52,968 research outputs found

    Contenedor familiar

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    El proyecto art√≠stico planteado crea un ‚Äúarchivo familiar basura‚ÄĚ interviniendo dentro de los contenedores en las calles que ofrece la cartograf√≠a web y estableciendo una simbiosis entre la basura y la imagen de la familia. Mediante intervenciones, apropiaciones y fakes que dan forma a la obra, pongo en cuesti√≥n el canon proyectado sobre y por los cong√©neres a trav√©s de las generaciones. A su vez, reconceptualizo la idea estandarizada de basura. La acci√≥n art√≠stica gira en torno a la p√©rdida de la funci√≥n. La imagen de la familia toma para construirse a s√≠ misma estructuras heredadas, pautas a seguir, que perpetua para saciar el anhelo y las ambiciones. El archivo familiar cumple la funci√≥n de transmitir a la prole sucesora este modelo opresor; sin embargo, la obra deja a este archivo gr√°fico sin su funcionalidad y queda al nivel de la basura pudiendo tener una nueva utilidad, una nueva vida lejos de la original. Esta acci√≥n no proviene del rencor de la b√ļsqueda de resignificar, consiste en el perd√≥n, la redenci√≥n y el renacer

    Identification of Hindbrain Neural Substrates for Motor Initiation in the hatchling Xenopus laevis Tadpole

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    Animal survival profoundly depends on the ability to detect stimuli in the environment, process them and respond accordingly. In this respect, motor responses to a sensory stimulation evolved into a variety of coordinated movements, which involve the control of brain centres over spinal locomotor circuits. The hatchling Xenopus tadpole, even in its embryonic stage, is able to detect external sensory information and to swim away if the stimulus is considered noxious. To do so, the tadpole relies on well-known ascending sensory pathway, which carries the sensory information to the brain. When the stimulus is strong enough, descending interneurons are activated, leading to the excitation of spinal CPG neurons, which causes the undulatory movement of swimming. However, the activation of descending interneurons that marks the initiation of motor response appears after a long delay from the sensory stimulation. Furthermore, the long-latency response is variable in time, as observed in the slow-summating excitation measured in descending interneurons. These two features, i.e. long-latency and variability, cannot be explained by the firing time and pattern of the ascending sensory pathway of the Xenopus tadpole. Therefore, a novel neuronal population has been proposed to lie in the hindbrain of the tadpole, and being able to 'hold' the sensory information, thus accounting for the long and variable delay of swim initiation. In this work, the role of the hindbrain in the maintenance of the long and variable response to trunk skin stimulation is investigated in the Xenopustadpole at developmental stage 37/38. A multifaceted approach has been used to unravel the neuronal mechanisms underlying the delayed motor response, including behavioural experiments, electrophysiology analysis of fictive swimming, hindbrain extracellular recordings and imaging experiments. Two novel neuronal populations have been identified in the tadpole's hindbrain, which exhibit activation patterns compatible with the role of delaying the excitation of the spinal locomotor circuit. Future work on cellular properties and synaptic connections of these newly discovered populations might shed light on the mechanism of descending control active at embryonic stage. Identifying supraspinal neuronal populations in an embryonic organism could aid in understanding mechanisms of descending motor control in more complex vertebrates

    Uso de las histonas circulantes y sus modificaciones post-traduccionales como biomarcadores en sepsis y shock séptico

