Beyond hairballs: depicting complexity of a kinase-phosphatase network in the budding yeast

Les kinases et les phosphatases (KP) représentent la plus grande famille des enzymes dans la cellule. Elles régulent les unes les autres ainsi que 60 % du protéome, formant des réseaux complexes kinase-phosphatase (KP-Net) jouant un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire. Ces réseaux caractérisés d’une organisation de type commandes-exécutions possèdent généralement une structure hiérarchique. Malgré les nombreuse études effectuées sur le réseau KP-Net chez la levure, la structure hiérarchique ainsi que les principes fonctionnels sont toujours peux connu pour ce réseau. Dans ce contexte, le but de cette thèse consistait à effectuer une analyse d’intégration des données provenant de différentes sources avec la structure hiérarchique d’un réseau KP-Net de haute qualité chez la levure, S. cerevisiae, afin de générer des hypothèses concernant les principes fonctionnels de chaque couche de la hiérarchie du réseau KP-Net. En se basant sur une curation de données d’interactions effectuée dans la présente et dans d’autres études, le plus grand et authentique réseau KP-Net reconnu jusqu’à ce jour chez la levure a été assemblé dans cette étude. En évaluant le niveau hiérarchique du KP-Net en utilisant la métrique de la centralisation globale et en élucidant sa structure hiérarchique en utilisant l'algorithme vertex-sort (VS), nous avons trouvé que le réseau KP-Net possède une structure hiérarchique ayant la forme d’un sablier, formée de trois niveaux disjoints (supérieur, central et inférieur). En effet, le niveau supérieur du réseau, contenant un nombre élevé de KPs, était enrichi par des KPs associées à la régulation des signaux cellulaire; le niveau central, formé d’un nombre limité de KPs fortement connectées les unes aux autres, était enrichi en KPs impliquées dans la régulation du cycle cellulaire; et le niveau inférieur, composé d’un nombre important de KPs, était enrichi en KPs impliquées dans des processus cellulaires diversifiés. En superposant une grande multitude de propriétés biologiques des KPs sur le réseau KP-Net, le niveau supérieur était enrichi en phosphatases alors que le niveau inférieur en était appauvri, suggérant que les phosphatases seraient moins régulées par phosphorylation et déphosphorylation que les kinases. De plus, le niveau central était enrichi en KPs représentant des « bottlenecks », participant à plus d’une voie de signalisation, codées par des gènes essentiels et en KPs qui étaient les plus strictement régulées dans l’espace et dans le temps. Ceci implique que les KPs qui jouent un rôle essentiel dans le réseau KP-Net devraient être étroitement contrôlées. En outre, cette étude a montré que les protéines des KPs classées au niveau supérieur du réseau sont exprimées à des niveaux d’abondance plus élevés et à un niveau de bruit moins élevé que celles classées au niveau inférieur du réseau, suggérant que l’expression des enzymes à des abondances élevées invariables au niveau supérieur du réseau KP-Net pourrait être importante pour assurer un système robuste de signalisation. L’étude de l’algorithme VS a montré que le degré des nœuds affecte leur classement dans les différents niveaux d’un réseau hiérarchique sans biaiser les résultats biologiques du réseau étudié. En outre, une analyse de robustesse du réseau KP-Net a montré que les niveaus du réseau KP-Net sont modérément stable dans des réseaux bruités générés par ajout d’arrêtes au réseau KP-Net. Cependant, les niveaux de ces réseaux bruités et de ceux du réseau KP-Net se superposent significativement. De plus, les propriétés topologiques et biologiques du réseau KP-Net étaient retenues dans les réseaux bruités à différents niveaux. Ces résultats indiquant que bien qu’une robustesse partielle de nos résultats ait été observée, ces derniers représentent l’état actuel de nos connaissances des réseaux KP-Nets. Finalement, l’amélioration des techniques dédiées à l’identification des substrats des KPs aideront davantage à comprendre comment les réseaux KP-Nets fonctionnent. À titre d’exemple, je décris, dans cette thèse, une stratégie que nous avons conçu et qui permet à déterminer les interactions KP-substrats et les sous-unités régulatrices sur lesquelles ces interactions dépendent. Cette stratégie est basée sur la complémentation des fragments de protéines basée sur la cytosine désaminase chez la levure (OyCD PCA). L’OyCD PCA représente un essai in vivo à haut débit qui promet une description plus précise des réseaux KP-Nets complexes. En