Spatio-temporäre Analyse des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors : Modulation der Signaltransduktion durch das humane Papillomavirus Typ 16 E5-Protein

Ursächlich für die Entstehung eines Zervixkarzinoms ist eine persistierende Infektion mit humanpathogenen Papillomaviren (HPV) des sogenannten Hochrisiko-Typs, deren DNA-Sequenzen in mehr als 65% aller Zervixkarzinome nachgewiesen werden konnten. Die HPV-Familie besteht aus mehr als 100 Typen, von denen vorwiegend die Typen 16 und 18 mit der tumoralen Entwicklung assoziiert sind. Verantwortlich für die Malignisierung des Epithels sind drei Onkogene des HPV-Typs 16, dazu zählt das kleine, hydrophobe Protein E5, welches hauptsächlich in der Membran von Golgi-Apparat und endosomaler Kompartimente lokalisiert ist. Das Protein besitzt selbst nur schwache transformierende Eigenschaften, ist aber in der Lage die Onkogenizität der beiden anderen Onkogene E6 und E7 zu potenzieren. Der Haupteffekt des E5-Onkogens ist eine Überaktivierung des EGF-Rezeptors (EGFR), deren Folge eine gesteigerte Transkription mit anschließender Mitose ist. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der zellbiologischen Mechanismen, die durch E5 moduliert werden und eine verstärkte Aktivierung der EGF-Rezeptoren bewirken. Die quantitative Analyse mittels Immunblot und On-Cell Western Blot zeigte in Anwesenheit von HPV16 E5 eine Zunahme an Oberflächen-assoziierten EGF-Rezeptoren. Folglich wurde im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine Verstärkung der Liganden-vermittelten EGFR-Aktivierung hervorgerufen, die über einen langen Zeitraum nach Zugabe von EGF anhielt und unabhängig von der Internalisierungsrate war. Zusätzlich zu den klassischen molekular- und zellbiologischen Methoden wurde eine neue Technologie eingesetzt, die eine spatio-temporäre Analyse der E5-bedingten Modulation der EGFR-Signaltransduktion ermöglichte. Mit Hilfe der automatisierten, quantitativen Analyse von drei-dimensionalen Multikanalbildern, die am konfokalen Mikroskop generiert wurden, konnte eine genaue Charakterisierung des endozytotischen Transports von aktivierten und Gesamt-EGFR in Leervektor- und E5-transduzierten Zellen erfolgen. Der Einsatz von Vesikel-spezifischen Markern ermöglichte zudem die genaue Lokalisation der Rezeptoren innerhalb eines spezifischen zellulären Kompartiments. In Anwesenheit von E5 konnte eine stärkere und schnellere Fusion von EGFR-positiven Vesikeln mit dem frühen Endosomen nachgewiesen werden. Durch das zügige Fortschreiten des endozytotischen Transports erreichte eine deutliche höhere Anzahl von phospho-EGFR-positiven Vesikeln frühzeitig die perinuklear lokalisierten multivesikulären Körperchen (MVB), ohne zuvor die zytoplasmatischen MVBs zu passieren. Zu den späten Zeitpunkten der EGF-Stimulation konnte eine Akkumulation von aktivierten Rezeptoren in perinuklearen Endosomen-ähnlichen Kompartimenten heterogener Struktur dokumentiert werden, die mit einer verminderten Dephosphorylierung von aktivierten Rezeptoren verbunden war und schließlich zu einer langanhaltenden Überaktivierung von EGF-Rezeptoren führte. Durch die Behandlung mit dem Recycling-Inhibitor Monensin konnte im Vergleich zu den Kontrollen keine Beeinträchtigung der Phosphorylierung von EGFR in E5-exprimierenden Zellen dokumentiert werden. Damit kann eine potentielle Zunahme des Recyclings von EGF-Rezeptoren als Ursache der E5-vermittelten Überaktivierung ausgeschlossen werden. Die hier dargestellten Ergebnisse beweisen, dass die verstärkte und langanhaltende Aktivierung von EGFR durch eine modifizierte Endozytose und Dephosphorylierung während des Transports der Rezeptoren von frühen Endosomen zu den multivesikulären Körperchen verursacht wird. Dadurch umgehen die Rezeptoren den Abbau in den Lysosomen und bewirken eine gesteigerte Transkription früher Gene im Nukleus, die in einer EGFR-vermittelten Deregulation der Zellproliferation, -differenzierung und Apoptose resultiert

