The distribution of inverted repeat sequences in the Saccharomyces cerevisiae genome

Although a variety of possible functions have been proposed for inverted repeat sequences (IRs), it is not known which of them might occur in vivo. We investigate this question by assessing the distributions and properties of IRs in the Saccharomyces cerevisiae (SC) genome. Using the IRFinder algorithm we detect 100,514 IRs having copy length greater than 6 bp and spacer length less than 77 bp. To assess statistical significance we also determine the IR distributions in two types of randomization of the S. cerevisiae genome. We find that the S. cerevisiae genome is significantly enriched in IRs relative to random. The S. cerevisiae IRs are significantly longer and contain fewer imperfections than those from the randomized genomes, suggesting that processes to lengthen and/or correct errors in IRs may be operative in vivo. The S. cerevisiae IRs are highly clustered in intergenic regions, while their occurrence in coding sequences is consistent with random. Clustering is stronger in the 3′ flanks of genes than in their 5′ flanks. However, the S. cerevisiae genome is not enriched in those IRs that would extrude cruciforms, suggesting that this is not a common event. Various explanations for these results are considered

Chloroplast genome sequencing analysis of Heterosigma akashiwo CCMP452 (West Atlantic) and NIES293 (West Pacific) strains

Background: Heterokont algae form a monophyletic group within the stramenopile branch of the tree of life. These organisms display wide morphological diversity, ranging from minute unicells to massive, bladed forms. Surprisingly, chloroplast genome sequences are available only for diatoms, representing two (Coscinodiscophyceae and Bacillariophyceae) of approximately 18 classes of algae that comprise this taxonomic cluster. A universal challenge to chloroplast genome sequencing studies is the retrieval of highly purified DNA in quantities sufficient for analytical processing. To circumvent this problem, we have developed a simplified method for sequencing chloroplast genomes, using fosmids selected from a total cellular DNA library. The technique has been used to sequence chloroplast DNA of two Heterosigma akashiwo strains. This raphidophyte has served as a model system for studies of stramenopile chloroplast biogenesis and evolution. Results: H. akashiwo strain CCMP452 (West Atlantic) chloroplast DNA is 160,149 bp in size with a 21,822-bp inverted repeat, whereas NIES293 (West Pacific) chloroplast DNA is 159,370 bp in size and has an inverted repeat of 21,665 bp. The fosmid cloning technique reveals that both strains contain an isomeric chloroplast DNA population resulting from an inversion of their single copy domains. Both strains contain multiple small inverted and tandem repeats, non-randomly distributed within the genomes. Although both CCMP452 and NIES293 chloroplast DNAs contains 197 genes, multiple nucleotide polymorphisms are present in both coding and intergenic regions. Several protein-coding genes contain large, in-frame inserts relative to orthologous genes in other plastids. These inserts are maintained in mRNA products. Two genes of interest in H. akashiwo, not previously reported in any chloroplast genome, include tyrC, a tyrosine recombinase, which we hypothesize may be a result of a lateral gene transfer event, and an unidentified 456 amino acid protein, which we hypothesize serves as a G-protein-coupled receptor. The H. akashiwo chloroplast genomes share little synteny with other algal chloroplast genomes sequenced to date. Conclusion: The fosmid cloning technique eliminates chloroplast isolation, does not require chloroplast DNA purification, and reduces sequencing processing time. Application of this method has provided new insights into chloroplast genome architecture, gene content and evolution within the stramenopile cluster

Function of inverted repeat sequences with cruciform-forming potential in gene expression

早大学位記番号:新8172早稲田大

Interaction of proteins with inverted repeats and cruciform structures in nucleic acids