l’appliquant pour déterminer les substrats de la kinase cycline-dépendante de type 1 (Cdk1, appelée aussi Cdc28) chez la levure et l’implication des cyclines dans la phosphorylation de ces substrats par Cdk1, l’essai OyCD PCA a montré un comportement compensatoire collectif des cyclines pour la majorité des substrats. De plus, cet essai a montré que la tubuline- γ est phosphorylée spécifiquement par Clb3-Cdk1, établissant ainsi le moment pendant lequel cet événement contrôle l'assemblage du fuseau mitotique.Kinases and phosphatases (KP) form the largest family of enzymes in living cells. They regulate each other and 60 % of the proteome forming complex kinase-phosphatase networks (KP-Net) essential for cell signaling. Such networks having the command-execution aspect tend to have a hierarchical structure. Despite the extensive study of the KP-Net in the budding yeast, the hierarchical structure as well as the functional principles of this network are still not known. In this context, this thesis aims to perform an integrative analysis of multi-omics data with the hierarchical structure of a bona fide KP-Net in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, in order to generate hypotheses about the functional principles of each layer in the KP-Net hierarchy. Based on a literature curation effort accomplished in this and in other studies, the largest bona fide KP-Net of the S. cerevisiae known to date was assembled in this thesis. By assessing the hierarchical level of the KP-Net using the global reaching centrality and by elucidating the its hierarchical structure using the vertex-sort (VS) algorithm, we found that the KP-Net has a moderate hierarchical structure made of three disjoint layers (top, core and bottom) resembling a bow tie shape. The top layer having a large size was found enriched for signaling regulation; the core layer made of few strongly connected KPs was found enriched mostly for cell cycle regulation; and the bottom layer having a large size was found enriched for diverse biological processes. On overlaying a wide range of KP biological properties on top of the KP-Net hierarchical structure, the top layer was found enriched for and the bottom layer was found depleted for phosphatases, suggesting that phosphatases are less regulated by phosphorylation and dephosphoryation interactions (PDI) than kinases. Moreover, the core layer was found enriched for KPs representing bottlenecks, pathway-shared components, essential genes and for the most tightly regulated KPs in time and space, implying that KPs playing an essential role in the KP-Net should be firmly controlled. Interestingly, KP proteins in the top layer were found more abundant and less noisy than those of the bottom layer, suggesting that availability of enzymes at invariable protein expression level at the top of the network might be important to ensure a robust signaling. Analysis of the VS algorithm showed that node degrees affect their classification in the different layers of a network hierarchical structure without biasing biological results of the sorted network. Robustness analysis of the KP-Net showed that KP-Net layers are moderately stable in noisy networks generated by adding edges to the KP-Net. However, layers of these noisy overlap significantly with those of the KP-Net. Moreover, topological and biological properties of the KP-Net were retained in the noisy networks to different levels. These findings indicate that despite the observed partial robustness of our results, they mostly represent our current knowledge about KP-Nets. Finally, enhancement of techniques dedicated to identify KPs substrates will enhance our understanding about how KP-Nets function. As an example, I describe here a strategy that we devised to help in determining KP-substrate interactions and the regulatory subunits on which these interactions depend. The strategy is based on a protein-fragment complementation assay based on the optimized yeast cytosine deaminase (OyCD PCA). The OyCD PCA represents a large scale in vivo screen that promises a substantial improvement in delineating the complex KP-Nets. We applied the strategy to determine substrates of the cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1; also called Cdc28) and cyclins implicated in phosphorylation of these substrates by Cdk1 in S. cerevisiae. The OyCD PCA showed a wide compensatory behavior of cyclins for most of the substrates and the phosphorylation of γ-tubulin specifically by Clb3-Cdk1, thus establishing the timing of the latter event in controlling assembly of the mitotic spindle

