Determination of aspartate kinase activity in maize tissues

Lysine, threonine, methionine and isoleucine are synthesized from aspartate in a branched pathway in higher plants. Aspartate kinase plays a key role in the control of the aspartate pathway. The enzyme is very sensitive to manipulation and storage and the hydroxamate assay normally used to determine aspartate kinase activity has to be altered according to the plant species and tissue to be analyzed. We have optimized the assay for the determination of aspartate kinase in maize plants callus cell cultures. Among all the assay parameters tested, the concentration of ATP/Mg and temperature were critical for enzyme activity. In the case of temperature, 35°C was shown to be the optimum temperature for aspartate kinase activity.Lisina, treonina, metionina e isoleucina são derivados do aspartato. Aspartato quinase tem um papel chave no controle da via metabólica do aspartato. A enzima é muito sensível à manipulação e armazenagem e o ensaio enzimático do hidroxamato que é normalmente utilizado para determinar a atividade da aspartato quinase deve ser alterado de acordo com a espécie de planta e tecido vegetal a ser analisado. Nós otimizamos o ensaio para a determinação da atividade da aspartato quinase em culturas celulares de calos de milho. Entre os vários parâmetros testados do ensaio, a concentração de ATP/Mg e temperatura foram críticos para atividade enzimática. No caso da temperatura, 35°C foi a temperatura ótima para atividade da aspartato quinase

Alterations in isozyme patterns induced by different levels of iron, manganese and boron on white lupin

Tremoceiros brancos, quando cultivados em soluções nutritivas com vários níveis de ferro, manganês ou boro, apresentaram perfis isoenzimáticos diferentes, de aspartato-aminotransferases, fosfatases ácidas e carboxilesterases. Concentrações elevadas de ferro ou manganês induziram a síntese de novas isoenzimas com actividade de aspartato-aminotransferase. Estas apresentaram mobilidades electroforéticas menores do que as das enzimas normalmente presentes. Altas concentrações de ferro também inibiram a actividade de uma carboxilesterase. Uma fosfatase ácida foi estimulada nas folhas, por altos níveis de manganês. A falta de ferro na solução nutritiva conduziu à inibição de uma fosfatase ácida e a de manganês à de uma carboxilesterase. Elevados níveis de boro inibiram a actividade de todas as aspartato- aminotransferases normalmente presentes nas raízesinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Estudo do efeito da densidade celular na interacção baculovírus - célula de insecto: perspectiva metabólica

Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009O Sistema de Expressão Baculovírus-Célula de Insecto (BEVS-IC) apresenta um grande potencial na indústria biotecnológica e farmacêutica. As suas aplicações são vastas passando pela produção de proteínas recombinantes, vacinas e VLPs e, mais recentemente, vectores para terapia génica. Não obstante, o nível de conhecimento fundamental sobre este sistema é ainda reduzido. Neste trabalho, propusemo-nos a potenciar a capacidade produtiva do sistema BEVS-IC, explorando as alterações metabólicas que decorrem da interacção vírus-célula no cenário pós-infecção. Foram investigados os passos limitantes do metabolismo celular e respectivas enzimas reguladoras. Os resultados obtidos foram complementados com dados de análise de fluxo metabólico, numa abordagem integrativa de Biologia de Sistemas. Dois pontos-chave no controlo do metabolismo oxidativo foram identificados: a regulação do fluxo glicolítico é exercida pela hexokinase, enquanto que a isocitrato desidrogenase é responsável pela actividade do ciclo dos ATCs. Estas enzimas foram portanto identificadas como alvos promissores para engenharia metabólica. A infecção com baculovírus provocou um aumento na actividade da enzima glutamato desidrogenase, estando associado à manutenção do status energético celular e assegurando assim melhores condições para a replicação viral. Este resultado evidencia a capacidade de manipulação da maquinaria celular e utilização o metabolismo celular por parte do vírus. Este trabalho permitiu-nos identificar os pontos-chave de controlo do metabolismo de células Sf9. De um ponto de vista fundamental, foram estudados e racionalizados os cenários metabólicos mais marcantes que se estabelecem no período pós-infecção, decorrentes da interacção vírus-célula. De um ponto de vista tecnológico, os resultados obtidos servem agora de plataforma para o desenvolvimento de novas estratégias biomoleculares e de bioprocesso em vista à optimização da produtividade do sistema.The Insect Cells-Baculovirus Vector Expression System (IC-BEVS) has a great potential in the biotechnological and pharmaceutical industry. It has been recognized regarding its numerous applications, such as the production of heterologous proteins, vaccines and virus like particles (VLPs) and, more recently, vectors for gene therapy. Nevertheless, a more fundamental understanding of this system is still needed. In the work herein presented we intended to improve the productivity of the IC-BEVS, by exploiting the major metabolic alterations that take place during the post-infection scenario as the result of the interactions between the host cell and the virus itself. Within this scope, the main metabolic pathways and the flux controlling enzymes involved were investigated. The results obtained were complemented with metabolic flux analysis data, with the main aim of integrating them in a Systems Biology perspective. Two key-points regarding the oxidative metabolism were identified: hexokinase is responsible for the regulation of the glycolytic flux, and isocitrate dehydrogenase limits the flux through the TCA cycle. Therefore both enzymes were selected as promising targets for metabolic engineering. The activities of glutamate dehydrogenases increased after infection with baculovirus, and this happened within the maintenance of the cellular energetic state to guarantee better conditions for viral replication. This result demonstrates the capacity of the virus to manipulate the cellular metabolism for its own profit, providing better conditions for viral replication. This work allowed us to unveil the metabolic regulatory key-points of Sf9 cells. From a fundamental point of view, the most important metabolic scenarios that occur during the post-infection period were addressed. From a technological point of view, the results herein presented can be exploited for further development of new strategies in terms of bioprocess engineering to attain the ultimate goal: improvement of systems productivity

Risk factors associated with calcinosis of juvenile dermatomyositis

OBJETIVO: Identificar fatores de risco associados à calcinose em crianças e adolescentes com dermatomiosite juvenil. MÉTODOS: Prontuários de 54 pacientes com dermatomiosite juvenil foram estudados. Foram avaliados dados demográficos; características clínicas: grau de força muscular (I a V do Medical Research Council), presença de comprometimentos pulmonar (distúrbio ventilatório restritivo com presença ou ausência do anticorpo anti-Jo-1), gastrointestinal (refluxo gastroesofágico) e cardíaco (pericardite e/ou miocardite); exames laboratoriais: elevação de enzimas musculares (creatinoquinase, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase e desidrogenase lática) e terapias utilizadas: corticoterapia isolada ou associada à cloroquina e/ou imunossupressor. Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a presença ou ausência de calcinose e foram avaliados através de análise univariada e multivariada. RESULTADOS: Calcinose foi evidenciada em 23 (43%) pacientes, sendo em seis (26%) antes do diagnóstico e em 17 (74%) após. A análise univariada revelou que comprometimentos cardíaco (p = 0,01) e pulmonar (p = 0,02) e necessidade da utilização de um ou mais imunossupressores (metotrexato, ciclosporina A e/ou pulsoterapia com ciclofosfamida endovenosa) no tratamento da dermatomiosite juvenil (p = 0,03) foram associados com uma maior incidência de calcinose. A análise multivariada mostrou que comprometimento cardíaco (OR = 15,56; IC95% 1,59-152,2) e uso de um ou mais imunossupressores (OR = 4,01; IC95% 1,08-14,87) foram as únicas variáveis independentes associadas à presença de calcinose. CONCLUSÕES: O aparecimento da calcinose foi freqüente na dermatomiosite juvenil, habitualmente na evolução da doença. A calcinose foi associada aos casos mais graves, que apresentaram envolvimento cardíaco e necessitaram da utilização de imunossupressores no seu tratamento.OBJECTIVE: To identify risk factors associated with calcinosis in children and adolescents with juvenile dermatomyositis. METHODS: A review was carried out of the medical records of 54 patients with juvenile dermatomyositis. Data were collected on demographic characteristics, clinical features: muscle strength (stages I to V of the Medical Research Council scale), pulmonary involvement (restrictive pulmonary disease with presence or absence of anti-Jo1 antibodies), gastrointestinal problems (gastroesophageal reflux) and/or heart disease (pericarditis and/or myocarditis); laboratory tests: elevated muscle enzyme levels in serum (creatine phosphokinase, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and/or lactate dehydrogenase); and on the treatments given: corticoid therapy in isolation or associated with hydroxychloroquine and/or immunosuppressants. The patients were divided into two groups, depending on presence or absence of calcinosis and data were evaluated by both univariate and multivariate analyses. RESULTS: Calcinosis was identified in 23 (43%) patients, and in six (26%) patients it had emerged prior to diagnosis while in 17 (74%) it was post diagnosis. The univariate analysis revealed that cardiac (p = 0.01) and pulmonary (p = 0.02) involvement and the need for one or more immunosuppressor (methotrexate, cyclosporine A and/or pulse therapy with intravenous cyclophosphamide) to treat juvenile dermatomyositis (p = 0.03) were all associated with an increased incidence of calcinosis. The multivariate analysis then demonstrated that only cardiac involvement (OR = 15.56; 95%CI 1.59-152.2) and the use of one or more immunosuppressor (OR = 4.01; 95%CI 1.08-14.87) were independently associated with the presence of calcinosis. CONCLUSIONS: Calcinosis was a frequent development among these juvenile dermatomyositis cases, generally emerging as the disease progressed. Calcinosis was associated with the more severe cases that also had cardiac involvement and where immunosuppressors had to be included in the treatment