Cruciforms occur when inverted repeat sequences in double-stranded DNA adopt intra-strand hairpins on opposing strands. Biophysical and molecular studies of these structures confirm their characterization as four-way junctions and have demonstrated that several factors influence their stability, including overall chromatin structure and DNA supercoiling. Here, we review our understanding of processes that influence the formation and stability of cruciforms in genomes, covering the range of sequences shown to have biological significance. It is challenging to accurately sequence repetitive DNA sequences, but recent advances in sequencing methods have deepened understanding about the amounts of inverted repeats in genomes from all forms of life. We highlight that, in the majority of genomes, inverted repeats are present in higher numbers than is expected from a random occurrence. It is, therefore, becoming clear that inverted repeats play important roles in regulating many aspects of DNA metabolism, including replication, gene expression, and recombination. Cruciforms are targets for many architectural and regulatory proteins, including topoisomerases, p53, Rif1, and others. Notably, some of these proteins can induce the formation of cruciform structures when they bind to DNA. Inverted repeat sequences also influence the evolution of genomes, and growing evidence highlights their significance in several human diseases, suggesting that the inverted repeat sequences and/or DNA cruciforms could be useful therapeutic targets in some cases

Genetic basis of adaptive radiation in East African cichlids

East African cichlids are a paramount example of adaptive morphological radiation. The most dramatic difference among species occurs in oral jaw design and correlates with ecological niche partitioning. Convergent evolution of trophic forms between lakes suggests a common mechanism. What combination of intrinsic and extrinsic factors constitute this mechanism still remains to be seen. The goal of this dissertation was to examine the genetic basis of shape differences between two closely related cichlid species that employ alternate modes of feeding. This was achieved through a number of independent experiments. First, I used field data to characterize the way in which foraging habitat was partitioned between sympatric rock-dwelling species from Lake Malawi. Second, morphological differences between two species that employ alternate modes of feeding, Labeotropheus fuelleborni and Metriaclima zebra, were quantified via geometric morphometrics. I found that specific aspects of shape predicted differences in feeding performance. In this experiment I also developed the phenotypic characters that were used in subsequent experiments. Next, the genetic bases of these morphological characters were biometrically estimated using the Castle-Wright estimator. I estimated between 1 and 11 factors to control shape differences in various traits. Specific traits were also shown to segregate together in hybrid progeny, suggesting a degree of pleiotropy among genes that underlie differences in the cichlid feeding apparatus. Finally, I constructed a genetic linkage map for Lake Malawi\u27s rock-dwelling cichlids, and identified quantitative trait loci (QTL) that affected shape differences in the cichlid head. Segregation at 136 molecular markers was studied in 173 F2 hybrids. The final linkage map consisted of 126 markers distributed over 24 linkage groups and 838 cM. QTL were detected for sex, color, and 15 morphological traits that distinguish the shape of the feeding apparatus in L. fuelleborni and M. zebra. At every stage of this dissertation results are related to the developmental and functional biology of the cichlid head

Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A- und CpG-C-Oligodesoxynukleotiden als Grundlage für die Entwicklung immunstimulatorischer Nanopartikel