Einfluss der Wurzel- und Regenwurmaktivität auf die Morphologie von Bioporen im Unterboden

Abstract Zugänglichkeit und Mobilisierung von Nährstoffressourcen aus dem Unterboden durch Bioporennetzwerke sind nach wie vor im Fokus aktueller Forschung [1][2][3]. Wichtig ist hierbei die Generierung von quantitativen Daten zu Eigenschaften der Rhizo-Drilosphäre und der Porenarchitektur. Um ein besseres Verständnis der 3D-Dynamik von Bioporen alspräferentielle Fließpfade undderen Effekt auf die Nährstoffaufnahme aus dem Untergrund zu erhalten, werden hoch aufgelöste dreidimensionale Rauminformationen benötigt. Mit der Röntgen-Mikrotomographie (μCT) und 3D-Bildanalyse wurden mikrostrukturelle Eigenschaften von Bioporennetzwerken, die durch Wurzeln und Regenwürmer erzeugt wurden, als Funktion des Abstandes von der Bioporenwandung bestimmt . Dazu wurden in 1 bis 10 mm Abstand die zugängliche Oberfläche, das Porenvolumen und die Porosität innerhalb der Rhizo-Drilosphäre quantifiziert. Erkenntnisse über den Einfluss der Bioporengenese auf die Porengeometrien und somit auf den potentiellen Gas- und Wasseraustausch zwischen dem Gesamtboden und der Rhizo-Drilosphäre führen wiederum zu einem besseren Verständnis über die Nährstoffzugänglichkeit und mikrobiologische Aktivität in den Bioporen

Analyse der räumlichen Variabilität von Makroporenstrukturen in Lössböden anhand geostatistischer Auswertungen von 3D-Röntgen-CT Bildern

Eigenschaften von Porennetzwerken (z.B. Konnektivität und Tortuosität) und deren Funktionen (z.B. Transport von Sauerstoff und Wasser) sind von großer Bedeutung für das Pflanzenwachstum. Die unterschiedliche und sich überlagernde Genese von Porenräumen in Böden, z.B. durch Wurzeln und Regenwürmer entstandene Bioporen oder Quellungs- und Schrumpfungsrisse, führen zu äußerst komplexen und räumlich heterogenen dreidimensionalen Porenraumstrukturen, die mit einfachen Parametern wie Porositäten oder Porengrößenverteilungen nur unzureichend beschrieben sind. Vor dem Hintergrund, dass moderne bildgebende Technologien wie die Röntgen-Computertomographie zunehmend zur Analyse und Quantifizierung von Porenraumeigenschaften und ihrer Beziehung zu Bodenfunktionen zum Einsatz kommen, ergeben sich vielfältige Möglichkeiten der bildanalytischen Auswertung der generierten Datensätze. Dabei ist eine genauere Beschreibung der räumlichen Heterogenität und die getrennte Auswertung von unterschiedlich entstandenen Porenräumen (abiotisch versus biotisch) von Interesse, um deren relativen Beitrag zu porenskaligen Prozessen (Austauschvorgänge an Poren/Matrix-Grenzflächen, Transportfunktionen, etc.) besser quantifizieren zu können.  In dieser Studie wurden Bodenmonolithe (Ø 20 cm, 70 cm Höhe) aus einem Feldversuch in der Nähe von Bonn (NRW, Deutschland) verwendet. Die Bodenmonolithe wurden aus dem Unterboden (45 - 105 cm) eines Versuches mit unterschiedlicher Wurzelausprägung durch Vorfrüchte entnommen und mit einem industriellen Röntgen-CT gescannt. Mittels 3D-Bildanalyse und geostatistischer Methoden wurden quantitative und qualitative Parameter des Porenraums untersucht. Dabei konnten Unterschiede in der Bodenstruktur, in Abhängigkeit der Wurzelsysteme der Vorfrüchte, festgestellt werden. Insbesondere konnte die Häufigkeit, Größenverteilung und Raumverteilung (randomisiert, gruppiert, etc.) der Porenstrukturen festgestellt werden. Weiter konnten   Anisotropieeigenschaften und Hauptorientierungsrichtungen der Makroporen ermittelt werden. Anhand dieser morphologischen Information war es möglich die Makroporen in Bioporen (hauptsächlich Wurzelpfade und Regenwurmgänge) und abiotische Strukturporen (hauptsächlich durch quellen und schrumpfen) zu unterteilen. Aufgrund der unterschiedlichen Wurzelausprägung in den untersuchten Proben, zeigten sich Unterschiede in diesen Porenkategorien. Inwieweit sich diese Porenkategorien  funktionell unterscheiden und welchen Einfluss sie jeweils auf den Wasser-, Gas- und Nährstoffhaushalt von Böden haben soll diskutiert werden

