MDM2 (Murine Double Minute 2 homolog) bindet und inhibiert den Vitamin D Rezeptor

Vitamin D kann entweder durch die Nahrung aufgenommen oder durch UV- Bestrahlung der Haut aus 7-Dehydrocholesterol gebildet werden. Das entstehende inaktive Vitamin D3 wird anschließend durch die 25-Hydroxylase (CYP2R1) in der Leber zu 25-Hydroxyvitamin D3 (25D) metabolisiert. 25D ist die vornehmlich zirkulierende Form von Vitamin D, es selbst besitzt allerdings nur etwa ein Tausendstel der Aktivität der endgültigen, aktiven Form des Hormons, 1α,25- Hydroxyvitamin D3 (1,25D), das überwiegend in der Niere durch die mitochondriale Hydroxylase CYP27B1 produziert und im Plasma durch Interaktion mit DBP (plasma vitamin D binding protein) stabilisiert und transportiert wird. Die Hauptfunktion von 1,25D besteht offenbar in der Bindung an das intrazelluläre Protein Vitamin D Rezeptor (VDR), welches daraufhin typischerweise mit einem zweiten Protein, dem Retinoid X Rezeptor, heterodimersisiert und dann gemeinsam mit diesem an sogenannte Vitamin D response elements (VDREs) in der DNA bindet. Die weiteren Konsequenzen dieser Bindung sind nicht in allen Einzelheiten verstanden, führen aber entweder zur transkriptionellen Aktivierung oder Reprimierung einer großen Anzahl von Gensequenzen. Die E3 Ubiquitin-Ligase und Transkriptionsrepressor MDM2 ist ein potenter Inhibitor der p53 Familie von Transkriptionsfaktoren, Stoffwechselregulatoren und Tumorsuppressoren. Es konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der VDR ein weiterer Transkriptionsfaktor, Stoffwechselregulator und Tumorsuppressor ist, welcher ebenfalls von MDM2 gebunden und inhibiert wird. Es stellte sich heraus, dass der VDR in der Zelle zum Teil durch MDM2 ubiquityliert wird, seine Steady-State Level durch das Proteasom kontrolliert werden und ein Knockdown von endogenem MDM2 die VDR-Level erhöht. Ein Knockdown von MDM2 führte zu einer signifikanten Erhöhung des Transkripts der Gene CYP24A1 und p21, klassische zelluläre Ziele der Transaktivierung durch ligandengebundenen VDR. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass MDM2 analog zu p53 den VDR negativ reguliert

MDM2 (Murine Double Minute 2 homolog) bindet und inhibiert den Vitamin D Rezeptor

Vitamin D kann entweder durch die Nahrung aufgenommen oder durch UV- Bestrahlung der Haut aus 7-Dehydrocholesterol gebildet werden. Das entstehende inaktive Vitamin D3 wird anschließend durch die 25-Hydroxylase (CYP2R1) in der Leber zu 25-Hydroxyvitamin D3 (25D) metabolisiert. 25D ist die vornehmlich zirkulierende Form von Vitamin D, es selbst besitzt allerdings nur etwa ein Tausendstel der Aktivität der endgültigen, aktiven Form des Hormons, 1α,25- Hydroxyvitamin D3 (1,25D), das überwiegend in der Niere durch die mitochondriale Hydroxylase CYP27B1 produziert und im Plasma durch Interaktion mit DBP (plasma vitamin D binding protein) stabilisiert und transportiert wird. Die Hauptfunktion von 1,25D besteht offenbar in der Bindung an das intrazelluläre Protein Vitamin D Rezeptor (VDR), welches daraufhin typischerweise mit einem zweiten Protein, dem Retinoid X Rezeptor, heterodimersisiert und dann gemeinsam mit diesem an sogenannte Vitamin D response elements (VDREs) in der DNA bindet. Die weiteren Konsequenzen dieser Bindung sind nicht in allen Einzelheiten verstanden, führen aber entweder zur transkriptionellen Aktivierung oder Reprimierung einer großen Anzahl von Gensequenzen. Die E3 Ubiquitin-Ligase und Transkriptionsrepressor MDM2 ist ein potenter Inhibitor der p53 Familie von Transkriptionsfaktoren, Stoffwechselregulatoren und Tumorsuppressoren. Es konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der VDR ein weiterer Transkriptionsfaktor, Stoffwechselregulator und Tumorsuppressor ist, welcher ebenfalls von MDM2 gebunden und inhibiert wird. Es stellte sich heraus, dass der VDR in der Zelle zum Teil durch MDM2 ubiquityliert wird, seine Steady-State Level durch das Proteasom kontrolliert werden und ein Knockdown von endogenem MDM2 die VDR-Level erhöht. Ein Knockdown von MDM2 führte zu einer signifikanten Erhöhung des Transkripts der Gene CYP24A1 und p21, klassische zelluläre Ziele der Transaktivierung durch ligandengebundenen VDR. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass MDM2 analog zu p53 den VDR negativ reguliert