Antiferromagnetic spin chain behavior and a transition to 3D magnetic order in Cu(D,L-alanine)2: Roles of H-bonds

We study the spin chain behavior, a transition to 3D magnetic order and the magnitudes of the exchange interactions for the metal-amino acid complex Cu(D,L-alanine)2.H2O, a model compound to investigate exchange couplings supported by chemical paths characteristic of biomolecules. Thermal and magnetic data were obtained as a function of temperature (T) and magnetic field (B0). The magnetic contribution to the specific heat, measured between 0.48 and 30 K, displays above 1.8 K a 1D spin-chain behavior that can be fitted with an intrachain antiferromagnetic (AFM) exchange coupling constant 2J0 = (-2.12 $\pm$ 0.08) cm$^{-1}$, between neighbor coppers at 4.49 {\AA} along chains connected by non-covalent and H-bonds. We also observe a narrow specific heat peak at 0.89 K indicating a phase transition to a 3D magnetically ordered phase. Magnetization curves at fixed T = 2, 4 and 7 K with B0 between 0 and 9 T, and at T between 2 and 300 K with several fixed values of B0 were globally fitted by an intrachain AFM exchange coupling constant 2J0 = (-2.27 $\pm$ 0.02) cm$^{-1}$ and g = 2.091 $\pm$ 0.005. Interchain interactions J1 between coppers in neighbor chains connected through long chemical paths with total length of 9.51 {\AA} are estimated within the range 0.1 < |2J1| < 0.4 cm$^{-1}$, covering the predictions of various approximations. We analyze the magnitudes of 2J0 and 2J1 in terms of the structure of the corresponding chemical paths. The main contribution in supporting the intrachain interaction is assigned to H-bonds while the interchain interactions are supported by paths containing H-bonds and carboxylate bridges, with the role of the H-bonds being predominant. We compare the obtained intrachain coupling with studies of compounds showing similar behavior and discuss the validity of the approximations allowing to calculate the interchain interactions.Comment: 10 pages, 4 figure

Identificación de nuevos agentes reguladores del inflamasoma: posibilidades para el desarrollo de fármacos antiinflamatorios