Phosphoproteomic study on osmotic shock in Saccharomyces cerevisiae over sub-minute and half- hour timescales

La phosphorylation des protéines contribue de manière importante à la régulation cellulaire. Ainsi, les kinases et les phosphatases (KP) sont essentielles à la transduction de signal dans les cellules. Les signaux reçus par la cellule doivent être transmis efficacement pour garantir l'obtention d'une réponse adaptative appropriée. Le suivi de l'activité de phosphorylation des protéines nous aide à mieux comprendre comment les cellules fonctionnent. Dans notre étude, nous avons exposé Saccharomyces cerevisiae à une osmolarité élevée, soit 0,4 M de NaCl, ce qui a provoqué un choc hyperosmotique. La phosphorylation des protéines a été mesurée à l'aide d'une technique de spectrométrie de masse appelée `’Marquage en culture cellulaire avec des acides aminés dotés d’isotopes stables (SILAC)’. Il s'agit d'une technique quantitative de protéomique qui permet de comparer des cellules exposées au choc hyperosmotique à un groupe contrôle où les cellules n’ont pas subi ce choc. Cette comparaison entre les deux groupes nous permet de déduire une régulation dynamique des protéines spécifique au stimulus appliqué. Nous avons utilisé deux échelles de temps, la première inférieure à une minute et la seconde de 30 minutes, pour examiner les effets du choc osmotique chez S. cerevisiae. Dans ce mémoire, j'ai examiné la voie métabolique MAPK-Hog1 au cours de la demi-heure de mesure et l'ai comparée aux mesures prises lors de l’échelle inférieure à la minute, laquelle ayant été publiée précédemment par Kanshin & Bergeron- Sandoval et al., 2015 [26]. De plus, les données complètes contenaient 161 phosphopeptides dynamiques provenant de 100 protéines distinctes présentes lors des deux échelles de temps. Les phosphopeptides dynamiques découverts furent également comparés à une autre étude phosphoprotéomique ayant utilisé le stress froid / chaud comme stimulus (Kanshin et al., 2015 [25]). Il y avait des chevauchements remarquables des phosphopeptides kinétiques observés lors des chocs osmotiques et en particulier ceux observés lors du stress thermique. Cela nous a mené à examiner la possibilité d'une implication de TORC1 & 2 dans le processus i d'osmoadaptation. De plus, les cellules arrêtent temporairement leur cycle cellulaire lors de ce processus d'osmoadaptation. Conformément à cette observation, 68% des protéines impliquées dans la transition G1 / S ont subi des modifications de la phosphorylation, lesquelles reflétant peut-être leur régulation, au cours des 30 premières minutes de choc osmotique. Les kinases et les phosphatases sont connues pour fortement se réguler les unes les autres. Un réseau de KP actives interconnectées a révélé que Hog1 était la kinase la plus connectée dans les mesures à l’échelle de temps inférieure à la minute alors que Cdc28 était la plus connectée lors de l’échelle de temps d’une demi-heure. Cela est indicatif du mécanisme par lequel les cellules s'adaptent à une osmolarité élevée. Par exemple, Hog1 est responsable de la détection rapide et de l’adaptation, et Cdc28, de l’arrêt et de la régulation du cycle cellulaire. En résumé, j'ai soutenu qu'il était possible d'identifier des phosphopeptides dynamiques spécifiques à un stimulus dans l’échelle de temps d'une demi-heure. J'ai comparé les phosphopeptides dynamiques de l'échelle de temps inférieure à la minute à l'échelle de 30 minutes et j'ai examiné les processus biologiques qui jouent un rôle dans le processus d'osmoadaptif.Protein phosphorylation is an important cellular regulatory mechanism. Kinases and phosphatases (KP) are vital for the signalling transductions in cells. Signals received by the cell must be transmitted effectively to ensure an appropriate adaptive response is achieved. Monitoring the phosphorylation activity on proteins helps us gain a better understanding to how cells work. In our study we have exposed Saccharomyces cerevisiae to high osmolarity using 0.4M NaCl, and caused a hyper osmotic shock. Protein phosphorylation was measured using a mass spectrometry technique called Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture (SILAC). This is a quantitative proteomic technique that allows the comparison between cells that are exposed to NaCl and a control group, where cells are not exposed to NaCl. This comparison between the two groups allows us to deduce dynamic regulation of proteins specific to the stimulus applied. We have used a sub-minute and a half-hour timescales to examine the effects of osmotic shock in S. cerevisiae. In this memoir, I have examined the MAPK-Hog1 pathway during the half-hour timescale and have compared it to the sub-minute timescale, which was previously published in Kanshin & Bergeron-Sandoval et al., 2015 [26]. Moreover, the entire data had 161 dynamic phosphopeptide from 100 unique proteins that were present on both timescales. Dynamic phosphopeptides were also compared to another phosphoproteomic study that had used cold/hot stress as a stimulus (Kanshin et al., 2015 [25]). There were remarkable overlaps between osmotic shock and in particular heat stress. This led us to examine the possibility that TORC1&2 involvement in the osmoadaptation process. Furthermore, cells temporarily stop cell cycling during the osmoadaptation process. Consistent with this observation, 68% of the proteins involved in the G1/S transition underwent changes in phosphorylation, perhaps reflecting their regulation, during the first 30 minutes of osmotic shock. Kinases and phosphatases are known to heavily regulate themselves. A network of interconnected active KPs revealed Hog1 to be the most connected kinase in the sub- . This is indicative of how cells adapt to high osmolarity; Hog1 being responsible for the fast sensing and adaptation, and Cdc28 for stopping and regulating the cell cycle. In summary, I have argued that it is possible to extract dynamic phosphopeptides that are stimulus-specific within the half-hour timescale. I have compared dynamic phosphopeptides from the sub-minute timescale to the half-hour timescale and have examined biological processes that play a part in the osmoadaptive process