Hintergrund und Ziele der Arbeit: Bakterien und DNA Viren werden anhand unmethylierter CpG-Motive innerhalb ihrer DNA von den TLR 9 tragenden PDCs und den B Zellen des humanen Immunsystems als Gefahrensignale erkannt. Mittels synthetischer, CpG-enthaltender ODN nutzt man diese Grundsatzmechanismen, um vergleichbare Immunantworten auszulösen. Auf Grundlage eines unterschiedlichen immunologischen Aktivierungsprofils wurden bislang drei CpG-Klassen definiert: CpG-A, CpG-B und CpG-C. Mit Hilfe von CpG-A war es erstmals möglich, IFN-α in PDCs (den endogenen Hauptproduzenten dieses Zytokins) in Mengen zu induzieren, wie es bislang nur mit Viren selbst möglich war. Auch CpG-C stimuliert PDCs zur Sekretion von IFN α und aktiviert darüber hinaus B Zellen - eine Eigenschaft, die CpG-A nicht besitzt. Die sequenzspezifischen und strukturellen Voraussetzungen für diese differenziellen Wirkprofile waren bislang unzureichend verstanden, auch weil die Struktur-Analysen nur begrenzt auf die tatsächlichen Vorgänge im physiologischen Milieu übertragbar waren. Um CpG-ODN für die therapeutische Anwendung zu optimieren, sind die genauen Kenntnisse der Struktur-Wirkungsbeziehungen jedoch unverzichtbar. Ein zweiter Ansatzpunkt zur Optimierung der Anwendung liegt in der Verbesserung der systemischen Stabilität von CpG-ODN. Die Bindung von CpG-ODN an partikuläre Trägersysteme (z.B. Gelatine-Nanopartikel) wurde bereits in unserer Abteiliung als mögliches drug-delivery-System etabliert. Eine Weiterentwicklung dieses Prinzips wären partikuläre Strukturen, die aus immunstimulatorischen Nukleinsäuren aufgebaut keiner weiteren Trägermaterialien bedürfen. Beide Ansatzpunkte führen zu den Zielen dieser Arbeit: 1) Die Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen der CpG-Klassen A und C durch Etablierung geeigneter Methoden zur Untersuchung im physiologischen Milieu. 2) Die Entwicklung immunstimulatorischer partikulärer Strukturen auf Basis der in Teil 1) identifizierten wirksamen Strukturelemente beider CpG-Klassen. Ergebnisse: 1) Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN 2216 (CpG-A) und ODN M362 (CpG-C): CpG-A bildet im physiologischen Milieu spontan multimolekulare Strukturen, deren mittlere Durchmesser mit 24 40 nm im Größenbereich von Viren liegen. Es zeigte sich, dass für diese Multimerisierungen das Zusammenspiel aus flankierenden Poly-G-Motiven, palindromischem Zentrum und eingelagerten Natrium- oder Kaliumionen entscheidend ist. Physiologisches Milieu wirkt sich sowohl den Umgebungs-pH und die Na+/K+-Konzentrationen als auch die Temperatur (37 °C) betreffend optimal förderlich auf die Strukturbildung aus. Die Identifizierung dieser maßgeblichen Faktoren machte es möglich, den Strukturaufbau von CpG-A experimentell zu kontrollieren und die immunologischen Wirkungen der verschiedenen Strukturen direkt zu vergleichen. Für die rasche und hohe Induktion von IFN-α und anderen inflammatorischen Zytokinen durch PDCs sind große Partikel verantwortlich. Die Multimerisierungen von ODN 2216 werden bei pH 60 °C oder durch Entzug der stabilisierenden Natriumionen (indem man sie zuvor in Aqua ad inj. löst), so verliert ODN 2216 seine immunstimulatorische Aktivität in Bezug auf PDCs. Die schwache Wirkung der CpG-A-Monomere kann jedoch durch Präinkubation von PDCs mit IFN β deutlich gesteigert werden. Im Gegensatz zu den ebenfalls einzelsträngig vorliegenden ODN 2006 (CpG-B) haben auch Monomere von ODN 2216 keine aktivierende Wirkung auf B Zellen. CpG-C hat durch die palindromische Sequenz die Möglichkeit, Hairpins und Duplices zu bilden. ODN M362 zeigt jedoch keine Hairpinstrukturen. Die Duplexformationen sind bei 37 °C in vitro nicht stabil und spielen keine Rolle bei der durch diese ODN initiierten B-Zell-Aktivierung. Duplices haben jedoch Anteil an der Induktion von IFN-α in PDCs. Die in dieser Arbeit etablierten Protokolle der Temperatur-Präinkubation ermöglichen erstmalig eine experimentelle Kontrolle der Strukturbildungen von CpG-A und CpG-C und dadurch den Vergleich von Struktur und Wirkung. Das Standardprotokoll für Gelelektrophorese wurde dahingehend modifiziert, dass ein physiologisches Milieu sowohl durch die anwesenden Ionen als auch durch die Umgebungstemperatur (37°C) simuliert werden konnte. 2)Design Nukleinsäure-basierter Nanopartikel: Zentrale Elemente von CpG-A und CpG-C (palindromische Sequenz, gerüstartige Verbindung mehrerer Nukleinsäuren) wurden eingesetzt, indem ODN M362-Sequenzen (CpG-C) an bi- und trivalenten Grundgerüsten (Linkern) für den Strukturaufbau optimiert wurden. Trivalente Linker ermöglichen die variierende Zusammenlagerung der palindromischen Nukleinsäuren in drei Richtungen des Raumes und dadurch die Bildung großer Partikel. Diese sind den bisher bekannten Maximalstimuli CpG-B und CpG-C hinsichtlich der Aktivierung von B-Zellen gleichwertig. Erstmalig konnten auf diese Weise B-Zellen durch partikuläre Strukturen stark aktiviert werden. Nach Vor-Komplexierung der Partikel mit Poly-L-Arginin wird die Aktivität bei B-Zellen nochmals verstärkt. Kurze, nicht-palindromische CpG-DNA-Sequenzen an trivalenten Grundgerüsten induzieren nach Vor-Komplexierung mit Poly-L-Arginin deutlich mehr IFN-α in PBMCs als CpG-A, obwohl sie selbst nicht multimerisieren. Wird die (palindromische) RNA-Sequenz von CpG-C an einem trivalenten Linker verwendet, so können ebenfalls große Strukturen generiert werden, die nach Transfektion vergleichbare Mengen IFN-α in PBMCs induzieren wie CpG-A. Ausblick: Die vorliegende Dissertation verbindet Fragestellungen der Immunologie und der pharmazeutischen Technologie mit den Möglichkeiten der Biochemie. Es werden nicht nur verschiedene Methoden zur strukturellen Untersuchung von CpG-ODN im physiologischen Milieu etabliert, sondern auch die experimentelle Kontrolle der Strukturbildung von CpG-A ermöglicht. Die entwickelte Technik der Generierung dreidimensionaler, über palindromische Nukleinsäuren aufgebauter Partikel ist nicht auf CpG-Motive in DNA begrenzt, sondern kann auf eine andere für Viren charakteristische Nukleinsäure (Einzelstrang-RNA) übertragen werden. Dadurch würde zusätzlich möglich, die immunologischen Profile von ssRNA, dsRNA und CpG in einem Partikel zu kombinieren und die Art der Immunantwort je nach Zusammensetzung der Partikel gezielt zu bestimmen. Die klinische Relevanz dieser Arbeit ergibt sich aus den neuen Erkenntnissen über die Multimerisierungen von CpG-A, welche dessen therapeutischen Einsatz optimieren und besser standardisierbar machen sollen. Außerdem werden neue Hinweise auf die unterschiedlichen Aufnahme- und Erkennungsmechanismen beider CpG-Klassen und deren Aktivierung der Synthese von IFN-α gewonnen. Darüber hinaus wurde durch die Entwicklung der Polyvalenten Linker eine grundsätzlich neue Technik im Stil eines Baukastensystems etabliert, welche als Grundstein einer neuen Generation von immunstimulatorischen Multimeren dienen soll. Die Koadministration von Adjuvans und Antigen in direkter räumlicher Nähe bietet neue Gestaltungsmöglichkeiten in der Vakzineentwicklung. Zudem ist zu erwarten, dass unter Einbeziehung der RNA basierten immunologischen Wirkprofile innerhalb eines Partikels der Einsatz von CpG-ODN zur Therapie von Virusinfektionen und Tumoren weiter verbessert werden kann