El contenido de esta revisión parte de un conocimiento global sobre el inflamasoma. Comenzando por los receptores de reconocimiento de patrones o PRR, que pueden tener una localización transmembranal o bien en orgánulos intracelulares. Los PRR se unen a ligandos que van a permitir que se desencadene el proceso de regulación o activación de los inflamasomas. Hay distintos tipos clasificados, según su modo de activación, en canónicos y no canónicos y también en distintas familias. El más conocido es el inflamasoma NLRP3, que se trascribe en respuesta a diversos estímulos y en su ensamblaje participa ASC y caspasa-1, activándose la última y produciéndose la liberación de IL-1β e IL-18 que da lugar a procesos inflamatorios de muerte celular. Algunas enfermedades como la fibromialgia, las enfermedades inflamatorias intestinales y las enfermedades cardiovasculares son causadas por la activación del inflamasoma. El conocimiento del proceso que da lugar a la activación y regulación del inflamasoma abre una ventana para reconocer posibles agentes reguladores que permitan tratar las patologías en las que interviene. Actualmente se ha conocido el mecanismo de acción de moléculas como el levornidazol (que disminuye la liberación de ROS, el creosol que reduce la expresión de NLRP3 y de proIL-1β), el resveratrol (inhibidor de la α-tubulina desacetilasa), la melatonina (que presenta efectos inhibidores sobre NF- κβ, suprime la liberación de histonas extracelulares e impide la expresión de genes que traducen el NLRP3), partenolida y BH 11-7082 (con capacidad de alquilar restos de cisteína que inhiben la activación de NF- κβ), el aspartato y glutamato (que van a inhibir la transcripción de la proteína NLRP3 y de la pro-IL- 1β al activar los canales NMDA) y el γ-tocotrienol (que actúa inhibiendo la señalización de NF-κB).Universidad de Sevilla. Grado en Farmaci

INDICADORES BIOQUÍMICOS SÉRICOS E DO LÍQUIDO PERITONEAL DE EQUINOS SUBMETIDOS À OBSTRUÇÃO INTESTINAL

Twenty-four horses were distributed into four different groups, instrumented control (GI), duodenum obstruction (GII), ileum obstruction (GIII) and large colon obstruction (GIV). Serum and peritoneal fluid analysis of aspartate aminotransferase, creatine kinase, lactate dehydrogenase, alkaline phosphatase, inorganic phosphorus and lactate were measured. Samples were collected one hour before the surgical procedure (T0); 3 hours after the obstruction (T3ob), 1, 3, 12, 24, 120 and 168 hours after the beginning of reperfusion/deobstruction. Duodenal (GII) and ileum (GIII) obstructions changed serum and peritoneal fluid biochemical analysis. However, only lactate, lactate dehydrogenase, creatine kinase and inorganic phosphorus concentrations were abnormal in peritoneal fluid three hours after the obstruction. The biochemical analysis of peritoneal fluid allowed a faster diagnostic of intestinal alterations than the serum analysis; hence it should be prioritized when pre-operatory colic assessment is carried out

Estudo dos efeitos da cisplatina sobre o sistema trocador cistina-glutamato em células de glioblastoma humano a172

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.Gliomas malignos correspondem a um grupo heterogêneo de tumores do sistema nervoso central (SNC). A maioria destes tumores se origina da transformação neoplásica de astrócitos, com crescimento inicial lento, progredindo para astrocitomas que podem originar a forma mais agressiva de tumores derivados de células gliais. Astrócitos transformados perdem a capacidade de controlar sua proliferação e ainda de exercer seu papel como reguladores das funções do SNC. Gliomas ativam mecanismos capazes de aumentar os níveis extracelulares de glutamato. Desta forma, estas células podem se tornar capazes de causar a morte das células peritumorais por excitotoxicidade glutamatérgica, constituindo assim uma via de invasão, resistência e crescimento tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transporte de glutamato em células de glioblastoma humano A172, após o tratamento com o quimioterápico cisplatina. Não foram observadas alterações na viabilidade destas células após o tratamento com cisplatina (50 e 100 μM). Demonstramos também um aumento significativo e dosedependente na liberação de glutamato por estas células tratadas com cisplatina. Ainda, a inibição do trocador cistina-glutamato com sulfasalazina promoveu uma redução significativa nos níveis de glutationa intracelular, sugerindo que a liberação exarcebada de glutamato por estas células de glioma provavelmente é mediada por este sistema trocador. Estes estudos são de fundamental importância para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos nestes processos e assim desenvolver novos tratamentos coadjuvantes para os gliomas, buscando assim melhores prognósticos para pacientes acometidos por esta doença