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    La sepsis es una afecci√≥n potencialmente mortal causada por una respuesta anormal del hu√©sped a una infecci√≥n, produciendo respuestas fisiol√≥gicas alteradas que da√Īan los propios tejidos del paciente y pueden provocar disfunci√≥n org√°nica e incluso la muerte. Asimismo, algunos pacientes s√©pticos progresan a shock s√©ptico, caracterizado por alteraciones circulatorias, celulares y metab√≥licas sustanciales que aumentan el riesgo de mortalidad. A pesar de que la sepsis se caracteriza por un mal funcionamiento del sistema inmunol√≥gico, lo que a su vez conduce a una respuesta inmune alterada e inmunosupresi√≥n, la alta complejidad de la fisiopatolog√≠a de la sepsis requiere una mayor investigaci√≥n para comprender las respuestas inmunes que ocurren durante la sepsis. Asimismo, las histonas extracelulares circulantes han ganado relevancia como mediadores citot√≥xicos en la sepsis, ya que act√ļan como patrones moleculares asociados a da√Īo, que inducen estr√©s oxidativo y activan el inflamasoma NLRP3. Estos mecanismos median la activaci√≥n de la piroptosis, un mecanismo de muerte celular programada que produce inflamaci√≥n mediante la expresi√≥n de IL-18, IL-1ő≤ and IL-1őĪ. Sin embargo, a pesar de la evidencia de activaci√≥n del inflamasoma en las c√©lulas inmunes durante la sepsis, se desconoce si las histonas extracelulares son capaces de activar los inflamasomas endoteliales y sus consecuencias. En este trabajo destacamos el papel previamente desconocido de las histonas extracelulares, mediando la activaci√≥n del inflamasoma NLRP3 y la piroptosis en las c√©lulas endoteliales, contribuyendo a la disfunci√≥n endotelial y la desregulaci√≥n de la respuesta inmune mediada por el endotelio. Asimismo, tambi√©n demostramos c√≥mo la acetilaci√≥n de histonas disminuye la activaci√≥n de la piroptosis. Adem√°s, demostramos que la piroptosis se produce en pacientes con shock s√©ptico y los niveles de histonas circulantes se correlacionan con la expresi√≥n de citoquinas proinflamatorias y citoquinas piropt√≥ticas, la liberaci√≥n de factores de adhesi√≥n endotelial y la gravedad de la enfermedad. Proponemos la piroptosis mediada por histonas como un nuevo objetivo para desarrollar intervenciones cl√≠nicas. De manera similar, hemos analizado las respuestas inmunorelacionadas que ocurren durante las primeras etapas de la sepsis con el objetivo de proporcionar nuevos datos comparando las cantidades de citoquinas, inmunomoduladores y otros mediadores endoteliales en pacientes cr√≠ticamente enfermos no s√©pticos, s√©pticos y de shock s√©ptico. Nuestro enfoque ayudar√° a caracterizar r√°pidamente las respuestas inmunes alteradas en pacientes s√©pticos y de shock s√©ptico ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos. Finalmente analizamos el papel de la metilaci√≥n del ADN en el control del sistema inmune s√©ptico. Nuestros resultados demostraron el papel central de la metilaci√≥n del ADN modulando la respuesta molecular en los pacientes de shock s√©ptico y contribuyendo a la inmunosupresi√≥n, a trav√©s de la alteraci√≥n de los patrones de metilaci√≥n de los promotores de IL-10 y TREM-2.Sepsis is a life-threatening condition caused by an abnormal host response to an infection that produce altered physiological responses which damages own tissues of the patient and can result in organ dysfunction and in some cases death. Likewise, a subset of septic patients progresses to septic shock, characterized by substantial circulatory, cellular and metabolic abnormalities, which substantially increase the risk of mortality. Sepsis is characterized by a malfunction of the immune system and it can lead to an altered immune response and immunosuppression. Moreover, the high complexity of the pathophysiology of sepsis requires of further investigation to characterize the immune responses in sepsis and septic shock. Likewise, circulating extracellular histones have gained relevance as cytotoxic mediators in sepsis pathophysiology, since they act as damage-associated molecular patterns, which induce oxidative stress and activate NLRP3 inflammasome. Subsequently, inflammasome mediates pyroptosis activation, a programmed cell death mechanism that produces inflammation through the release of IL-18, IL-1ő≤ and IL-1őĪ. However, despite inflammasome activation may occur in immune cells during sepsis, it is unknown if this process also takes place in endothelial cells and particularly whether extracellular histones are capable of activating endothelial inflammasomes and their consequences. In this work we highlight a previously unknown role for extracellular histones, that mediates the activation of NLRP3 inflammasome and pyroptosis in endothelial cells by contributing to endothelial dysfunction and the dysregulation of the immune response mediated by endothelium. Likewise, we demonstrated how histone acetylation decreases pyroptosis activation. Furthermore, we show how pyroptosis occurs in septic shock patients and how circulating histone levels correlate with the expression of pro-inflammatory and pyroptotic cytokines, the release of endothelial adhesion factors and septic shock severity. We propose histone-mediated pyroptosis as a new target to develop clinical interventions. Similarly, we have analyzed the immune-related responses occurring during the early stages of sepsis with the aim of providing new data by comparing the amounts of cytokines, immune modulators and other endothelial mediators in critically-ill non-septic patients, septic and septic shock patients. Our approach will help to rapidly characterize the altered immune responses in septic and septic shock patients admitted in the Intensive Care Unit. Finally, we also analyzed the role of DNA methylation in the control of septic immune system. Our results demonstrated the central role of DNA methylation modulating the molecular response in septic shock patients and contributing to immunosuppression, through the alteration of DNA methylation patterns of IL-10 and TREM2 promoters