Charakterisierung allergeninduzierter immunologischer Reaktionen im Asthmamodell und ex vivo in Precision cut lung slices (PCLS)

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Ein neuer quantitativer Biomarker aus der prätherapeutischen MRT zur Voraussage des Überlebens nach stereotaktischer Radiotherapie einer singulären Hirnmetastase

Hirnmetastasen sind die häufigsten intrakraniellen malignen Raumforderungen. Obwohl sich mehrere Parameter für eine Prognose der Lebenszeiterwartung betroffener Patienten eignen, haben sich noch keine daraus abgeleiteten Indizes im klinischen Alltag etablieren können. Wir untersuchten daher das Potenzial eines neuartigen radiomischen Biomarkers für die Prognose des Überlebens von Patienten mit singulärer Hirnmetastase, die mit stereotaktischer Radiotherapie (SRT) behandelt wurden, indem wir das Kontrastmittelverhalten des Tumors in der prätherapeutischen Magnetresonanztomographie (MRT) analysierten. Die Untersuchung beinhaltete die retrospektive Auswertung der Aufnahmen von 48 SRT-Patienten mit singulären Hirnmetastasen (27 Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC), 21 Patienten mit malignem Melanom). Die dreidimensionale (3D)-Segmentierung des Tumors zur Quantifizierung des Tumorvolumens und seiner Kontrastmittel (KM)-aufnehmenden Anteile wurde anhand von MRT-Bildern des Neurokraniums vorgenommen, die vor Therapiebeginn angefertigt worden waren. Zwei Kohorten wurden anhand eines Schwellenwertes von 68,61 % KM-aufnehmendem Tumorvolumen stratifiziert und die prognostische Aussagekraft der KM-Aufnahme für das Gesamtüberleben und das intrakranielle progressionsfreie Überleben (iPFS) analysiert. Wir konnten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Kontrastmittelaufnahme des Tumors und dem Gesamtüberleben aufzeigen: Patienten, deren Tumoren in prätherapeutischen MRT-Bildern zu großvolumiger KM-Aufnahme neigen, weisen ein verbessertes Gesamtüberleben und iPFS gegenüber Patienten auf, deren Tumoren weniger kräftig KM anreicherten. Die KM-Aufnahme des Tumors eignet sich unseren Ergebnissen zufolge als radiomischer Biomarker, der objektiv und vergleichsweise einfach erhoben werden kann und als prognostischer Index zur Abschätzung des Gesamtüberlebens bei Patienten mit singulären Hirnmetastasen genutzt werden kann.Brain metastases (BM) are the most frequent intracranial malignant tumors. Various prognostic factors facilitate the prediction of survival; however, few have become tools for clinical use. The aim of this study is to investigate the role of three-dimensional (3D) quantitative tissue enhancement in pre-treatment cranial magnetic resonance imaging (MRI) as a radiomic biomarker for overall survival (OS) in patients with singular BM treated with stereotactic radiation therapy. In this retrospective study, 48 patients (27 NSCLC and 21 melanoma) with singular BM treated with SRT, were analyzed. Contrast-enhanced MRI scans of the neurocranium were used for quantitative image analyses. Segmentation-based 3D quantification was performed to measure the enhancing tumor volume. A cut-off value of 68.61 % of enhancing volume was used to stratify the cohort into two groups (≤68.61 % and > 68.61 %). Univariable and multivariable cox regressions were used to analyze the prognostic factors of OS and iPFS. The level of enhancing tumor volume achieved statistical significance in univariable and multivariable analysis for OS. Patients with high-level enhancement (>68.61 % enhancing lesion volume) survived significantly longer and showed significantly longer iPFS rates. Patients with lesions that show a higher percentage of enhancement in pre-treatment MRI demonstrated improved iPFS and OS compared to those with mainly hypo-enhancing lesions. Lesion enhancement may be a radiomic marker, useful in prognostic indices for survival prediction, in patients with singular BM

