The Arabidopsis leucine-rich repeat receptor kinase MIK2/LRR-KISS connects cell wall integrity sensing, root growth and response to abiotic and biotic stresses

Plants actively perceive and respond to perturbations in their cell walls which arise during growth, biotic and abiotic stresses. However, few components involved in plant cell wall integrity sensing have been described to date. Using a reverse-genetic approach, we identified the Arabidopsis thaliana leucine-rich repeat receptor kinase MIK2 as an important regulator of cell wall damage responses triggered upon cellulose biosynthesis inhibition. Indeed, loss-of-function mik2 alleles are strongly affected in immune marker gene expression, jasmonic acid production and lignin deposition. MIK2 has both overlapping and distinct functions with THE1, a malectin-like receptor kinase previously proposed as cell wall integrity sensor. In addition, mik2 mutant plants exhibit enhanced leftward root skewing when grown on vertical plates. Notably, natural variation in MIK2 (also named LRR-KISS) has been correlated recently to mild salt stress tolerance, which we could confirm using our insertional alleles. Strikingly, both the increased root skewing and salt stress sensitivity phenotypes observed in the mik2 mutant are dependent on THE1. Finally, we found that MIK2 is required for resistance to the fungal root pathogen Fusarium oxysporum. Together, our data identify MIK2 as a novel component in cell wall integrity sensing and suggest that MIK2 is a nexus linking cell wall integrity sensing to growth and environmental cues

Etude de la protéine KORRIGAN, une endo-b-1,4-glucanase impliquée dans la synthèse de cellulose chez Arabidopsis thaliana et Gossypium hirsutum

Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant la synthèse de cellulose chez les végétaux, je me suis intéressée à la protéine KORRIGAN1, une endo- -1,4-glucanase. La première partie de ma thèse a été consacrée à l étude de KOR1 au sein d un complexe multiprotéique membranaire chez Arabidopsis et le cotonnier. La mise en évidence d une différence de taille de ce complexe en fonction du niveau de synthèse de la cellulose laisse supposer un lien étroit entre la formation de ce complexe et la fonction de KOR. Différents partenaires potentiels de KOR1 au sein de ce complexe ont été identifiés, révélant de potentielles interactions entre KOR1 et le cytosquelette. Le rôle de KOR1 a aussi été abordé, et notamment son implication dans le recyclage d amorces lipidiques. Cette fonction hypothétique appuyée par des résultats obtenus chez le cotonnier, n a pas été confortée par études réalisées chez Arabidopsis. Je me suis enfin intéressée à la localisation subcellulaire de KOR1. KOR1 est localisée dans des compartiments intracellulaires, distincts de l appareil de Golgi, et qui colocalisent partiellement avec les endosomes précoces. Ces compartiments sont mobiles et cette motilité dépend d un réseau de microtubules intact mettant à nouveau en évidence un lien entre KOR1 et les éléments du cytosquelette. Lorsque la synthèse de cellulose est inhibée par de l isoxabène, les compartiments contenant KOR1 sont plus près de la membrane plasmique et distincts des endosomes précoces. Ceci suggère donc que la synthèse de cellulose est fortement contrôlée, notamment à travers la régulation de la localisation et des interactions des protéines enzymatiques y participant.In order to better understand the molecular mechanisms that govern cellulose synthesis, KORRIGAN1, an endo- -1,4-glucanase involved in this process, has been studied. In the first part of my thesis, KOR1 was shown to be present in high molecular weight complexes in Arabidopsis thaliana and cotton fibers. The weight of this complex changes in function of the level of cellulose synthesis, demonstrating that cellulose synthesis and KOR1 function are linked. Different putative protein partners have been identified which suggest a close interaction between KOR1 and the cytoskeleton. It has been suggested that KOR1 may recycle sitosterol primers involved in the initiation of celullose synthesis in cotton fibers. In the second part of my thesis, I tested this hypothesis and the results obtained suggest that this hypothetic function is not real.Finally, I focussed on the subcellular localization of KOR1. Using a variety of methods, we showed that KOR1 was present in intracellular compartments, distinct from the Golgi apparatus and showing some colocalization with endosomal compartments. These compartments were very motile in a microtubules integrity dependent manner, linking KOR1 to the cytoskeleton again. When cellulose synthesis was inhibited, the KOR1 compartments were closer to the plasma membrane and distinct from the endosomal compartments. These results suggest that cellulose synthesis is highly regulated through the control of the localisation and interaction of the enzymes involved in this process.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Biosynthesis of cellulose

Volume 2 - Section II - Chapitre 2.22 Collection: Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical EngineeringInternational audienc

Cell wall mutants

65 ref. www.gauthier-villars.frInternational audienc

La machinerie de biosynthèse de la cellulose (une cible pour améliorer l'utilisation de la biomasse végétale.)