    Pol√≠tica fiscal y monetaria conjunta en tiempos de emergencia. El Programa Reactiva Per√ļ: Dise√Īo, implementaci√≥n y resultados

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    El presente documento expone mi experiencia laboral como Director de Sistema Financiero y Mercado de Capitales1 del Ministerio de Econom√≠a y Finanzas (MEF), encargado, entre otras funciones, del dise√Īo, coordinaci√≥n, e implementaci√≥n de pol√≠ticas e instrumentos para el desarrollo del mercado financiero local. Espec√≠ficamente, la experiencia laboral expuesta trata acerca de la creaci√≥n del Programa Reactiva Per√ļ. En general, la importancia del dise√Īo e implementaci√≥n de pol√≠ticas p√ļblicas radica en la capacidad de estas para atender de manera eficiente las necesidades de la poblaci√≥n ante un problema identificado. En ese sentido, el Programa Reactiva Per√ļ se constituy√≥ como una respuesta de pol√≠tica fiscal y monetaria conjunta que evit√≥ el colapso de la cadena de pagos de la econom√≠a nacional y la estabilidad del sistema financiero. De esta manera, mi trabajo como Director en el MEF, se centr√≥ en el proceso de dise√Īo, implementaci√≥n y monitoreo de los resultados del Programa Reactiva Per√ļ

    Dise√Īo conceptual de un modelo de negocio que facilite la gesti√≥n de la infraestructura hospitalaria en IPS peque√Īas y medianas en Colombia

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    Esta investigaci√≥n busca definir conceptualmente un modelo de negocio que facilite la gesti√≥n de la infraestructura hospitalaria a las IPS peque√Īas y medianas en Colombia, a trav√©s de la aplicaci√≥n de un modelo cualitativo que incluye el an√°lisis y uso de las herramientas Value Proposition Canvas y Businnes Model Canvas. Esto con el fin de estructurar el modelo de negocio como proyecto de emprendimiento personal, incorporando un an√°lisis del entorno con PESTEL y Cinco Fuerzas de Porter como parte integral del perfilamiento del cliente y la propuesta de valor. Este emprendimiento surge de la experiencia profesional de la autora de este documento en diferentes empresas del sector salud en las que ha tenido la oportunidad de evidenciar las dificultades de los administradores para gestionar adecuadamente los recursos destinados al mantenimiento de sus infraestructuras y lo que representa para la continuidad del negocio dar cumplimiento al marco legal aplicable, situaci√≥n que se valid√≥ a trav√©s de informantes clave y protagonistas que participaron en esta investigaci√≥n.This research seeks to conceptually define a business model that facilitates the management of hospital infrastructure for small and medium IPS in Colombia, through the application of a qualitative model that includes the analysis and use of the Value Proposition Canvas and Business Model tools. Canvas, to structure the business model as a personal entrepreneurship project, incorporating an analysis of the environment with PESTEL and Five Forces of Porter as an integral part of the profiling of the client and the value proposition. This undertaking arises from my professional experience in different companies in the health sector in which I have had the opportunity to demonstrate the difficulties of administrators to adequately manage the resources allocated to the maintenance of their infrastructures and what it represents for the continuity of the business to comply with the applicable legal framework, a situation that was validated through key informants and protagonists who participated in this researc