Regulation of protein transport into the ER by phosphorylation of Sbh1/Sec61β

The ER protein translocation channel subunit Sbh1 is non-essential, but contains multiple phosphorylation sites suggesting a regulatory role in ER protein import. It has been already shown that mutating two N-terminal, proline-flanked, phosphorylation sites in the Sbh1 cytosolic domain phenocopies the temperature-sensitivity of a yeast strain lacking SBH1/SBH2, and results in reduced translocation into the ER of an Sbh1-dependent substrate, Gls1. In the present work I characterized the sbh1 mutant strains. I also identified targeting signals that are Sbh1-dependent, Phospho-Sbh1 dependent, or Ess1-dependent. In a high content microscopic screen, I identified about 12% of secretory proteins assayed as Sbh1-dependent and I found that Sbh1-dependent proteins have suboptimal ER targeting sequences, with lower hydrophobicity and frequently without or with an inverse charge bias. A smaller fraction of proteins was dependent on N-terminal phosphorylation of Sbh1. I also developed and optimized different screens for finding the kinase responsible for S3/T5-Sbh1 phosphorylation, with no conclusive result. I conclude that Sbh1 promotes ER import of substrates with suboptimal targeting sequences and its activity can be regulated by a conformational change induced by N-terminal phosphorylation and I suggested a model for ER protein translocation regulation.Die ER-Protein-Translokationskanal-Untereinheit Sbh1 ist nicht essentiell, enthält aber mehrere Phosphorylierungsstellen, was auf eine regulatorische Rolle beim ER-Proteinimport hindeutet. Es wurde bereits gezeigt, dass die Mutation von zwei N-terminalen, Prolin-flankierten Phosphorylierungsstellen in der zytosolischen Sbh1-Domäne die Temperaturempfindlichkeit eines Hefestamms, dem SBH1/SBH2 fehlt, phänokopiert und zu einer verringerten Translokation in das ER eines Sbh1-Abhängigen führt Substrat, Gls1. In der vorliegenden Arbeit habe ich die sbh1-Mutantenstämme charakterisiert. Ich habe auch Targeting-Signale identifiziert, die Sbh1-abhängig, Phospho-Sbh1-abhängig oder Ess1-abhängig sind. In einem mikroskopischen High-Content-Screen identifizierte ich etwa 12 % der sekretorischen Proteine, die als Sbh1-abhängig getestet wurden, und ich fand heraus, dass Sbh1-abhängige Proteine suboptimale ER-Targeting-Sequenzen mit geringerer Hydrophobizität und häufig ohne oder mit einer inversen Ladungsverzerrung aufweisen. Ein kleinerer Teil der Proteine war von der N-terminalen Phosphorylierung von Sbh1 abhängig. Ich habe auch verschiedene Screens entwickelt und optimiert, um die für die S3/T5-Sbh1-Phosphorylierung verantwortliche Kinase zu finden, ohne schlüssiges Ergebnis. Ich schlussfolgere, dass Sbh1 den ER-Import von Substraten mit suboptimalen Targeting-Sequenzen fördert und seine Aktivität durch eine durch N-terminale Phosphorylierung induzierte Konformationsänderung reguliert werden kann, und ich schlug ein Modell für die Regulation der ER-Proteintranslokation vor

Antioxidant and DPPH-Scavenging Activities of Compounds and Ethanolic Extract of the Leaf and Twigs of Caesalpinia bonduc L. Roxb.

Antioxidant effects of ethanolic extract of Caesalpinia bonduc and its isolated bioactive compounds were evaluated in vitro. The compounds included two new cassanediterpenes, 1α,7α-diacetoxy-5α,6β-dihydroxyl-cass-14(15)-epoxy-16,12-olide (1)and 12α-ethoxyl-1α,14β-diacetoxy-2α,5α-dihydroxyl cass-13(15)-en-16,12-olide(2); and others, bonducellin (3), 7,4’-dihydroxy-3,11-dehydrohomoisoflavanone (4), daucosterol (5), luteolin (6), quercetin-3-methyl ether (7) and kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1Ç2)-β-D-xylopyranoside (8). The antioxidant properties of the extract and compounds were assessed by the measurement of the total phenolic content, ascorbic acid content, total antioxidant capacity and 1-1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) and hydrogen peroxide radicals scavenging activities.Compounds 3, 6, 7 and ethanolic extract had DPPH scavenging activities with IC50 values of 186, 75, 17 and 102 μg/ml respectively when compared to vitamin C with 15 μg/ml. On the other hand, no significant results were obtained for hydrogen peroxide radical. In addition, compound 7 has the highest phenolic content of 0.81±0.01 mg/ml of gallic acid equivalent while compound 8 showed the highest total antioxidant capacity with 254.31±3.54 and 199.82±2.78 μg/ml gallic and ascorbic acid equivalent respectively. Compound 4 and ethanolic extract showed a high ascorbic acid content of 2.26±0.01 and 6.78±0.03 mg/ml respectively.The results obtained showed the antioxidant activity of the ethanolic extract of C. bonduc and deduced that this activity was mediated by its isolated bioactive compounds

The HBP1 tumor suppressor is a negative epigenetic regulator of MYCN driven neuroblastoma through interaction with the PRC2 complex

C

Annual Report of the University, 1992-1993, Volumes 1-4

SIGNIFICANT DEVELOPMENTS Preparation, approval by President Peck, delivery to NMCHE of UNM\u27s response to House Memorials 38 and 25 (on minorities and women). Development and packaging of a presentation on minorities at UNM to Hispanic community people and organizations. Renewal of faculty instructional workload report and other information for use by President Peck and others in the President\u27s Council in testimony to the legislature on accountability by faculty. Significant workload and contributions to WICHE\u27s Diversity Project: - responses to long questionnaire - projected demographics - substitution for O. Forbes on planning for diversity Reprogramming of obsolete computer program of the University of Southern California\u27s Faculty Planning Model. Work remains incomplete. Support and staff work for University Planning Council, Faculty Senate Long Range Planning Committee, Senate President, Senate Budget Committee, Student Learning Outcomes Assessment Committee, Admissions and Registration Committee, Staff Council; Graduate Petition and grade Review Subcommittee Service to NMCHE\u27s Outcomes Assessment Advisory Group; NMCHE\u27s review group on diversity plans Service on Albuquerque Business/Education Compact Conducted several special data analyses to provide user outcome information for the Center for Academic Program Support (CAPS). Wrote reports to summarize analyses. Served in an advisory capacity to VP Zuniga Forbes for the two surveys (Campus Climate for Diversity, ACT Student Opinion Survey) and helped to draw the sample for the ACT survey. Conducted secondary analyses and prepared report of all analyses of the Freshman Survey (CIRP) for VP Zuniga Forbes. Gave presentation of CIRP findings to the Regents Subcommittee on Student Affairs. Conducted secondary analyses and prepared report of all analyses of the Campus Climate for Diversity Survey for VP Zuniga Forbes

Colorectal Cancer

The projections for future growth in the number of new patients with colorectal cancer in most parts of the world remain unfavorable. When we consider the substantial morbidity and mortality that accompanies the disease, the acute need for improvements and better solutions in patient care becomes evident. This volume, organized in five sections, represents a synopsis of the significant efforts from scientists, clinicians and investigators towards finding improvements in different patient care aspects including nutrition, diagnostic approaches, treatment strategies with the addition of some novel therapeutic approaches, and prevention. For scientists involved in investigations that explore fundamental cellular events in colorectal cancer, this volume provides a framework for translational integration of cell biological and clinical information. Clinicians as well as other healthcare professionals involved in patient management for colorectal cancer will find this volume useful