Structural determinants of mutability across cancer genomes

Cancer is a group of diseases which are characterised and actuated by somatic mutations. In cancer the distribution of mutations across the genome is inhomogeneous, with genomic and epigenomic features influencing mutational patterns. Previous studies have indicated that chromatin organization and replication time domains are correlated with and thus predictive of this variation. Here the role of alternative DNA structures was investigated across a multitude of whole-genome sequenced cancers. Sequences that are predisposed to fold in alternative DNA structures can be identified by the primary DNA sequence of the human genome and are collectively known as non-B DNA motifs. More specifically, these include Z-DNA, G-quadruplexes, inverted repeats that can fold in cruciforms and hairpins, direct and short tandem repeats that can mediate the formation of slipped structures and a subset of mirror repeats that fold in intramolecular triple stranded DNA also known as H-DNA. A systematic investigation of the association between each of those non-B DNA motifs and mutability was performed across thousands of whole genome sequenced tumours from different tissues. Non-B DNA motifs were more mutable than the surrounding regions and were found to be determinants of mutability across cancer types. Additionally, they could be used to predict variation in mutational density genome-wide. Exposed structural components and physical properties of non-B DNA motifs influenced the likelihood of mutagenesis, indicating that secondary structures are possibly causally implicated in mutagenesis. Furthermore, non-B DNA motifs increased the likelihood of recurrent mutations in the genome, which has direct implications for the identification of driver mutations in non-coding regions. A detailed characterisation of indel mutagenesis was performed across the different cancer types. The analysis indicated the roles of different non-B DNA motif categories as well as sequence homologies in indel mutagenesis. In particular, sequence characteristics of a subset of non-B DNA motifs significantly influenced their relative mutational enrichment at specific indel categories. Finally, a method was developed to quantify replication and transcription strand asymmetries at indels systematically for the first time. As a result, mutational processes that are causally implicated in strand asymmetries at indels were identified and analysed. These included mismatch repair and transcription-coupled nucleotide excision repair both of which contributed to the observed transcriptional strand asymmetries for indels.Wellcome Trus