La production de biocarburants de deuxième génération basée sur la transformation de la biomasse végétale est une question d actualité. La biomasse végétale est représentée par les parois des cellules, qui consistent en un réseau de microfibrilles de cellulose et de polysaccharides enchâssés dans de la lignine. Pour exploiter pleinement le potentiel de cette biomasse, il est nécessaire d apporter des connaissances complémentaires sur les mécanismes de biosynthèse de ces polymères pariétaux. Par exemple, il est important d améliorer le rendement de saccharification des microfibrilles de cellulose afin de produire de plus grandes quantités de bioéthanol. Nous avons donc combiné des études basées sur le modèle bien connu Arabidopsis et sur Brachypodium distachyon, la nouvelle espèce modèle pour les graminées tempérées et les céréales monocotylédones dédiées à la production de biocarburants. La cellulose est synthétisée par des complexes membranaires de cellulose synthases (CSC) qui contiennent les sous-unités catalytiques de cellulose synthase (CESAs), et cela requiert d autres partenaires parmi lesquels KOR1, une endo-b-1,4-glucanase. Le trafic intracellulaire des CESAs semble jouer un rôle crucial dans la régulation du niveau de la synthèse de la cellulose. Nous avons étudié en détails le trafic intracellulaire de KOR1 dans des hypocotyles d Arabidopsis cultivés à l obscurité. En parallèle, lors d un crible visuel de la collection de mutants de Brachypodium de l INRA de Versailles, nous avons sélectionné un mutant nommé spa. Ce mutant partage des caractéristiques avec les mutants brittle culm du riz et de l orge, comme par exemple des tiges cassantes, un xylème irrégulier, et une importante déficience en cellulose, surtout au niveau des tiges, qui contiennent 50% de la quantité retrouvée dans une plante sauvage. Des dosages de lignine ont montré une augmentation significative chez spa. De façon itnéressante, ce mutant présente un défaut flagrant du port érigé, au contraire des mutants brittle culm qui sont parfaitement érigés. Les défauts mécaniques du mutant spa s illustrent par un module de Young trois fois inférieur à celui d une plante sauvage. Des approches complémentaires ont été mise en œuvre afin d identifier les défauts génétiques responsables de ce phénotype : le séquençage de gènes candidats reliés à la synthèse de la cellulose a été réalisé ainsi qu une approche de NGS. De plus, dans le cadre du projet Européen RENEWALL et du projet KBBE CellWall, et grâce à l outil BradiNet (M.Mutvil, KBBE CellWall) permettant d accéder aux réseaux de co-expression, des stratégies RNAi sont en cours afin d inactiver certains gènes seléctionnés selon des critères d expression spécifiques, et selon leur implication potentielle dans la synthèse de la cellulose, spécifiquement chez les monocotylédones. Parmi ces gènes nous nous sommes concentrés sur la famille des MAP65 (Microtubules Associated Proteins), qui pourraient, au vu de la relation étroite entre microtubules et microfibrilles, jouer un rôle dans la déposition de la cellulose.The production of second-generation biofuels based on the transformation of plant biomass is a pressing issue. Biomass is represented by cell walls of the plant cells consisting of a network of cellulose microfibrils and polysaccharides encrusted by lignin. To enhance the potential of plant biomass, we need to provide insights on the mechanisms of the biosynthesis of cell wall polymers. For example, it is important to improve the saccharification yield of cellulose microfibrils to produce the highest amount of bioethanol. We therefore combine studies on the well-known model plant Arabidopsis and Brachypodium distachyon, the new model species for temperate graminae and monocotyledonous crops dedicated to biofuel production. Cellulose is synthesized by plasma membrane-bound cellulose synthase complexes (CSC) containing cellulose synthase proteins (CESAs) and requires other partners among which the endo-beta1,4 glucanase KOR1. The intracellular trafficking of CESAs seems to be crucial to regulate the cellulose synthesis rate. We investigated in detail the intracellular trafficking of KOR1 in Arabidospis dark-grown hypocotyls.In parallel we selected by visual screening of the Versailles collection of mutagenized Brachypodium distachyon a mutant called spa. This mutant shares characteristics of the brittle culm mutants of rice and barley, such as brittleness, irregular xylem, and a cellulose content deficiency especially in stems, with 50% of the amount found in the wild type. Lignin assays indicate a higher amount of lignin in spa. Interestingly, this mutant is also "floppy" unlike others brittle culm mutants which are fully erected and the mechanical strength defects of spa is illustrated by a Young s modulus three times lower than that of WT. Complementary approaches were used to identify the SPA gene: sequencing of candidate genes related to cell wall synthesis or co-expressed with secondary cell wall cellulose synthases and a classical mapping strategy combined with NGS methods. Moreover within the framework of the European RENEWALL and KBBE CellWall projects and thanks to the co-expression network tool BradiNet (M. Mutwil, KBBE project), RNAi strategies are in progress to inactivate a few genes selected according to specific expression criteria and potentially involved in cell wall synthesis specifically in monocots. Among these genes we are focusing on the MAP65 family (Microtubules Associated Proteins), which could play a role in cellulose deposition according to the close relationship between microfibrils and microtubules.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Dynamics and regulation of cellulose synthesis machinery