Lipid nanoparticles as a drug delivery system for the lung

In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals Nanosuspensionen (SLN = solid lipid nanoparticles), bestehend aus einem natürlichen Triglyceridgemisch (Softisan 154) und Sojalecithin (Phospholipon 90G), auf ihr inflammatorisches und toxikologisches Potenzial untersucht. Diese Evaluierung wurde anhand von drei verschiedenen Modellen (in vitro, ex vivo und in vivo) dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Nanosuspensionen bei pulmonaler Applikation bis zu einer deponierten Dosis von 200 µg toxikologisch unbedenklich sind. Nachdem die toxische Schwelle der SLN als potenzielles Arzneistoffträgersystem ermittelt worden war, konnte in einem nächsten Schritt der Modellarzneistoff Dexamethason in die SLN inkorporiert werden. Durch physikochemische Untersuchungen wurde festgestellt, dass für die SLN bei 1 % Arzneistoffeinarbeitung eine Einschlusseffizienz von annähernd 100 % vorlag. Nach Inkorporierung von Dexamethason stieg die Partikelgröße leicht an, während sich das Zetapotenzial nur unwesentlich veränderte. Im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden Aufnahmeuntersuchungen von SLN an verschiedenen Zelltypen durchgeführt. Damit die SLN in den Zellen identifiziert werden konnten, wurden sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die Partikelgröße und das Zetapotenzial änderten sich nach Beladung der SLN mit den Farbstoffen nur marginal. Es konnte gezeigt werden, dass die Nanopartikel von alveolären Epithelzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen aufgenommen wurden und sich in der Nähe des Zellkerns anreicherten. In einem abschließenden Versuch wurden die fluoreszenzmarkierten SLN als Aerosol an Mäuse verabreicht. Dabei zeigte die Untersuchung der regionalen Lymphknoten, dass SLN-positive Lymphozyten nachweisbar waren. Feste Lipidnanopartikel sind für den Einsatz als Arzneistoffträgersystem sehr viel versprechend, da sie eine hohe toxische Schwelle besitzen und die Möglichkeit beinhalten, Wirkstoffe zu adsorbieren bzw. zu inkorporieren.The pulmonary route as an alternative, non-invasive approach for both local and systemic drug delivery is becoming increasingly relevant. The aim of the thesis was to investigate the therapeutic window of solid lipid nanoparticles (SLN) as a suitable inhalational drug delivery system. SLN consist of solid lipids in nanosized range dispersed in aqueous medium. The SLN used in the present thesis consist of naturally triglyceride mixture (Softisan 154) and soy lecithin (Phospholipon 90G) and these were investigated for their inflammatory and toxicological potential. To address these questions three different model systems were used (in-vitro, ex-vivo and in-vivo). The results of the in-vivo study revealed no toxicity upon pulmonary application up to deposited doses of 200 µg of these nanosuspensions. For further studies the model substance dexamethasone was incorporated. To determine the physicochemical properties of the nanoparticles after the encapsulation of the dexamethasone, the entrapment efficiency, the particle size and the zeta potential were analyzed. Entrapment efficiency of approximately 100% can be achieved by the encapsulation of 1% dexamethasone. After the incorporation the particle size slightly increased whereas the zeta potential changed marginally. In a further step the internalization of fluorescent-labeled SLNs into different cell types was detected in-vitro. Subsequent confocal microscopy showed that the nanoparticles were internalized in lung epithelial cells (A549), macrophages and dendritic cells. Moreover it was possible to detect an intracellular accumulation close to the nucleus. Finally the fluorescent-labeled SLNs were aerosolized to mice. The analysis of the lung associated lymph nodes demonstrated that SLN-positive lymphocytes were detectable. The results of the present thesis demonstrate that SLN are a promising drug delivery system for the lung because of the high dose tolerated and the possibility of drug incorporation and adsorption

Propionic Acid Degradation by Syntrophic Bacteria During Anaerobic Biowaste Digestion

Propionic acid is an important intermediate produced during anaerobic degradation of biowaste and a precursor of a large amount of methane. Its accumulation during biomethanation is however a common problem resulting in stagnation phases in biogas production. During this study, the deeper insight into the process of propionic acid degradation was intended by using modern analytical chemistry, standard microbiological approach and molecular biology for describing and explaining the problem

Propionic acid degradation by syntrophic bacteria during anaerobic biowaste treatment

Propionic acid is an important intermediate produced during anaerobic degradation of biowaste and a precursor of a large amount of methane. Its accumulation during biomethanation is however a common problem resulting in stagnation phases in biogas production. During this study, the deeper insight into the process of propionic acid degradation was intended by using modern analytical chemistry, standard microbiological approach and molecular biology for describing and explaining the problem