Étude de la relation structure-fonction d'un riborégulateur lysine

Une imposante portion du génome d'un organisme ne sera jamais exprimée sous forme de protéines. Cet acide désoxyribonucléique (ADN) non codant se trouve cependant à être, én bonne partie, transcrit en acide ribonucléique _(ARN). Depuis plusieurs années, les études menées sur ces ARN non codants (ARNnc) démontrent qu'ils seraient impliqués dans différents modes de régulation génétique. Les riborégulateurs sont un exemple de telles voies de régulation nouvellement élucidées. La nouveauté du mécanisme réside dans le fait qu'en principe, ces ARNnc modulent l'expression génétique sans avoir recours aux protéines. C'est la liaison directe d'un métabolite à l'ARN messager (ARNm) qui, par l'induction de changements allostériques, influence l'expression du gène situé en aval du riborégulateur. La bactérie Bacillus subtilis possède une grande variété de riborégulateurs qui régulent l'expression de plus de 2% de ses gènes. Le présent travail porte sur le riborégulateur lysine lysC de. B. subtilis et a comme objectif de comprendre l'influence de la structure du riborégulateur sur sa fonction de régulation de la transcription. Dans un premier temps, mes travaux ont démontré la présence et l'importance fonctionnelle d'une interaction boucle-boucle entre les tiges P1 et P2, et d'un motif de type kink turn (K-turn ) dans la tige P2. L'effet de ces motifs structuraux a été évalué par des essais de transcription, où le riborégulateur est inactivé lorsque des mutations sont introduites dans ces motifs. Des essais de fluorescence montrent aussi les répercussions de la formation de cette interaction sur la conformation du site de liaison. Finalement, nos résultats démontrent que l'interaction boucle-boucle dépend de la présence du motif K-turn , d'où l'importance de ce dernier. Dans une seconde publication, nous avons démontré qu'il y avait un effet synergique entre le repliement de l'interaction boucle-boucle et celui d'une deuxième interaction tertiaire de type hélice-boucle, entre la tige P2 et la boucle de la tige P4. L'influence de cette dernière sur l'organisation du site de liaison et sur la terminaison prématurée de la transcription a aussi été établie, entre autres avec l'utilisation d'un vecteur FRET impliquant les tiges P1 et P5 qui s'est avéré très informatif sur le repliement du coeur. Cet article fait également la démonstration de la contribution des autres éléments du riborégulateur qui ne sont pas impliqués dans des interactions tertiaires, notamment la tige P5 de l'aptamère et une tige nommée P6 située dans la plate-forme d'expression, dont les longueurs' sont variables d'une séquence à l'autre. Les résultats obtenus au cours de mon doctorat nous ont aidé à mieux comprendre comment les changements de structure du riborégulateur lysine affectent sa capacité à réguler l'expression d'un gène. De telles connaissances pourraient s'avérer précieuses pour une éventuelle utilisation des riborégulateurs comme outils biologiques ou comme cibles pour de nouveaux antibiotiques. J'ai d'ailleurs participé A l'écriture d'une revue qui traite des mécanismes de régulation des riborégulateurs et leur. potentiel comme outils biologiques. Cette revue a été publiée dans le journal ChemBioChem et est jointe en annexe