La croissance et l'architecture des plantes reposent sur l'expansion cellulaire anisotrope. Le relâchement pariétal, modulé par l orientation des microfibrilles de cellulose déposées autour de chaque cellule végétale, permet de contrôler l expansion cellulaire. La cellulose est synthétisée par des complexes cellulose synthases (CSCs) au niveau de la membrane plasmique. Le mouvement des CSCs, et en conséquence le dépôt ordonné de la cellulose, est guidé par les microtubules corticaux par un mécanisme encore inconnu. La présence de la protéine membranaire KORRIGAN1 (KOR1), une endo- -1,4-glucanase, est aussi nécessaire pour la synthèse de la cellulose. Par des approches combinées de biologie cellulaire et de biochimie, nous avons montré que trois isoformes différentes de cellulose synthase sont nécessaires pour constituer un CSC fonctionnel de paroi primaire. Nos différents résultats suggèrent que les CMTs non seulement guident les trajectoires des CSCs dans la membrane plasmique mais aussi régulent l insertion et l internalisation des CSCs. Nous avons également montré que les microtubules corticaux contrôlent la réorientation globale des trajectoires des CSCs et que la paroi de la face interne de l épiderme contrôle l'expansion cellulaire de l'hypocotyle chez Arabidopsis. Ces données suggèrent que les CSCs interagissent directement avec les CMTs ou via un facteur associé aux CMTs. Par des approches similaires, nous avons également montré que la protéine KOR1 est associée aux CESAs impliquées dans la mise en place de la paroi primaire. En conclusion, nous avons mis en évidence de nouvelles interactions entre les CESAs et le cytosquelette d'une part, et les CESAs et KOR1 d'autre part, qui permettent de proposer un nouveau modèle pour la machinerie de biosynthèse de la cellulose et sa régulation.Plant development and architecture result from anisotropic cell expansion. Cell wall yielding controls cell shape and expansion, and is modulated in part by the oriented deposition of cellulose microfibrils around the cell. Cellulose is synthesized by motile cellulose synthase complexes (CSCs) in the plasma membrane, whose movement is directed by cortical microtubules through an unknown mechanism. In higher plants, the KORRIGAN1 (KOR1) membrane-bound endo- -1,4-glucanase is also required for cellulose synthesis. Using cell biology and biochemical approaches, we have demonstrated that three different CESA isoforms are required for primary cell wall cellulose synthesis. We find that CSC delivery to the plasma membrane is regulated by pauses of the Golgi apparatus along cortical microtubules. Our results illustrate that cortical microtubules not only guide the trajectories of CSCs in the plasma membrane, but also regulate their secretion and internalization. We have also shown that cortical microtubules mediate global reorientation of CSC trajectories during growth, and provide evidence that the cell wall on the inner epidermal face drives anisotropic cell expansion of the hypocotyl in Arabidopsis. Together, our data support the hypothesis that CSCs physically interact with cortical microtubules or a microtubule-associated factor, yielding insight into the mechanism by which cortical microtubules may direct CSC trajectories. We have also conducted parallel studies of the dynamics and localization of the KOR1 endo- -1,4-glucanase, and find that it associates with the CSC through specific interactions with primary CESAs. In conclusion, our research has shed light on the complex interactions between CESA isoforms, KOR1, and the cytoskeleton, offering a more comprehensive model for the regulation of cellulose synthesis and deposition.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF