Promiskuitet enzima

Biokataliza je jedno od najvažnijih svojstava živog svijeta. Ona omogućava kontrolirano odvijanje kemijskih reakcija brzinom koja omogućava život stanice i multistaničnih organizama. Enzimi, biološki katalizatori, u literaturi su često opisani kao vrlo specifični i efikasni, no u zadnje vrijeme otkriveno je da velik broj posjeduje promiskuitetne aktivnosti. Promiskuitet enzima definira se kao slučajna kataliza reakcija koje se razlikuju od onih za koje je enzim evoluirao. Kataliza promiskuitetnih reakcija se vrlo rijetko dogaĎa in vivo, a kada i doĎe do katalize promiskuitetne reakcije to je često uzrokovano nekom vrstom staničnog stresa. Kataliza promiskuitetnih reakcija može se odvijati u istom aktivnom mjestu kao i kataliza nativne reakcije, ali bočni ogranci aktivnog mjesta koji sudjeluju u katalizi mogu biti različiti i/ili mogu imati različite funkcije u katalizi promiskuitetne reakcije u odnosu na katalizu nativne reakcije. Pretpostavlja se da su prvi enzimi posjedovali vrlo široku specifičnost, odnosno da je jedan enzim katalizirao cijeli niz reakcija te da su s vremenom kroz duplikacije, mutacije i selekciju postali onakvima kakve znamo danas. Iako još uvijek nema puno informacija o mehanizmima evolucije enzima, pretpostavlja se da promiskuitetne aktivnosti enzima mogu biti početna točka za evoluciju novih funkcija enzima

Role of the protective gene Heme Oxygenase-1 in the control of T cell mediated responses

Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas, (Ciências Biopatológicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2008As reacções inflamatórias, geralmente desencadeadas por infeccões e/ou lesões a nível dos tecidos, desempenham um papel fundamental na iniciação de respostas imunes adaptativas e conduzem, em última análise, à eliminação do evento instigador. São vários os mecanismos intrínsecos a esta resposta complexa que asseguram, após a remoção do estímulo nocivo, a correcta reparação quer a nível estrutural quer funcional do tecido afectado, ou seja, o regresso à homeostase. A importância destes mecanismos pode ser comprovada pelo facto de a não resolução das reacções inflamatórias ser uma etapa crítica para o estabelecimento e/ou progressão de um número crescente de patologias. Um dos mecanismos envolvidos na resolução da inflamação consiste na expressão do enzima Heme Oxygenase-1 (HO-1). Em condições inflamatórias, a HO-1 torna-se o enzima limitante no catabolismo dos grupos hémicos livres dando origem a quantidades equimolares de monoxido de carbono (CO), ferro (Fe) e biliverdina (BV). Estes produtos reduzem a reacção inflamatória e evitam o desenvolvimento de doenças inflamatórias. Esta Tese teve como objectivo examinar o papel da HO-1 na regulação do estabelecimento e progressão de condições neuroinflamatórias mediadas por linfócitos T. O trabalho agora apresentado sugere que a HO-1 dita o resultado patológico associado com processos neuroinflamatórios em ratinho, tais como a encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de esclerose múltipla (EM), ou a malária cerebral experimental (MCE) resultante da infecção com Plasmodium spp.Inflammatory reactions, elicited in most cases upon infection and/or injury, are critical for the initiation of adaptive immunity and ultimately lead to the removal of the inciting stimuli. Intrinsic to this complex response, there are several mechanisms that operate to ensure that, once the inciting stimulus is dealt with, structural and functional repair of the injured site is attained, i.e. return to homeostasis. However, failure to resolve inflammatory reactions is thought to contribute in a critical manner to the establishment and/or progression of a growing list of pathologic conditions. One of the mechanisms involved in the resolution of inflammation relies in the expression of Heme Oxygenase (HO)-1. Under inflammatory conditions, HO-1 becomes the rate-limiting enzyme in the catabolism of heme, yielding equimolar amounts of carbon monoxide (CO), free iron (Fe) and biliverdin (BV). These heme degradation products dampen inflammation and prevent the development of inflammatory diseases. The focus of this Thesis was to address whether HO-1 regulates the establishment and progression of T cell-mediated neuroinflammatory conditions. The body of work presented herewith suggests that HO-1 can dictate the pathologic outcome of neuroinflammation in mice, as it occurs either during autoimmunity-driven experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a model of multiple sclerosis (MS), or during experimental cerebral malaria (ECM) triggered upon infection with Plasmodium spp. Induction of EAE in HO-1-deficient (Hmox-1-/-) mice led to enhanced central nervous system (CNS) demyelination, paralysis and mortality, as compared to wild-type (Hmox-1+/+) mice. Pharmacological induction of HO-1 expression after EAE onset improved the clinical course of the disease, an effect associated with inhibition of T helper (TH) and CD8+ T cell accumulation, proliferation and effector function within the CNS. HO-1 did not act via modulation of the suppressor activity of naturally occurring regulatory T cells (Treg), known to ensure peripheral tolerance to self-antigens and immune homeostasis. Furthermore, under homeostatic conditions Treg development, maintenance and function were found to be independent of HO-1, as assessed in Hmox-1-/- mice. Instead, the mechanism underlying the protective effect of HO-1 is shown to rely on its ability to inhibit major histocompatibility complex (MHC) class II expression by antigen presenting cells, including dendritic cells, microglia and macrophages. Likewise, Hmox-1 deletion or pharmacological inhibition of its activity resulted in increased ECM incidence in otherwise resistant mouse strains whereas pharmacological induction of HO-1 greatly reduced ECM incidence in susceptible mouse strains. The protection afforded by pharmacological induction of HO-1 expression was associated with decreased CD8+ T cell sequestration in the CNS, a critical event in the development of neurological damage associated with ECM. In both pathologies, i.e. EAE and ECM, exogenous CO mimicked these protective effects, suggesting that CO is the main contributor to the protective action of HO-1. Finally, we present evidence of a novel mechanism by which CO counters the development of one of these pathologies, ECM, based on its ability to bind hemoglobin, prevent its oxidation and subsequently the generation of free heme, a central effector molecule in the pathogenesis of ECM. Overall, the findings presented in this Thesis suggest that, during the establishment and/or progression of neuroinflammation, HO-1 and/or CO limit the deleterious effects associated with neuroinflammatory responses, possibly by modulating antigen presenting cells activity, in a manner that prevents the pathologic outcome of these conditions. Further, these results support the notion that pharmacological modulation of HO-1 or CO administration might be potential therapeutic strategies to counter neuroinflammatory diseases

Promiskuitet enzima: : evolucijski i mehanistički aspekti

Enzimi su biološki katalizatori. Oni ubrzavaju kemijske reakcije ne mijenjajući konstantu ravnoteže već smanjujući energiju aktivacije. Po svom sastavu su proteini, s tim što postoje i katalitički aktivne ribonukleinske kiseline koje se nazivaju ribozimi. Imenuju se prema specifičnim pravilima koja jasno opisuju reakcije koje određeni enzimi kataliziraju. Izrazito su specifični što znači da svaki enzim katalizira točno određenu reakciju, odnosno ima aktivno mjesto prilagođeno za određeni supstrat. Aktivno mjesto je ono u kojem se odvija pretvorba supstrata u produkt preko nastanka enzim – supstrat kompleksa. Enzimski katalizirane reakcije opisuju se Michaelis – Menten modelom iz kojeg se izvodi izraz koji povezuje početnu brzinu reakcije s koncentracijom supstrata te se iz njega mogu dobiti sve informacije o promatranoj reakciji. Isto tako postoje različiti mehanizmi enzimski kataliziranih reakcija kao i načini regulacije enzimske aktivnosti. Specifičnost enzima dovedena je u pitanje nakon što je definiran pojam koji se naziva promiskuitet enzima. To je svojstvo enzima da katalizira dodatne reakcije pored glavne reakcije koju katalizira. Ove dodatne reakcije su uglavnom mnogo sporije od glavne reakcije koju katalizira promiskuitetni enzim. Iako su dodatne reakcije fiziološki irelevantne, promiskuitet enzima s evolucijskog stajališta može se reći da služi kao početna točka za razvoj novih funkcija enzima kroz mutacije ili usmjerenu laboratorijsku evoluciju. Mehanistički aspekt nastoji objasniti zašto dolazi do promiskuiteta enzima. Zaključak je da promiskuitetne aktivnosti enzima nisu loše već su vrlo korisne te, između ostalog, pomažu razvoju biotehnoloških sustava

Otkriće enzima za razgradnju plastike

Plastics are highly advanced materials that have a vast array of applications and are produced globally in an approximate amount of 350 to 400 million tons every year. Nevertheless, there are serious concerns about plastic waste and pollution as a result of the misuse and lack of control of their use in industries, including packaging, transportation, manufacturing, and agriculture. Approximately 1,000 years are required for plastic bags to decompose efficiently. Additionally, CO2 and dioxins are released into the atmosphere by burning plastics, and they contribute to global warming. The Earth’s environment is overwhelmed with waste, mostly from poor recycling practices and low circular usage, resulting in millions of tons of waste generated annually. To combat this, new technologies for recycling post-consumer plastics are desperately needed to decrease plastic waste and improve the environment, while also finding ways to utilise these materials. Due to the inadequate disposal methods currently available for plastic waste, there has been increased interest in the use of microorganisms and enzymes designed for the biodegradation of non-degradable synthetic polymers via biocatalytic depolymerisation indicating that plastics treatment and recycling can be more efficient and sustainable.Plastika je daleko najnapredniji materijal kad je riječ o primjeni i svojstvima, a procjenjuje se da se svake godine globalno proizvede 350 do 400 milijuna tona. Ona je postala ozbiljan problem s obzirom na odlaganje plastičnog otpada i onečišćenje, zbog njezine nekontrolirane upotrebe u različite svrhe tijekom posljednjih desetljeća, kao što su pakiranje, transport, industrija i poljoprivreda. Za učinkovitu razgradnju plastičnih vrećica potrebno je otprilike 1000 godina. Osim toga, izgaranjem plastike u atmosferu se ispuštaju CO2 i dioksini koji doprinose globalnom zatopljenju. Zemaljski kopneni ili morski okoliš akumulira milijune tona otpada svake godine zbog lošeg recikliranja i niske kružne upotrebe. Inovativne tehnologije za recikliranje otpadne plastike prijeko su potrebne za smanjenje plastičnog otpada i postizanje ciljeva kvalitete okoliša uz valorizaciju potrošne plastike. Zbog trenutačno neadekvatnih metoda zbrinjavanja plastičnog otpada povećan je fokus na upotrebu mikroorganizama i enzima dizajniranih za biorazgradnju nerazgradivih sintetičkih polimera putem biokatalitičke depolimerizacije, što ukazuje na to da obrada plastike i recikliranje mogu biti učinkovitiji i održivi

LPMO – ključni enzim u održivoj pretvorbi lignocelulozne biomase

The importance of the lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) enzyme in the preparation of lignocellulosic raw materials for production in biorefineries has been confirmed in numerous investigations. Therefore, LPMO enzymes were investigated to explore the enzyme-substrate interaction with the aim of successful biomass conversion in biorefinery processes. After reductive activation of LPMOs active site, they cleave the substrate and prepare it for biomass degradation by hydrolytic enzymes. In this paper, the role of LPMO in lignocellulosic biomass conversion is described based on the recent studies of: LPMO enzyme structure, LPMO substrate preferences, and the LPMO reaction mechanism. These findings are important for the selection of suitable bioprocess conditions with the aim of LPMO activation/stabilisation in biorefinery production processes.Važnost enzima litičke polisaharidne monooksigenaze (LPMO) u pripremi lignoceluloznih sirovina za proizvodnju u biorafinerijama potvrđena je u brojnim istraživanjima. Stoga su istražene i interakcije LPMO enzima i supstrata s ciljem primjene tih istraživanja u uspješnoj pretvorbi lignocelulozne biomase u biorafinerijama. Nakon redukcije aktivnog mjesta LPMO enzima dolazi do vezanja i razgradnje supstrata te pripreme za djelovanje hidrolitičkih enzima. U ovom radu opisana je uloga LPMO enzima u pretvorbi lignocelulozne biomase na temelju nedavnih istraživanja: strukture LPMO enzima, specifičnosti supstrata na koje djeluje i mehanizma reakcije. Ova istraživanja važna su za odabir prikladnih uvjeta bioprocesa s ciljem aktivacije/stabilizacije LPMO enzima tijekom proizvodnje u biorafinerijama

Hidrólise de concentrado proteico de soro de queijo com tripsina imobilizada em resíduos da indústria cervejeira

Neste trabalho utilizou-se um sub-produto da indústria cervejeira proveniente do malte com um teor elevado em celulose, a drêche, como suporte de imobilização para tripsina. Efectuaram-se hidrólises de concentrado proteico de soro de queijo com tripsina imobilizada com diferentes condições de pH e temperatura de forma a determinar os valores óptimos de operação. O perfil dos hidrolisados resultantes foi posteriormente analisado por cromatografia líquida de alta performance em fase reversa. O valor óptimo de operação com tripsina imobilizada ocorreu a 60 ºC, superior à temperatura correspondente com enzima livre. A actividade da enzima imobilizada em drêche foi bastante inferior à da enzima livre. O perfil de péptidos obtido com os dois tipos de enzima foi semelhante.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); Fundo Social Europeu

Caracterizacion estructural de la proteina alcohol acil transferasa asociada a la biosintesis de compuestos volatiles en Vasconcellea pubescens

89 p.El aroma de los frutos es un importante atributo de calidad que influye en la aceptación del consumidor, es un carácter complejo, determinado por un conjunto de compuestos volátiles de bajo peso molecular. En Vasconcellea pubescens (papaya cultivada en Chile) el aroma del frutos es atribuido principalmente a ésteres de bajo peso molecular, los cuales son producidos mediante reacciones de esterificación entre alcoholes y acil CoAs catalizadas por la enzima Alcohol Acil Transferasa (VpAAT1). Con el objeto de aumentar nuestro entendimiento acerca de la producción de aroma durante el proceso de maduración del fruto V. pubescens, se realizó un estudio de los mecanismos moleculares de la VpAAT1, mediante la técnica de modelamiento comparativo, construyendo la estructura tridimensional de la enzima la cual fue validada y refinada mediante dinámica molecular. El modelo resultante mostró que la proteína está formada por 15 hojas β, 11 α hélices y 4 hélices denominadas Hélices 310. El sitio activo de la proteína es el segmento HTMSD y se encuentra en un loop entre la hoja β 7 y la α hélice 5. La dinámica molecular de 2ns mostró que la H166 y D170 forman parte del sito activo, orientando sus cadenas laterales hacia un canal de solvente presente en el centro de la enzima, permitiendo una interacción directa entre estos residuos con acil-CoA y alcohol. Por docking molecular se exploraron las diversas posibilidades de interacción entre la proteína y sus dos ligandos. Para la interacción con alcoholes y acil CoAs se sugiere la conformación más estable del complejo formado por estas tres moléculas de forma de reproducir el posible mecanismo catalítico de la enzima. Al mutar la H166 por Alanina, se determinó la importancia del residuo de Histidina dentro de la actividad catalítica de la enzima, lo cual reflejó diferencias importantes en los valores energéticos de la enzima silvestre versus la mutante, siendo más estable la proteína silvestre. De esta manera, el modelo sugiere el mecanismo de acción de la enzima VpAA

Computational investigation of acyl-CoA thioesterase I (TesA) from the bacteria Pseudomonas aeruginosa in complexes with ibuprofen and naproxen derivatives

GDSL hidrolaze su relativno slabo istražena porodica enzima. Karakterizira ih GDSL strukturni motiv koji se nalazi oko serina katalitičke trijade. Odlikuje se izraženim supstratnim promiskuitetom što ih čini zanimljivim područjem istraživanja, kako zbog fundamentalnog značaja, tako i zbog potencijalne primjene u farmaceutskoj i biotehnološkoj industriji. Jedan od enzima iz te porodice je Acil-CoA tioesteraza I (TesA) iz patogene bakterije Pseudomonas aeruginosa koji je istraživan u ovome radu. Računalnim metodama prilagođenim istraživanju biokemijskih sustava, prvenstveno Monte Carlo konformacijskom pretragom i simulacijama molekulske dinamike, istražena je mogućnost produktivnog vezanja derivata ibuprofena i naproksena u aktivno mjesto enzima TesA. Pronađene su ključne interakcije za vezanje navedenih supstrata u aktivno mjesto enzima te interakcije koje se razlikuju između enatiomera istog lijeka. Računalno je istražen utjecaj mutacije L78F na enatioselektivnost enzima prema istraženim derivatima ibuprofena i naproksena. Produktivno vezanje utvrđeno je za derivat R-ibuprofena sa divljim tipom i mutantom enzima TesA te za derivat R-naproksena sa mutiranim enzimom. Također, pronađen je hidrofobni džep u blizini aktivnog mjesta enzima važan za vezanje supstrata i opisane su nevezne interakcije enzima i kovalentnog intermedijera supstrata potrebne za katalitičku reakciju te utjecaj mutacije L78F na navedene interakcije.GDSL hydrolases are relatively poorly described enzyme family. They contain a GDSL structural motif centered around nucleophilic serine from catalytic triad. They are characterized by substrate promiscuity, which makes them an interesting area of research, both for fundamental scientific value and potential uses in pharmaceutic and biotech industry. One of the enzymes from that family shown to be an interesting research target is Acyl-CoA thioesterase (TesA) from Pseudomonas aeruginosa, which was studied in this thesis. Computational biochemistry methods, primarily Monte Carlo conformational search and molecular dynamics simulations, were used to test possibilities of catalytically productive substrate binding for ibuprofen and naproxen derivatives. Key interactions for active site binding were identified, as well as differences in binding between enantiomers of the same compound. Amino acid mutation L78F was introduced in silico and its effect on substrate binding and enantioselectivity was computationally assessed. Productive binding was obtained for R-ibuprofen derivate, both with wild-type enzyme and L78F mutant, as well as for R-naproxen derivate with mutated enzyme. Hydrophobic cavity for substrate binding was found in vicinity of the enzyme active site and non-bonding interactions required for catalysis were described, as well as the effect of L78F mutation on those interactions

La enzima tirosinasa: 2. Inhibidores de origen natural y sintético

En este trabajo se abordan de manera general los compuestosinhibidores de la tirosinasa, la enzima limitante y el pilar fundamental para el control de la pigmentación en la piel de los humanos. Se presentan las principales características de los agentes despigmentantes utilizados en la práctica médica. También se muestran los compuestos estudiados hasta la actualidad, los que son agrupados teniendo en cuenta su origen: naturales, sintéticos y fármacos con otros usos terapéuticos, descubiertos con actividadinhibidora contra la enzima. Finalmente se discuten los últimos avances en el campo de la quimioinformática y la modelación molecular relacionados con el estudio de la enzima y sus inhibidores

Atividade de endo-ß-manase em sementes de café colhidas em diferentes estádios fenológicos.

Sementes de café apresentam germinação lenta e desuniforme, dificultando consideravelmente a formação das mudas. Nestas sementes a germinação é limitada pelo endosperma, e para que ocorra a emergência da radícula, o amolecimento do endosperma é desempenhado por várias enzimas, principalmente, a endo-?-mananase. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a atividade da enzima endo-?-mannase em sementes de café (Coffea arabica L.) colhidas em diferentes estádios fenológicos e submetidas à secagem. As sementes foram avaliadas nos estádios de desenvolvimento verde, verde cana, cereja, passa e seco, após três tratamentos de secagem: sem secagem, sementes avaliadas imediatamente após a colheita e antes que os frutos perdessem água; secagem convencional, em que os frutos foram colocados em camada única dentro de bandejas plásticas e deixados em ambiente de laboratório, até que atingissem a umidade desejada; secagem em ambiente controlado, realizada em estufa de circulação forçada de ar, regulada à temperatura constante de 35ºC. Realizou-se a eletroforese da enzima endo-?-mananase em gel de agarose. Concluiu-se que Há diferenças na atividade da enzima endo-?-mananase em sementes colhidas nos diferentes estádios fenológicos; a secagem não afeta a atividade da enzima endo-?-mananase em sementes colhidas nos estádios verde, verde cana e cereja; e ocorre maior atividade da enzima endo-?-mananase em sementes colhidas no estádio seco e submetidas à secagem lenta, convencional