Untersuchungen zur Assoziation von Polymorphismen in regulatorischen Elementen der Lipoproteinlipase und des Apolipoprotein E mit KHK und Triglyzerid-Stoffwechsel

Durch Atherosklerose bedingte Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die Haupttodesursache in der westlichen Welt. Neben der familiären Disposition, dem Geschlecht und dem Lebensalter gibt es zahlreiche beeinflussbare Risikofaktoren für diese Erkrankungen. Zusätzlich zum Nikotin-Konsum, der arteriellen Hypertonie und dem Diabetes mellitus Typ II spielen dabei vor allem die Lipidparameter wie der Cholesterin- und der Triglyzerid-Spiegel eine entscheidende Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, genregulatorische Elemente der Lipoproteinlipase und des Apolipoprotein E, die beide eine entscheidende Rolle bei der Hydrolyse von Triglyzeriden spielen, auf Mutationen zu untersuchen, die die Expression dieser Proteine verändern und somit Einfluss auf den Triglyzerid-Spiegel ausüben. Apolipoprotein E vermittelt die Bindung von Triglyzerid-reichen Lipoproteinen an den VLDL-Rezeptor, die Lipoproteinlipase senkt durch Hydrolyse von Triglyzeriden den Triglyzerid-Spiegel im Blut und erhöht gleichzeitig durch Unterstützung der Übertragung von diversen Lipiden den HDL-Cholesterin-Spiegel. Beide Effekte sind verantwortlich für die insgesamt eher atheroprotektive Wirkung der Lipoproteinlipase im Gefäßbett. In atherosklerotischen Plaques dagegen entwickelt die LPL atherogene Wirkung, durch Erhöhung der RLP-Konzentration werden die Endothel-Eigenschaften verändert und LDL- und VLDL-Partikel werden in der subendothelialen Matrix der Plaques zurückgehalten, wo sie entscheidend zur Entwicklung der Atherosklerose beitragen. Die Expression der LPL wird durch ihren Promotor gesteuert, die Expression des Apolipoprotein E in der Leber wird durch die Hepatic Control Regions (HCR) 1 und 2 kontrolliert, in reifen Makrophagen und Adipozyten durch die Multienhancer (ME) 1 und 2. Wir untersuchten diese Sequenzen in der DNA von 264 Patienten mit einem BMI < 25 kg/m2 des Kollektivs der Marburger KHK-Präventions-Allianz, 134 Patienten hatten erhöhte Triglyzeride (> 150 mg/dl), 130 hatten normale Triglyzeride (< 150 mg/dl). Die Sequenzen wurden zunächst durch eine PCR amplifiziert und anschließend in der DGGE auf Mutationen gescreent, auffällige Proben sowie unauffällige Proben als Kontrolle wurden sequenziert. Aus den Daten der Marburger KHK-Präventions-Allianz entnahmen wir die Lipidprofile, den BMI sowie den Koronarstatus und einige weitere Risikofaktoren der Patienten und werteten sie statistisch auf Unterschiede zwischen Mutations- und Wildtyp-Allelträgern aus. In den regulatorischen Elementen des Apolipoprotein E konnten wir keine Mutationen nachweisen, diese Sequenzen scheinen stark konserviert zu sein, auch in der Literatur werden keine funktionell relevanten SNPs beschrieben. Im Promotor der LPL fanden wir 2 bereits in der Literatur vorbeschriebene SNPs, -93T/G und -95G/T. -95G/T hatte in der Literatur bei In-vitro-Untersuchungen keine Auswirkungen auf die Aktivität des LPL-Promotors, über die Auswirkungen in-vivo gibt es keine Berichte. Bei unseren insgesamt 6 Patienten, die diesen SNP vorwiesen, war das Allel -95T assoziiert mit erniedrigten Triglyzeriden und einem leicht erhöhten HDL-Cholesterin (n.s.), beides Hinweise auf eine erhöhte Promotor-Aktivität, kein Unterschied konnte beobachtete werden bezüglich der KHK-Prävalenz. Über -93T/G gibt es in der Literatur widersprüchliche Aussagen, sowohl eine erhöhte als auch eine erniedrigte Promotor-Aktivität sind beschrieben. In unserem Kollektiv konnten wir diesen SNP 8 mal nachweisen, 6x bei Patienten mit Triglyzeriden > 150 mg/dl, 2 mal bei Patienten mit Triglyzeriden < 150 mg/dl. Tendenziell haben unsere Patienten mit -93G-Allel erhöhte Triglyzeride, so wie es auch in einigen Studien beschrieben wurde, das erhöhte KHK-Risiko sowie das erniedrigte HDL-Cholesterin konnten wir bei unseren Patienten nicht nachweisen, genauso wenig wie eine Prädisposition für einen höheren BMI. Obwohl in den letzten Jahren intensiv über die Bedeutung des Apolipoprotein E und der Lipoproteinlipase für den Triglyzerid-Stoffwechsel und das KHK-Risiko geforscht wurde, bleiben immer noch viele Fragen offen, die es in weiteren Studien und Funktionsuntersuchungen zu klären gilt

