreie NukleinsĂ€uren weisen ein hohes Potenzial als Biomarker auf. Die Verwendung zellfreier Tumor DNA (ctDNA) stellt derzeit bereits eine minimalinvasive Methode zur Ăberwachung der Tumorlast bei Ewing-Sarkom Patienten dar. Dabei werden individuelle Assays zur Quantifizierung der tumorspezifischen Fusionssequenzen (z.B. EWS-FLI1) fĂŒr das Monitoring eingesetzt. Ein Vorteil RNA basierter Nachweisverfahren liegt in der möglichen Anwendung eines Assays fĂŒr eine Vielzahl von Proben. Ergebnisse in vitro zeigten sich bereits als vielversprechend, Untersuchungen in vivo waren bislang ohne Erfolg.
Material & Methoden: Die Optimierung von Isolations- und Nachweisverfahren exosomaler RNA erfolgte an ZellkulturĂŒberstand von Ewing Sarkom Zelllinien. Zur Simulation prĂ€analytischer Einflussfaktoren wurde durch Reduktion des Gehaltes an fetalem KĂ€lberserum (FCS) in vitro eine Stresssituation induziert. Zudem wurden Plasmaproben gesunder Kontrollpersonen herangezogen, um die IntegritĂ€t der Exosomen abhĂ€ngig von Lagerungsdauer und -temperatur zu untersuchen. AnschlieĂend wurde der Nachweis EWS-FLI1 spezifischer Transkripte im Plasma von Patienten mit Ewing Sarkom untersucht. AuĂerdem konnten mithilfe eines Ewing Sarkom Xenograft Modells Plasmaproben unter Verwendung muriner, humaner und EWS-FLI1 spezifischer Primer analysiert werden. Die Quantifizierung der Transkripte erfolgte mittels Droplet Digital PCR (ddPCR).
Ergebnisse: In vitro zeigte sich ein Anteil EWS-FLI1 spezifischer Kopien von durchschnittlich 6,9 % im Vergleich zum humanen Housekeeping Gen h.B2M. Auch nach Induktion einer Stressreaktion konnte keine verstĂ€rkte Freisetzung von Ewing Sarkom spezifischen Fusionstranskripten nachgewiesen werden. Die IntegritĂ€t von Exosomen konnte abhĂ€ngig von Lagerungsdauer und -temperatur in vivo gesichert werden. Im Blut von Patienten mit Ewing Sarkom konnten jedoch selbst bei fortgeschrittenen Erkrankungsstadien und Plasmavolumina bis zu 4000 ”l keine EWS-FLI1 spezifischen Transkripte detektiert werden. Ein Ewing Sarkom Xenograft Modell zeigte schlieĂlich, dass Ewing Sarkom spezifische Transkripte im Vergleich zu den Kopien des Housekeeping Gens B2M mit weniger als 0,3 % nur einen minimalen Bestandteil einnehmen.
Schlussfolgerung: Nicht nur der geringe Anteil EWS-FLI1 spezifischer Transkripte im Plasma, auch ausgeprĂ€gte Hintergrundsignale durch Wildtyptranskripte erschweren die Detektion trotz optimierter Verfahren. Eine kompensatorische Erhöhung des Probenvolumens kann in der Praxis aufgrund von GröĂenordnungen von mehreren hundert Millilitern Blut nicht umgesetzt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte damit erstmals aufgeklĂ€rt werden, warum der Einsatz exosomaler RNA als Biomarker beim Ewing Sarkom bisher nicht erfolgreich etabliert werden konnte
Aspekte der antineoplastischen Wirkung der PLK4-Inhibitoren CFI-400945 und Centrinone auf Ewing-Sarkom-Zellen
Purpose: Polo-like kinase 4 (PLK4) inhibitors, such as CFI-400945 and centrinone, are emerging as promising antineoplastic agents. However, their effectiveness against Ewing's sarcoma, a highly aggressive childhood cancer, remains to be established. Methods: CFI-400945 and centrinone were tested in three Ewing's sarcoma cell lines with different TP53 status. Effects were assessed by flow-cytometric analyses of cell death, dissipation of the mitochondrial transmembrane potential and cell cycle distribution, by cell viability assay as well as by caspase 3/7 activity measurement, by immunoblotting and by immunofluorescence microscopy. Results: CFI-400945 and centrinone elicited cell death in p53 wild-type and mutant Ewing's sarcoma cells. Both agents induced mitochondrial membrane depolarisation, caspase 3/7 activation, PARP1 cleavage and DNA fragmentation, indicating an apoptotic form of cell death. In addition, the PLK4 inhibitors induced G2/M cell cycle arrest, particularly when cell killing was attenuated by the pan-caspase inhibitor z-VAD-fmk. Moreover, CFI-400945 treatment produced polyploidy. Conclusion: Our findings show that PLK4 inhibitors were effective against Ewing's sarcoma cells in vitro and thus provide a rationale for their evaluation in vivo