    Genome-wide identification of the genetic basis of amyotrophic lateral sclerosis

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    Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a complex disease that leads to motor neuron death. Despite heritability estimates of 52%, genome-wide association studies (GWASs) have discovered relatively few loci. We developed a machine learning approach called RefMap, which integrates functional genomics with GWAS summary statistics for gene discovery. With transcriptomic and epigenetic profiling of motor neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), RefMap identified 690 ALS-associated genes that represent a 5-fold increase in recovered heritability. Extensive conservation, transcriptome, network, and rare variant analyses demonstrated the functional significance of candidate genes in healthy and diseased motor neurons and brain tissues. Genetic convergence between common and rare variation highlighted KANK1 as a new ALS gene. Reproducing KANK1 patient mutations in human neurons led to neurotoxicity and demonstrated that TDP-43 mislocalization, a hallmark pathology of ALS, is downstream of axonal dysfunction. RefMap can be readily applied to other complex diseases

    Investigating the potential role for RBMY in cancer

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    Introduction: Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), is a major healthcare concern with a high male prevalence. We hypothesise that the testis specific mRNA splicing regulator, Y-linked RBMY gene, is aberrantly expressed in HNSCC in part promoting HNSCC through ZFY-short splicing. RBMY has been shown to enhance tumour development in male hepatocellular carcinoma (human tissue specimens and transgenic-mouse models) whilst ZFY-short is predicted to have anti-apoptotic properties and the deletion of RBMY locus on Y-chromosome resulted in lowered ZFY-short expression. Thus, we hypothesize that ZFY-short is generated by RBMY and exerts its anti-apoptotic effects to promote male HNSCC. Methods: Due to the coronavirus lockdown, bench work was restricted to 6 months, therefore, I conducted an extended analysis of RBMY expression in human cancer, including a computational analysis of RBMY gene expression with data from the cBioPortal database. In my bench-work, I attempted to establish GFP- RBMY expressing cell lines and conducted fluorescence microscopy, RT- PCR and qPCR to analyse RBMY expression in HNSCC cell lines and its impact on ZFY-short expression. Results: RBMY is expressed in several cancers, with no driver mutations. RBMY has nuclear localisation and is expressed in 93-UV-147T and UM-SCC-104 cell lines (both HPV16-positive HNSCC cell lines), with increased ZFY-short expression observed in UM- SCC-104. Discussion: Despite RBMY having been shown to be an oncogene in male liver cancer, our analysis of cBioPortal data suggests this activity may be restricted to the small minority of tumours of different cancer types that express RBMY. The paralleled expression of RBMY and ZFY-short in our cell lines indicate an association. UMSCC104 cell line originates from a highly an aggressive and recurrent tumour, RBMY is associated with tumour stemness, thus it is possible that via ZFY-short, RBMY could have promoted the aggressive phenotype in this, and in other HNSCCs

    Elasticidad de membrana plasmática de levaduras mediante estudios de retracción de Nanotubo