Funktionelle neuroanatomische Analyse eines nahrungsabhängigen Schaltkreises in <em>Drosophila melanogaster</em>

Eine weltweit zunehmende Fehlernährung und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes haben die Aufklärung neuropeptiderger Systeme vorangetrieben, die an einer Regulation der Nahrungsaufnahme beteiligt sind. Das zentrale Nervensystem übernimmt eine übergeordnete Rolle bei der Koordination dieser Systeme. In Drosophila melanogaster wurde eine Gruppe von 20 Neuronen identifiziert, die an der Steuerung des Fressverhaltens beteiligt sind. Diese Neurone exprimieren hugin, das für zwei Neuropeptide, Hugin und Pyrokinin-2, kodiert. Aus In vitro Untersuchungen war bekannt, dass beide Neuropeptide zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, CG8795 und CG8784, aktivieren. Die Analyse der potentiellen Hugin-Rezeptoren ermöglichte im Verlauf dieser Arbeit eine Aufklärung der Morphologie und der nahrungsabhängigen Funktion des Hugin-Schaltkreises. Die bisher unbekannten Expressionsmuster von CG8795 und CG8784 konnten in Drosophila-Larven durch die Erzeugung transgener Fliegen visualisiert werden. CG8795 wurde in einer Subpopulation der Hugin-Neurone exprimiert, woraus eine autokrine Funktion von Hugin gefolgert wurde. In vivo Aufnahmen zeigten eine Expression von CG8784 in sensorischen Rezeptorneuronen der Geschmacksorgane. Gustatorische Informationen werden im Suboesophagialganglion, einem Areal des Gehirns, prozessiert. Mit Hilfe der GRASP-Methode (GFP reconstitution across synaptic partners) konnte eine Kontaktaufnahme gustatorischer Rezeptorneurone mit den Hugin-Neuronen nachgewiesen werden. Für Pyrokinin-2 war eine muskelstimulatorische Funktion bekannt und ausgehend vom ventralen Nervensystem war die Verbindung der CG8784-Neurone mit Muskeln des Hautmuskelschlauchs erkennbar. Durch die optogenetische Untersuchung der neuronalen Aktivität im ventralen Nervensystem konnte eine CG8784-vermittelte modulatorische Funktion von Hugin auf die larvale Fortbewegung angenommen werden. Neuronale Projektionen einer Subpopulation der Hugin-Neurone führen in den übergeordneten Hirnbereich, das Protocerebrum. Entlang dieser Projektionsbahnen wurde ein direkter Kontakt mit neurosekretorischen Zellen nachgewiesen, die eine Expression von CG8784 zeigten und als Insulin-produzierende Zellen identifiziert wurden. Nach der Aufnahme proteinreicher Nahrung wird aus diesen Zellen das Insulin-Homolog Drosophila Insulin-like peptide Dilp2 freigesetzt, was eine erhöhte systemische Insulin-Signalkaskade zur Folge hat. Unter Hungerbedingungen wird Dilp2 im Wildtyp zurückgehalten. Durch die lokale Überexpression von CG8784 in den Insulin-produzierenden Zellen konnte in dieser Arbeit eine erhöhte Freisetzung von Dilp2 induziert werden. Mittels einer Deletion der genregulatorischen Region wurde eine Nullmutante von CG8784 erzeugt, die eine weiterführende funktionelle Untersuchung des potentiellen Hugin-Rezeptors ermöglicht. Aus den vorliegenden Analysen konnte eine nahrungsabhängige, regulatorische Funktion der Hugin-Signalkaskade auf die Energiehomöostase abgeleitet werden

Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in Hautkeratinozyten nach mikrobiellem Kontakt

Trotz mikrobieller Besiedlung kommt es relativ selten zu Infektionen der Haut. Einen wichtigen Grund dieser natürlichen Resistenz stellen durch Mikroorganismen induzierbare antimikrobielle Proteine wie hBD-2 dar. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Haut in der Lage ist, zwischen verschiedenen Mikroorganismen zu differenzieren. Dazu wurde die differentielle Genexpression in Keratinozyten nach Kontakt mit verschiedenen mikrobiellen Stimuli analysiert. Mithilfe der Systematischen Differential Display-PCR wurde IFIT4 als ein Gen identifiziert, welches in Keratinozyten v.a. durch P.aeruginosa-Überstände induzierbar ist, während S.aureus- und C.albicans-Überstände IFIT4 nicht induzieren. Anhand von Microarray-Analysen und der Suppressiven Subtraktiven Hybridisierung wurde der Einfluss hBD-2-induzierender und hBD-2-inhibierender P.aeruginosa-Kulturüberstände auf die Keratinozytengenexpression untersucht. Während hBD-2-induzierende Überstände vornehmlich antimikrobielle Proteine induzieren, induzieren hBD-2-inhibierende Überstände auch Gene der adaptiven Immunabwehr. Letzteres ist als Schutz vor Infektionen trotz eingeschränkter angeborener Immunabwehr zu werten