Neue Aspekte der Pathologie des Nierenzellkarzinoms
Zusammenfassung: Die neuen Behandlungsmöglichkeiten fĂŒr Nierenzellkarzinome haben das Interesse an der Histogenese und den molekularen VerĂ€nderungen von Nierentumoren erheblich verstĂ€rkt. Die aktuelle Klassifikation der Nierentumoren beruht auf spezifischen molekularen VerĂ€nderungen und charakteristischen biologischen Eigenschaften. Es wurden in den letzten Jahren mehrere neue Tumortypen identifiziert, deren Kenntnis erheblichen Einfluss auf die Auswahl der Behandlungsstrategien hat. In der vorliegenden Ăbersichtsarbeit wird die aktuelle Nomenklatur der Nierenneoplasien unter besonderer BerĂŒcksichtigung neuer Nierentumortypen diskutiert. Die Kenntnis von Xp11-Translokationskarzinomen und Nierentumoren mit dominanter Zystenbildung ist diagnostisch relevant. Bestimmte Genotyp-PhĂ€notyp-Korrelationen haben zunehmenden Einfluss auf die Auswahl der Therapieverfahren und die EinschĂ€tzung der Prognose. Gleichzeitig fĂŒhrt eine umfangreichere pathologisch-anatomische Aufarbeitung von NephrektomieprĂ€paraten unter besonderer BerĂŒcksichtigung des Nierenhilus zu einer korrekteren TNM-Stadienklassifikation mit genauerer Prognosevorhersage mit sic
Diagnose von Weichteiltumoren in der Zytologie
Zusammenfassung: Weichteilschwellungen sind das Symptom einer Vielzahl von neoplastischen und nichtneoplastischen VerĂ€nderungen. Sarkome gehören zu den selteneren Ursachen. Die Feinnadelpunktion hat sich in der AbklĂ€rung von Tumorrezidiven und Karzinommetastasen als minimal-invasive, kostengĂŒnstige und zuverlĂ€ssige Methode bewĂ€hrt. Auch in der AbklĂ€rung von Weichteiltumoren kann sie zu einer prĂ€zisen Diagnose fĂŒhren. Voraussetzung ist eine enge multidisziplinĂ€re Zusammenarbeit unter Einbeziehung klinischer, radiologischer und morphologischer Befunde. FĂŒr die zytologische Befundung sind Alter und Geschlecht sowie Topographie, GröĂe und Wachstumsgeschwindigkeit des Tumors wichtige Parameter. Reifungsgrad und Form der Zellen sowie Vorhandensein und Ausdifferenzierung der bindegewebigen Matrix bieten erste differenzialdiagnostische Hinweise und sind der Ausgangspunkt fĂŒr immunzytochemische und molekularbiologische (FISH, RT-PCR) Zusatzuntersuchen. Diese Untersuchungen werden an Direktausstrichen, an mittels Zellblockmethode eingebettetem und an tiefgefrorenem Punktionsmaterial ausgefĂŒhr
Modulation of apoptosis and signalling in cancer cells after treatment with epigenetic modulators
Krebs wurde lange Zeit als eine genetische Erkrankung angesehen. Inzwischen ist jedoch klar, dass auch epigenetische VerĂ€nderungen an der Krebsentstehung beteiligt sind. Eine wichtige epigenetische Modifikation ist die Histon-Acetylierung, deren Fehlregulierung das Krebswachstum stimulieren kann. Mit den Histondeacetylase-Inhibitoren (HDACi) lĂ€sst sich hier korrigierend eingreifen. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen untersucht, mit denen HDACi als Monosubstanzen oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen gegen Krebszellen wirken. HDACi können einen Zellzyklus-Arrest in der G2/M-Phase induzieren. In der Untersuchung des zugrunde liegenden Mechanismus stellten wir fest, dass HDACi die Phosphorylierung von H2AX, einem Marker fĂŒr DNA-SchĂ€digung, und ATM, einem SchlĂŒsselenzym in der zellulĂ€ren Reaktion auf DNA-SchĂ€den, bewirkten. In der weiteren Analyse der Faktoren, die an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt sind, i. e. dem Proteasom, NF-ÎșB