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    27 h. figuras; tabls.; ilus. Abstract en espa√Īol e ingl√©s. Contiene Referencia Bibliogr√°fica.Las membranas biol√≥gicas constituyen la estructura celular m√°s com√ļn en la materia viva, pudiendo ser consideradas como un ejemplo de alta tecnolog√≠a natural de microencapsulaci√≥n. Las membranas se comportan como barreras mec√°nicas semipermeables, regulando el tr√°nsito y la se√Īalizaci√≥n de los compartimentos celulares con el exterior. A su vez, son extremadamente din√°micas tanto de manera global como a peque√Īa escala espacial. Las interacciones de los l√≠pidos entre s√≠ y con otras mol√©culas presentes en las membranas (principalmente prote√≠nas) son determinantes para muchas funciones, como la se√Īalizaci√≥n, los procesos de fusi√≥n y fisi√≥n o la adhesi√≥n celular. La forma f√≠sica de una estructura membranosa est√° determinada b√°sicamente por su grado de curvatura intr√≠nseca. De igual manera, esta propiedad evidencia la tendencia que tienen los l√≠pidos a formar fases no lamelares. La disposici√≥n de los l√≠pidos en la bicapa est√° directamente relacionada con su forma intr√≠nseca o geom√©trica, que tambi√©n condiciona el modo en que estas mol√©culas se empaquetan e interaccionan entre s√≠. En este trabajo de tesina se puso foco en la capacidad que tiene la membrana plasm√°tica de cambiar localmente su curvatura. Para realizar estos estudios, deformamos la membrana plasm√°tica localmente, generando tubos de membrana de di√°metro nanom√©trico mediante el empleo de pinzas √≥pticas. El trabajo se realiz√≥ sobre membranas de levaduras Saccharomyces cerevisiae de la cepa BY4741. Estudios previos han demostrado que cuando una bicapa lip√≠dica es sometida a un cambio local de curvatura presenta un comportamiento el√°stico, mientras que las membranas celulares de mam√≠feros son marcadamente viscoel√°sticas. Por otro lado, no se han reportado estudios de deformaciones locales de curvatura en membranas de organismos de otros reinos, que no contienen colesterol sino otros esteroles u hopanoides. Mediante estos experimentos se pretendi√≥ poner a punto la metodolog√≠a a fin de estudiar c√≥mo es la energ√©tica de deformaci√≥n fuera del plano de membrana plasm√°tica de levaduras S. cerevisiae cepa BY4741, la cual contiene un alto porcentaje del esterol ergosterol, en comparaci√≥n con el comportamiento ya conocido de membrana plasm√°tica de c√©lulas de mam√≠fero. En este trabajo se encontr√≥ que la relajaci√≥n de nanotubos de membranas plasm√°ticas de levaduras S. cerevisiae cepa BY4741 ocurre con tiempos caracter√≠sticos en el intervalo 0,02-0,5 s, y si promediamos todos los valores encontrados, obtenemos un valor promedio de 0,2 s ¬Ī 0,1 s. Este valor es similar a lo informado para eritrocitos, as√≠ como para c√©lulas tumorales cerebrales en humanos y c√©lulas de ovario de h√°mster chino. Hasta donde sabemos, no hay estudios de este tipo reportados en microorganismos eucariotas.Fil: Bischof, Andrea Alejandra. Universidad Nacional de C√≥rdoba. Facultad de Ciencias Exactas, F√≠sicas y Naturales; Argentina.Fil: Bischof, Andrea Alejandra. Universidad Nacional de C√≥rdoba. Facultad de Ciencias Qu√≠micas. Departamento de Qu√≠mica Biol√≥gica; Argentina.Fil: Bischof, Andrea Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro de Investigaciones en Qu√≠mica Biol√≥gica de C√≥rdoba; Argentina

    The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis

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    Bacillus thuringiensis, tambi√©n conocida como ‚ÄúBt‚ÄĚ, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteri√≥logo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como ‚ÄúSottokin- Bacillus‚ÄĚ (‚ÄúBacilo de muerte s√ļbita‚ÄĚ) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos a√Īos despu√©s, el bi√≥logo Ernst Berliner aisl√≥ B. thuringiensis de cris√°lidas de polilla mediterr√°nea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorg√°ndole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Adem√°s, Berliner describi√≥ la presencia de una especie de cristal dentro de la c√©lula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbi√≥logo Thomas A. Angus descubri√≥ que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulaci√≥n de Bt, eran responsables de su acci√≥n insecticida y las apod√≥ ‚Äúprote√≠nas Cry‚ÄĚ (del ingl√©s crystal). A parte de estas prote√≠nas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el a√Īo 1996 se descubri√≥ una nueva clase de prote√≠nas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en ingl√©s ‚ÄúProte√≠nas Vegetativas Insecticidas‚ÄĚ), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente t√≥xicas para lepid√≥pteros. Desde entonces, una amplia variedad de prote√≠nas de Bt t√≥xicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran n√ļmero de cepas aisladas, y han sido clasificadas en funci√≥n de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holot√≠picas de prote√≠nas Bt, y los principales √≥rdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a alg√ļn tipo de prote√≠na son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de prote√≠nas, las prote√≠nas Cry de tres dominios (‚Äú3D-Cry‚ÄĚ) ylas prote√≠nas Vip3 que afectan a lepid√≥pteros. El modo de acci√≥n de estas prote√≠nas, as√≠ como el ciclo de vida de Bt tras la infecci√≥n del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes p√°ginas. El primer paso supone la ingesti√≥n de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las prote√≠nas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilizaci√≥n es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las prote√≠nas Vip3, no precisan de este paso de solubilizaci√≥n, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteol√≠ticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritr√≥fica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya funci√≥n principal es la separaci√≥n entre el alimento y las c√©lulas epiteliales. Esta separaci√≥n impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y tambi√©n sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, v√≠rico o paras√≠tico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritr√≥fica puede verse comprometido por la acci√≥n de las quitinasas end√≥genas o ex√≥genas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritr√≥fica, se produce una interacci√≥n entre las prote√≠nas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las c√©lulas del intestino medio, consideradas como las c√©lulas diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigaci√≥n de Bt durante las √ļltimas d√©cadas ha sido identificar cu√°les son las mol√©culas que se unen de forma espec√≠fica con las toxinas Cry o Vip3, as√≠ como deducir la relevancia de la funci√≥n de esta interacci√≥n, tanto en el modo de acci√≥n de las toxinas como en los mecanismos de resistencia. Actualmente, existen tres tipos de prote√≠nas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las prote√≠nas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (‚ÄúAPN‚ÄĚ), las cadherinas y los transportadores ‚ÄúABC‚ÄĚ (del ingl√©s ‚ÄúATP-Binding Cassette‚ÄĚ). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (‚ÄúALP‚ÄĚ) tambi√©n fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicaci√≥n en la uni√≥n. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los √ļltimos a√Īos. Son prote√≠nas de membrana con capacidad para transportar distintas mol√©culas de forma activa gracias a la hidr√≥lisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador m√°s caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicaci√≥n como receptor de prote√≠nas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepid√≥pteros resistentes a prote√≠nas Bt. En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacci√≥n han demostrado que los sitios de uni√≥n no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores espec√≠ficos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la prote√≠na ribosomal S2 como el ‚Äúscavenger‚ÄĚ tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del g√©nero Spodoptera. Adem√°s, este √ļltimo se encuentra involucrado en la v√≠a endoc√≠tica, siendo capaz de mediar la internalizaci√≥n de la toxina. Existen numerosos estudios que han se√Īalado que la actividad t√≥xica de las prote√≠nas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las c√©lulas diana. Este modelo (conocido como modelo de formaci√≥n de poro) es actualmente el m√°s respaldado por la comunidad cient√≠fica debido al gran n√ļmero de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores espec√≠ficos, se forma una estructura oligom√©rica que se inserta en la membrana de las c√©lulas intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osm√≥tico que provoca un hinchamiento de las c√©lulas, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las c√©lulas intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no s√≥lo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino tambi√©n de todas aquellas bacterias oportunistas y otros pat√≥genos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por √ļltimo, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersi√≥n en el medio. Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansi√≥n de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializ√≥ en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresi√≥n de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hect√°reas de plantas de ma√≠z, algod√≥n o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el a√Īo 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extra√Īar que B. thuringiensis sea el agente microbiano m√°s utilizado entre las soluciones biotecnol√≥gicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos a√Īos en descifrar c√≥mo se comportan las prote√≠nas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, a√ļn queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acci√≥n de las prote√≠nas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cu√°les son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, d√≥nde se localizan y por qu√© se encuentran alterados. Adem√°s, gracias a este conocimiento podemos combinar prote√≠nas Bt con diferentes modos de acci√≥n con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones. En el primer y segundo cap√≠tulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias prote√≠nas Cry, as√≠ como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer c√≥mo las prote√≠nas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen prote√≠nas Cry1 son com√ļnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos cap√≠tulos, elegimos una aproximaci√≥n ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de c√©lulas de insecto o las preparaciones de ves√≠culas de membrana intestinales (‚ÄúBBMV‚ÄĚ, de sus siglas ingl√©s, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones espec√≠ficas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una l√≠nea de c√©lulas de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versi√≥n completa, denominada ‚ÄúSf21- FRA‚ÄĚ. Adem√°s, utilizamos prote√≠nas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de uni√≥n y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las prote√≠nas Cry1A unen de forma espec√≠fica y con alta afinidad a c√©lulas que expresan el transportador, y que la presencia de √©ste en c√©lulas es suficiente para causar toxicidad de las prote√≠nas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua act√ļa como receptor funcional de las prote√≠nas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A trav√©s de los dos cap√≠tulos, la falta de competencia de la prote√≠na Cry1C, as√≠ como la ausencia de toxicidad en c√©lulas HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta prote√≠na. Estos resultados indican que la prote√≠na Cry1C pueda poseer distintos sitios de uni√≥n en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga. Por otra parte, observamos un fen√≥meno ins√≥lito en los ensayos de uni√≥n con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, produc√≠a una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la uni√≥n total conseguida por la I125-Cry1Aa a las c√©lulas expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, √©ste compet√≠a de una forma habitual, exploramos por qu√© ocurr√≠a este comportamiento bif√°sico. Pudimos observar tambi√©n estimulaci√≥n causada a bajas concentraciones, e incluso m√°s acentuada, al utilizar las prote√≠nas Cry1Ab, Cry1Ac o la prote√≠na h√≠brida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las prote√≠nas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bif√°sico al utilizar la prote√≠na Cry1C o la prote√≠na h√≠brida H205 (con los mismos dominios I y II que la prote√≠nas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, com√ļn a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulaci√≥n de la uni√≥n. Curiosamente, tambi√©n pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho m√°s discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, as√≠ como autoradiograf√≠as de la misma. Tanto el tama√Īo molecular como la intensidad de la banda observada nos permiti√≥ determinar que la forma oligom√©rica de la prote√≠na es la responsable de la respuesta estimulatoria, se√Īalando este hecho la habilidad de las prote√≠nas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-olig√≥meros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustituci√≥n del amino√°cido Arg por Glu en la posici√≥n 99 del dominio I que impide la oligomerizaci√≥n. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a olig√≥mero en las autoradiograf√≠as al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las prote√≠nas en su versi√≥n no modificada, a trav√©s del dominio I, as√≠ como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2. Adem√°s, las toxicidades observadas con las prote√≠nas Cry1Ab y Cry1Ac en c√©lulas expresando el transportador, as√≠ como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer cap√≠tulo, nos permiten concluir que estas dos prote√≠nas comparten un sitio de uni√≥n, que tiene poca afinidad por la prote√≠na Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del h√≠brido H04, lo cual se√Īal√≥ al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la prote√≠na Cry1Aa parec√≠a tener un papel menos relevante en la uni√≥n a este sitio, pero a√ļn as√≠ es t√≥xica para c√©lulas expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el h√≠brido H205 como competidores. Pudimos concluir que la prote√≠na Cry1Aa debe de tener otro sitio de uni√≥n en el transportador, el cual tendr√≠a alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de uni√≥n, tambi√©n se podr√≠a unir la prote√≠na Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por √ļltimo, a trav√©s de distintas combinaciones de prote√≠nas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-olig√≥meros que de homo-olig√≥meros no s√≥lo tambi√©n se trasladaba a mayores tasas de uni√≥n, sino a mayor toxicidad sobre las c√©lulas. En resumen, el primer cap√≠tulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las prote√≠nas Cry1A y el segundo cap√≠tulo demuestra la habilidad de formar hetero-olig√≥meros por las prote√≠nas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador. Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepid√≥pteros juega un rol relevante en la uni√≥n y toxicidad de al menos las prote√≠nas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con prote√≠nas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito m√°s de 400 transportadores ABC en artr√≥podos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y prote√≠nas insecticidas es un gran reto en la investigaci√≥n con Bt. A parte del ABCC2, s√≥lo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con prote√≠nas Bt, como el ABCB1 del cole√≥ptero Chrysomela tremulae, receptor de la prote√≠na Cry3Aa, el ABCA2 de los lepid√≥pteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las prote√≠nas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acci√≥n de la prote√≠na Cry1Ac. Curiosamente, ning√ļn otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacion√≥ por primera vez un transportador ABC con las prote√≠nas de Bt, hace ya m√°s de una d√©cada. En el tercer cap√≠tulo de la tesis, hemos realizado una b√ļsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El an√°lisis filogen√©tico ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una prote√≠na m√°s distante atendiendo a su secuencia de amino√°cidos. Seg√ļn los modelos de predicci√≥n, ambos transportadores estar√≠an formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para prote√≠nas Bt desarrollando mutantes de deleci√≥n para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la t√©cnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener l√≠neas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducci√≥n en la toxicidad para ninguna l√≠nea mutante, en comparaci√≥n con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, s√≠ se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentraci√≥n m√°s baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la l√≠nea de mutantes con deleci√≥n en el ABCC3, aunque el grado de significaci√≥n debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo n√ļmero de r√©plicas en los bioensayos. Adem√°s, falta por confirmar la correcta deleci√≥n de los transportadores en ambas l√≠neas de mutantes mediante la secuenciaci√≥n del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN gu√≠as utilizados se dise√Īaron en el primer ex√≥n de cada gen, podr√≠an haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se est√©n expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicaci√≥n de los nuevos transportadores ABC con prote√≠nas Bt tendr√° que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acci√≥n de las prote√≠nas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar l√≠neas de mutantes con deleci√≥n del ABCC2 o dobles mutantes con deleci√≥n del ABCC2 y ABCC3, as√≠ como la evaluaci√≥n, mediante ensayos con prote√≠nas marcadas, de las capacidades de uni√≥n sobre las l√≠neas de los mutantes. Por √ļltimo, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, a√ļn queda un gran n√ļmero de transportadores ABC por describir en H. virescens. Adem√°s de estudiar la interacci√≥n entre receptores putativos y prote√≠nas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender c√≥mo y por qu√© ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a prote√≠nas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Est√° ampliamente aceptado que la alteraci√≥n de uni√≥n al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a prote√≠nas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de uni√≥n pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducci√≥n en la expresi√≥n de un gen que codifique para una prote√≠na de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoac√≠dicas que impidan la interacci√≥n entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A d√≠a de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones ‚Äúwild-type‚ÄĚ de transportadores ABC usando diferentes t√©cnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleci√≥n mediante CRISPR, o expresi√≥n en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Adem√°s, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las prote√≠nas Cry. En el cuarto cap√≠tulo, caracterizamos la funcionalidad de una versi√≥n alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleci√≥n en el segundo dominio de uni√≥n a nucle√≥tidos (‚ÄúNBD2‚ÄĚ) que fue gen√©ticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutaci√≥n es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una l√≠nea celular de insecto que expresa la versi√≥n truncada del transportador denominada Sf21-XenR, as√≠ como la l√≠nea celular utilizada en los dos primeros cap√≠tulos que expresa la versi√≥n original del ABCC2 (Sf21-FRA). A trav√©s del estudio de la secuencia de amino√°cidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustituci√≥n,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular n√ļmero 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoqu√≠mica mostraron la expresi√≥n del transportador truncado y su localizaci√≥n en la membrana de las c√©lulas Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las prote√≠nas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en c√©lulas Sf21-XenR como en c√©lulas Sf21 no transformadas como control. Las tres prote√≠nas ensayadas fueron t√≥xicas contra c√©lulas con expresi√≥n del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en c√©lulas que expresan el transportador en su versi√≥n original (Cap√≠tulo 1). Adem√°s, los ensayos de uni√≥n con Cry1Ac marcada con I125 revelaron uni√≥n espec√≠fica al transportador truncado, as√≠ como un valor similar en la constante de
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