10,457 research outputs found
Victims' Access to Justice in Trinidad and Tobago: An exploratory study of experiences and challenges of accessing criminal justice in a post-colonial society
This thesis investigates victims' access to justice in Trinidad and Tobago, using their own narratives. It seeks to capture how their experiences affected their identities as victims and citizens, alongside their perceptions of legitimacy regarding the criminal justice system. While there have been some reforms in the administration of criminal justice in Trinidad and Tobago, such reforms have not focused on victims' accessibility to the justice system. Using grounded theory methodology, qualitative data was collected through 31 in-depth interviews with victims and victim advocates. The analysis found that victims experienced interpersonal, structural, and systemic barriers at varying levels throughout the criminal justice system, which manifested as institutionalized secondary victimization, silencing and inequality. This thesis argues that such experiences not only served to appropriate conflict but demonstrates that access is often given in a very narrow sense. Furthermore, it shows a failure to encompass access to justice as appropriated conflicts are left to stagnate in the system as there is often very little resolution. Adopting a postcolonial lens to analyse victims' experiences, the analysis identified othering practices that served to institutionalize the vulnerability and powerlessness associated with victim identities. Here, it is argued that these othering practices also affected the rights consciousness of victims, delegitimating their identities as citizens. Moreover, as a result of their experiences, victims had mixed perceptions of the justice system. It is argued that while the system is a legitimate authority victims' endorsement of the system is questionable, therefore victims' experiences suggest that there is a reinforcement of the system's legal hegemony. The findings suggest that within the legal system of Trinidad and Tobago, legacies of colonialism shape the postcolonial present as the psychology and inequalities of the past are present in the interactions and processes of justice. These findings are relevant for policymakers in Trinidad and Tobago and other regions. From this study it is recognized that, to improve access to justice for victims, there needs to be a move towards victim empowerment that promotes resilience and enhances social capital. Going forward it is noted that there is a need for further research
The place where curses are manufactured : four poets of the Vietnam War
The Vietnam War was unique among American wars. To pinpoint its uniqueness, it was necessary to look for a non-American voice that would enable me to articulate its distinctiveness and explore the American character as observed by an Asian. Takeshi Kaiko proved to be most helpful. From his novel, Into a Black Sun, I was able to establish a working pair of 'bookends' from which to approach the poetry of Walter McDonald, Bruce Weigl, Basil T. Paquet and Steve Mason. Chapter One is devoted to those seemingly mismatched 'bookends,' Walt Whitman and General William C. Westmoreland, and their respective anthropocentric and technocentric visions of progress and the peculiarly American concept of the "open road" as they manifest themselves in Vietnam. In Chapter, Two, I analyze the war poems of Walter McDonald. As a pilot, writing primarily about flying, his poetry manifests General Westmoreland's technocentric vision of the 'road' as determined by and manifest through technology. Chapter Three focuses on the poems of Bruce Weigl. The poems analyzed portray the literal and metaphorical descent from the technocentric, 'numbed' distance of aerial warfare to the world of ground warfare, and the initiation of a 'fucking new guy,' who discovers the contours of the self's interior through a set of experiences that lead from from aerial insertion into the jungle to the degradation of burning human
feces. Chapter Four, devoted to the thirteen poems of Basil T. Paquet, focuses on the continuation of the descent begun in Chapter Two. In his capacity as a medic, Paquet's entire body of poems details his quotidian tasks which entail tending the maimed, the mortally wounded and the dead. The final chapter deals with Steve Mason's JohnnY's Song, and his depiction of the plight of Vietnam veterans back in "The World" who are still trapped inside the interior landscape of their individual "ghettoes" of the soul created by their war-time experiences
Application of lactic acid bacteria for the biopreservation of meat products: A systematic review
.The increasing concern of consumers about food quality and safety and their rejection of chemical additives has promoted the breakthrough of the biopreservation field and the development of studies on the use of beneficial bacteria and their metabolites as potential natural antimicrobials for shelf life extension and enhanced food safety. Control of foodborne pathogens in meat and meat products represents a serious challenge for the food industry which can be addressed through the intelligent use of bio-compounds or biopreservatives. This article aims to systematically review the available knowledge about biological strategies based on the use of lactic acid bacteria to control the proliferation of undesirable microorganisms in different meat products. The outcome of the literature search evidenced the potential of several strains of lactic acid bacteria and their purified or semi-purified antimicrobial metabolites as biopreservatives in meat products for achieving longer shelf life or inhibiting spoilage and pathogenic bacteria, especially when combined with other technologies to achieve a synergistic effect.S
How to Be a God
When it comes to questions concerning the nature of Reality, Philosophers and Theologians have the answers.