und p53, beobachten wir, dass der Proteasom-Hemmstoff Bortezomib, NF-ÎșB-Inhibitoren und der p53-Aktivator Nutlin-3 den G2/M-Arrest deutlich modulierten. Zudem fĂŒhrten diese Analysen eine kooperative antineoplastische Wirkung von HDACi und Nutlin-3 zu Tage. Nutlin-3 wird als ein aussichtsreicher Wirkstoff zur Behandlung von Tumoren mit Wildtyp-p53 (wt-p53) angesehen. In der Untersuchung der Kombination von Nutlin-3 und HDACi beobachteten wir, dass diese Kombination in wt-p53-Zellen, aber nicht in p53-Null-Zellen, synergistisch den Zelltod auslöste. Die Analysen zum Mechanismus des Nutlin-3/HDACi-Synergismus zeigten, dass HDACi die p53-Acetylierung induzierten und die Genexpression der p53-Inhibitor-Proteine MDM2 und MDM4 deutlich reduzierten. Das Ewing-Sarkom ist der zweithĂ€ufigste Knochenkrebs bei Kindern. Da Ewing-Sarkome in nur zehn Prozent der FĂ€lle p53-Mutationen aufweisen, sollten 90 % auf p53-gerichtete Behandlungen ansprechen können. Wir ĂŒberprĂŒften darum die Wirksamkeit von Nutlin-3 in Ewing-Sarkom-Zelllinien und beobachteten, dass Nutlin-3 in wt-p53-Zellen p53 stabilisierte, die Expression von p53-regulierten Genen (MDM2, p21, PUMA) induzierte und die Apoptose auslöste. Unsere Befunde legen nahe, dass Nutlin-3 ein effektiver Wirkstoff zur Behandlung von Ewing-Sarkomen sein könnte
Die Wirkung des Sirtuininhibitors Tenovin-1 im Vergleich zu den Histondeacetylaseinhibitoren SAHA und MS-275 auf den RETRA-induzierten Zelltod in p53-mutierten, -Null und -Wildtyp Ewing-Sarkom-Zellen
Das Ewing-Sarkom ist der zweithĂ€ufigste primĂ€re Knochentumor im Kindesalter (Balamuth und Womer 2010). Zwar konnte in den letzten Jahrzehnten dank verbesserter Therapiemöglichkeiten das progressionsfreie Ăberleben erhöht werden, jedoch weist eine metastasierte Erkrankung immer noch eine schlechte Prognose und ein Ăberleben von maximal 30 % auf (Cotterill et al. 2000). Die in diesem Zusammenhang durchgefĂŒhrte Forschungsarbeit untersuchte die antineoplastischen Effekte der Behandlung der Histondeacetylase-Inhibitoren (HDACi) SAHA und MS-275 bzw. des Sirtuininhibitors (SIRTi) Tenovin-1 in Kombination mit dem p73-Aktivator RETRA in Ewing-Sarkom-Zellen mit unterschiedlichem p53-Status. RETRA ist ein neuer niedermolekularer Wirkstoff, der die Interaktion zwischen dem mutierten Tumorsuppressorprotein p53 und p73 inhibiert, wodurch das freie p73 seine TumorsuppressoraktivitĂ€t entfalten kann (Kravchenko et al. 2008). Zur Untersuchung des Zelltodes wurden zytometrische Analysen, wie die Propidiumjodid-Aufnahme, die Messung des mitochondrialen Membranpotenzials sowie der Caspase-3-AktivitĂ€tstest verwendet. Sowohl in mutierten, Null- und Wildtyp-p53-Zellen konnte durch die Behandlung von RETRA der Zelltod induziert werden. Dieser zytotoxische Effekt konnte in allen Zelllinien durch die jeweilige Applikation mit den HDACi SAHA und MS-275 deutlich gesteigert werden. Hingegen wurde durch die Zugabe des SIRTi Tenovin-1 eine AbschwĂ€chung der ZytotoxizitĂ€t von RETRA in allen Zelllinien beobachtet. Des Weiteren sollten Genexpressionsanalysen des p21, eines Zielgens von p53, einen Aufschluss ĂŒber den Wirkungsmechanismus der verwendeten Substanzen geben. In meiner Promotion konnte die VerstĂ€rkung des RETRA-induzierten Zelltodes durch die Zugabe der HDACi SAHA und MS-275 unabhĂ€ngig vom p53-Status nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu fand durch den Sirtuininhibitor Tenovin-1 eine Abnahme des RETRA-induzierten Zelltodes statt, was eine mögliche tumorsuppressive Funktion der Sirtuine in Ewing-Sarkom-Zellen vermuten lĂ€sst. Diese Ergebnisse zeigen die mögliche Verwendung der HDACi SAHA und MS-275, nicht aber Tenovin-1, in Kombination mit RETRA als neue erfolgsversprechende Antitumortherapie des Ewing-Sarkoms auf
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