Philosophers have the answers that can’t be proven right. Theologians have the answers that can’t be proven wrong.
Today’s designers of Massively-Multiplayer Online Role-Playing Games create realities for a living. They can’t spend centuries mulling over the issues: they have to face them head-on. Their practical experiences can indicate which theoretical proposals actually work in practice.
That’s today’s designers. Tomorrow’s will have a whole new set of questions to answer.
The designers of virtual worlds are the literal gods of those realities. Suppose Artificial Intelligence comes through and allows us to create non-player characters as smart as us. What are our responsibilities as gods? How should we, as gods, conduct ourselves?
How should we be gods
Recommended from our members
Reliable Decision-Making with Imprecise Models
The rapid growth in the deployment of autonomous systems across various sectors has generated considerable interest in how these systems can operate reliably in large, stochastic, and unstructured environments. Despite recent advances in artificial intelligence and machine learning, it is challenging to assure that autonomous systems will operate reliably in the open world. One of the causes of unreliable behavior is the impreciseness of the model used for decision-making. Due to the practical challenges in data collection and precise model specification, autonomous systems often operate based on models that do not represent all the details in the environment. Even if the system has access to a comprehensive decision-making model that accounts for all the details in the environment and all possible scenarios the agent may encounter, it may be intractable to solve this complex model optimally. Consequently, this complex, high fidelity model may be simplified to accelerate planning, introducing imprecision. Reasoning with such imprecise models affects the reliability of autonomous systems. A system\u27s actions may sometimes produce unexpected, undesirable consequences, which are often identified after deployment. How can we design autonomous systems that can operate reliably in the presence of uncertainty and model imprecision?
This dissertation presents solutions to address three classes of model imprecision in a Markov decision process, along with an analysis of the conditions under which bounded-performance can be guaranteed. First, an adaptive outcome selection approach is introduced to devise risk-aware reduced models of the environment that efficiently balance the trade-off between model simplicity and fidelity, to accelerate planning in resource-constrained settings. Second, a framework that extends stochastic shortest path framework to problems with imperfect information about the goal state during planning is introduced, along with two solution approaches to solve this problem. Finally, two complementary solution approaches are presented to minimize the negative side effects of agent actions. The techniques presented in this dissertation enable an autonomous system to detect and mitigate undesirable behavior, without redesigning the model entirely
Recommended from our members
Privacy-aware Smart Home Interface Framework
Smart home user interfaces are pervasive and shared by multiple users who occupy the space. Therefore, they pose a risk to interpersonal privacy of occupants because an individual’s sensitive information can be leaked to other co-occupants (information privacy), or they can be disturbed by intrusions into their personal space (physical privacy) when the co-occupant interacts with the smart home user interfaces. This thesis hypothesises that interpersonal privacy violations can be mitigated by adapting the user interface layer and presents insights into how to achieve usable user interface adaptation to mitigate or minimise interpersonal privacy violations in smart homes.
The thesis reports two case studies and two user studies. The first case study identifies the key characteristics needed to model the rich context of interpersonal privacy violations scenarios. Then it presents knowledge representation models that are required to represent the identified characteristics and evaluates them for adequacy in modelling the context information of interpersonal privacy violation scenarios. The second case study presents a software architecture and a set of algorithms that can detect interpersonal privacy violations and generate usable user interface adaptations. Then it evaluates the architecture and the algorithms for adequacy in generating usable privacy-aware user interface adaptations. The first user study (N=15) evaluates the usability of the adaptive user interfaces generated from the framework where storyboards were used as the stimulant. Extending the findings from the usability study and expanding the coverage of example scenarios, the second user study (N=23) evaluates the overall user experience of the adaptive user interfaces, using video prototypes as the stimulant.
The research demonstrates that the characteristics identified, and the respective knowledge representation models adequately captured the context of interpersonal privacy violation scenarios. Furthermore, the software architecture and the algorithms could detect possible interpersonal privacy violations and generate usable user interface adaptations to mitigate them. The two user studies demonstrate that the adaptive user interfaces, when used in appropriate situations, were a suitable solution for addressing interpersonal privacy violations while providing high usability and a positive user experience. The thesis concludes by providing recommendations for developing privacy-aware user interface adaptations and suggesting future work that can extend this research
The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis, también conocida como “Bt”, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteriólogo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como “Sottokin- Bacillus” (“Bacilo de muerte súbita”) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos años después, el biólogo Ernst Berliner aisló B. thuringiensis de crisálidas de polilla mediterránea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorgándole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Además, Berliner describió la presencia de una especie de cristal dentro de la célula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbiólogo Thomas A. Angus descubrió que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulación de Bt, eran responsables de su acción insecticida y las apodó “proteínas Cry” (del inglés crystal). A parte de estas proteínas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el año 1996 se descubrió una nueva clase de proteínas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en inglés “Proteínas Vegetativas Insecticidas”), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente tóxicas para lepidópteros.
Desde entonces, una amplia variedad de proteínas de Bt tóxicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran número de cepas aisladas, y han sido clasificadas en función de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holotípicas de proteínas Bt, y los principales órdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a algún tipo de proteína son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de proteínas, las proteínas Cry de tres dominios (“3D-Cry”) ylas proteínas Vip3 que afectan a lepidópteros. El modo de acción de estas proteínas, así como el ciclo de vida de Bt tras la infección del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes páginas.
El primer paso supone la ingestión de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las proteínas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilización es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las proteínas Vip3, no precisan de este paso de solubilización, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteolíticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritrófica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya función principal es la separación entre el alimento y las células epiteliales. Esta separación impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y también sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, vírico o parasítico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritrófica puede verse comprometido por la acción de las quitinasas endógenas o exógenas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritrófica, se produce una interacción entre las proteínas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las células del intestino medio, consideradas como las células diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigación de Bt durante las últimas décadas ha sido identificar cuáles son las moléculas que se unen de forma específica con las toxinas Cry o Vip3, así como deducir la relevancia de la función de esta interacción, tanto en el modo de acción de las toxinas como en los mecanismos de resistencia.
Actualmente, existen tres tipos de proteínas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las proteínas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (“APN”), las cadherinas y los transportadores “ABC” (del inglés “ATP-Binding Cassette”). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (“ALP”) también fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicación en la unión. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los últimos años. Son proteínas de membrana con capacidad para transportar distintas moléculas de forma activa gracias a la hidrólisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador más caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicación como receptor de proteínas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepidópteros resistentes a proteínas Bt.
En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacción han demostrado que los sitios de unión no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores específicos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la proteína ribosomal S2 como el “scavenger” tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del género Spodoptera. Además, este último se encuentra involucrado en la vía endocítica, siendo capaz de mediar la internalización de la toxina.
Existen numerosos estudios que han señalado que la actividad tóxica de las proteínas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las células diana. Este modelo (conocido como modelo de formación de poro) es actualmente el más respaldado por la comunidad científica debido al gran número de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores específicos, se forma una estructura oligomérica que se inserta en la membrana de las células intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osmótico que provoca un hinchamiento de las células, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las células intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no sólo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino también de todas aquellas bacterias oportunistas y otros patógenos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por último, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersión en el medio.
Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansión de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializó en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresión de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hectáreas de plantas de maíz, algodón o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el año 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extrañar que B. thuringiensis sea el agente microbiano más utilizado entre las soluciones biotecnológicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos años en descifrar cómo se comportan las proteínas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, aún queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acción de las proteínas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cuáles son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, dónde se localizan y por qué se encuentran alterados. Además, gracias a este conocimiento podemos combinar proteínas Bt con diferentes modos de acción con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones.
En el primer y segundo capítulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias proteínas Cry, así como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer cómo las proteínas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen proteínas Cry1 son comúnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos capítulos, elegimos una aproximación ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de células de insecto o las preparaciones de vesículas de membrana intestinales (“BBMV”, de sus siglas inglés, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones específicas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una línea de células de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versión completa, denominada “Sf21- FRA”. Además, utilizamos proteínas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de unión y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las proteínas Cry1A unen de forma específica y con alta afinidad a células que expresan el transportador, y que la presencia de éste en células es suficiente para causar toxicidad de las proteínas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua actúa como receptor funcional de las proteínas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A través de los dos capítulos, la falta de competencia de la proteína Cry1C, así como la ausencia de toxicidad en células HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta proteína. Estos resultados indican que la proteína Cry1C pueda poseer distintos sitios de unión en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga.
Por otra parte, observamos un fenómeno insólito en los ensayos de unión con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, producía una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la unión total conseguida por la I125-Cry1Aa a las células expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, éste competía de una forma habitual, exploramos por qué ocurría este comportamiento bifásico. Pudimos observar también estimulación causada a bajas concentraciones, e incluso más acentuada, al utilizar las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac o la proteína híbrida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las proteínas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bifásico al utilizar la proteína Cry1C o la proteína híbrida H205 (con los mismos dominios I y II que la proteínas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, común a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulación de la unión.
Curiosamente, también pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho más discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, así como autoradiografías de la misma. Tanto el tamaño molecular como la intensidad de la banda observada nos permitió determinar que la forma oligomérica de la proteína es la responsable de la respuesta estimulatoria, señalando este hecho la habilidad de las proteínas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-oligómeros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustitución del aminoácido Arg por Glu en la posición 99 del dominio I que impide la oligomerización. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a oligómero en las autoradiografías al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las proteínas en su versión no modificada, a través del dominio I, así como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2.
Además, las toxicidades observadas con las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac en células expresando el transportador, así como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer capítulo, nos permiten concluir que estas dos proteínas comparten un sitio de unión, que tiene poca afinidad por la proteína Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del híbrido H04, lo cual señaló al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la proteína Cry1Aa parecía tener un papel menos relevante en la unión a este sitio, pero aún así es tóxica para células expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el híbrido H205 como competidores. Pudimos concluir que la proteína Cry1Aa debe de tener otro sitio de unión en el transportador, el cual tendría alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de unión, también se podría unir la proteína Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por último, a través de distintas combinaciones de proteínas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-oligómeros que de homo-oligómeros no sólo también se trasladaba a mayores tasas de unión, sino a mayor toxicidad sobre las células. En resumen, el primer capítulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las proteínas Cry1A y el segundo capítulo demuestra la habilidad de formar hetero-oligómeros por las proteínas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador.
Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepidópteros juega un rol relevante en la unión y toxicidad de al menos las proteínas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con proteínas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito más de 400 transportadores ABC en artrópodos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y proteínas insecticidas es un gran reto en la investigación con Bt. A parte del ABCC2, sólo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con proteínas Bt, como el ABCB1 del coleóptero Chrysomela tremulae, receptor de la proteína Cry3Aa, el ABCA2 de los lepidópteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las proteínas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acción de la proteína Cry1Ac. Curiosamente, ningún otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacionó por primera vez un transportador ABC con las proteínas de Bt, hace ya más de una década.
En el tercer capítulo de la tesis, hemos realizado una búsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El análisis filogenético ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una proteína más distante atendiendo a su secuencia de aminoácidos. Según los modelos de predicción, ambos transportadores estarían formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para proteínas Bt desarrollando mutantes de deleción para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la técnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener líneas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducción en la toxicidad para ninguna línea mutante, en comparación con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, sí se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentración más baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la línea de mutantes con deleción en el ABCC3, aunque el grado de significación debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo número de réplicas en los bioensayos. Además, falta por confirmar la correcta deleción de los transportadores en ambas líneas de mutantes mediante la secuenciación del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN guías utilizados se diseñaron en el primer exón de cada gen, podrían haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se estén expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicación de los nuevos transportadores ABC con proteínas Bt tendrá que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acción de las proteínas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar líneas de mutantes con deleción del ABCC2 o dobles mutantes con deleción del ABCC2 y ABCC3, así como la evaluación, mediante ensayos con proteínas marcadas, de las capacidades de unión sobre las líneas de los mutantes. Por último, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, aún queda un gran número de transportadores ABC por describir en H. virescens.
Además de estudiar la interacción entre receptores putativos y proteínas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender cómo y por qué ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a proteínas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Está ampliamente aceptado que la alteración de unión al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a proteínas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de unión pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducción en la expresión de un gen que codifique para una proteína de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoacídicas que impidan la interacción entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A día de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones “wild-type” de transportadores ABC usando diferentes técnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleción mediante CRISPR, o expresión en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Además, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las proteínas Cry. En el cuarto capítulo, caracterizamos la funcionalidad de una versión alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleción en el segundo dominio de unión a nucleótidos (“NBD2”) que fue genéticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutación es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una línea celular de insecto que expresa la versión truncada del transportador denominada Sf21-XenR, así como la línea celular utilizada en los dos primeros capítulos que expresa la versión original del ABCC2 (Sf21-FRA).
A través del estudio de la secuencia de aminoácidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustitución,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular número 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoquímica mostraron la expresión del transportador truncado y su localización en la membrana de las células Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en células Sf21-XenR como en células Sf21 no transformadas como control. Las tres proteínas ensayadas fueron tóxicas contra células con expresión del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en células que expresan el transportador en su versión original (Capítulo 1). Además, los ensayos de unión con Cry1Ac marcada con I125 revelaron unión específica al transportador truncado, así como un valor similar en la constante de
3D printed Microneedles for Transdermal Drug Delivery
3D printing is a revolutionary manufacturing and prototyping technology that has altered the outlooks of numerous industrial and scientific fields since its introduction. Recently, it has attracted attention for its potential as a manufacturing tool for transdermal microneedles for drug delivery. In the present thesis, the 3D printability of solid and hollow microneedles via photopolymerisation-based 3D printing was investigated, aiming at establishing robust manufacturing strategies for reproducible, mechanically strong and versatile microneedles. The developed microneedles were employed as drug delivery systems for the treatment of diabetes via insulin administration.
Solid microneedles featuring different geometries were designed and 3D printed. It was demonstrated that the printing and post-printing parameters affected the printed quality, a finding that was employed to optimise the manufacturing strategy. Microneedle geometry was also found to have an impact on the piercing and fracture behaviour; however all microneedle designs were found to be mechanically safe upon application. The solid microneedles were subsequently coated with insulin-polymer films, using a 2D inkjet printing technology. The coating process achieved spatial control of the drug deposition, with quantitative accuracy. The microneedle geometry was shown to influence the morphology of the coating film, an effect that was pronounced during in the in vitro delivery studies of insulin to porcine skin.
Furthermore, hollow microneedles were designed and 3D printed, featuring different heights. Two photopolymerisation-based technologies were studied, and their performance was compared. The key influential parameters of the printing outcome and microneedle quality were identified to be the printing angle and the size of the microneedle opening. The hollow microneedles were found to be effective in piercing porcine skin without structural damaging. The hollow microneedles were incorporated into complex patches with internal microfluidic structures for the provision and distribution of drug-containing solutions. The developed complex hollow microneedle patches were coupled with a microelectromechanical system to create a novel platform device for controlled, personalised transdermal drug delivery. Advanced imaging techniques revealed that the device achieved distribution of the liquid within porcine skin tissue without the creation of depots that would delay absorption. The device was evaluated for its efficacy to transdermally deliver a model dye and insulin in vitro. In vivo trials were also conducted using diabetic rodents, with the device achieving faster onset of insulin action and sustained glycemic control, in comparison to subcutaneous injections.
Overall, the findings of the present research are anticipated to elucidate key problematic areas associated with the application of 3D printing for microneedle manufacturing and propose feasible solutions. The outermost goal of this work is to contribute to the advancement of knowledge in the field of 3D printed transdermal drug delivery systems, in order to bring them one step closer to their adoption in the clinical setting
Recommended from our members
Loss of C9orf72 Function Impairs the Peripheral Neuromuscular System and Anticipates Symptoms in ALS Mice.
Hexanucleotide repeat expansions in the C9orf72 gene is the prevalent genetic cause of ALS, causing neurodegeneration through two gain-of-function mechanisms due to the accumulation of RNA foci and dipeptide-repeat proteins, and a loss-of-function mechanism due to C9orf72 protein reduction.
The loss-of-function has never been examined in the peripheral compartment of neuromuscular system, precociously affected by ALS. In this work we observed that C9orf72 is expressed by Schwann cells and skeletal muscle in mice and the constitutive ablation of C9orf72 leads to mild muscle denervation, alterations of autophagy, increased immune cell infiltration and inflammation in muscle and peripheral nerve, typical features of ALS. Moreover, demyelination, activation of Schwann cells in a repair mode and autoimmunity were found in peripheral nerves of C9orf72-/- mice.
Evidence demonstrates that the loss-of-function synergizes with other toxic stimuli to induce neurodegeneration. Moreover, C9orf72 mutation often occurs in combination with other ALS or FTD-linked genes, suggesting oligogenicity of ALS. Therefore, to verify whether the C9orf72 loss-of-function could act as ALS modulator, we investigated the effect of C9orf72 constitutive ablation in SOD1G93A mice, the best characterized model of ALS. We found that the C9orf72 loss-of-function anticipated the onset of symptoms exacerbating denervation, autophagy impairment and inflammation in muscle, and enhancing axonal transport disruption in SOD1G93A mice. Conversely, increased anti-inflammatory gliosis in the spinal cord and extended survival were detected in SOD1G93A C9orf72-/- mice.
For the first time, in this work we demonstrated that C9orf72 is expressed in the peripheral compartment of neuromuscular system where it is pivotal in maintaining the homeostasis.
Despite the C9orf72 ablation had detrimental effects on this district and anticipated the symptom onset in ALS mice, unexpectedly it prolonged their lifespan. This suggests that reducing the C9orf72 expression in the later phase of the disease, for example through antisense oligonucleotides, might have a therapeutic relevance
- …