Bases moleculares y mecanismo de hidrólisis de mucinasas que dependen de clústeres de O-glicanos

Las mucinas son proteínas altamente O-glicosiladas que ejercen un gran número de funciones. Están localizadas en todas las mucosas del cuerpo y son el mayor componente proteíco en fluidos. Estas tienen en el intestino, entre otras funciones, la capacidad de defendernos de organismos patógenos así como de servir como hogar para la microbiota.Tanto las bacterias comensales como las bacterias patógenas que habitan el intestino grueso deben de degradar estas mucinas para poder alimentarse o para poder atravesar esta barrera de defensa llegando al epitelio para infectar al huésped. Para ello han desarrollado una batería de hidrolasas que degradan estas mucinas, entre ellas las mucinasas. Las mucinasas son O-glicoproteasas específicas de dominios tipo mucina altamente O-glicosilados. Se conocen muy pocas mucinasas hoy en día y todas ellas provienen de organismos procariotas.En este trabajo se presenta la caracterización basada en la obtención de estructuras cristalográficas, bases moleculares para el reconocimiento y mecanismos de hidrólisis entre otros resultados relacionados con las enzimas AM0627 y HC7.AM0627 es una de las pocas mucinasas conocidas hasta la fecha que es capaz de actuar entre dos O-glicanos contiguos mientras que HC7 pertenece a una nueva serie de mucinasas descubiertas recientemente, la cual es capaz de atacar clústeres de 3 y 4 O-glicanos. Además, mediante comparaciones estructurales del nuevo dominio de HC7, se han encontrado mucinasas pertenecientes a organismos eucariotas, lo que no se había conseguido hasta la fecha. Todos estos resultados nos han permitido ahondar en la degradación de este tipo de estructuras altamente O-glicosiladas llegando a definir las interacciones en detalle y describiendo los aminoácidos esenciales para su actividad. Gracias a esto se ha abierto un nuevo y amplio campo de investigación con nuevas mucinasas basadas en el plegamiento descubierto en esta tesis doctoral.<br /

Cofactors and pathogens: Flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide (FAD) biosynthesis by the FAD synthase from Brucella ovis

The biosynthesis of the flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD), cofactors used by 2% of proteins, occurs through the sequential action of two ubiquitous activities: a riboflavinkinase (RFK) that phosphorylates the riboflavin (RF) precursor to FMN, and a FMN:adenylyltransferase (FMNAT) that transforms FMN into FAD. In most mammals two different monofunctional enzymes have each of these activities, but in prokaryotes a single bifunctional enzyme, FAD synthase (FADS), holds them. Differential structural and functional traits for RFK and FMNAT catalysis between bacteria and mammals, as well as within the few bacterial FADSs so far characterized, has envisaged the potentiality of FADSs from pathogens as targets for the development of species-specific inhibitors. Here, we particularly characterize the FADS from the ovine pathogen Brucella ovis (BoFADS), causative agent of brucellosis. We show that BoFADS has RFK activity independently of the media redox status, but its FMNAT activity (in both forward and reverse senses) only occurs under strong reducing conditions. Moreover, kinetics for flavin and adenine nucleotides binding to the RFK site show that BoFADS binds preferentially the substrates of the RFK reaction over the products and that the adenine nucleotide must bind prior to flavin entrapment. These results, together with multiple sequence alignments and phylogenetic analysis, point to variability in the less conserved regions as contributing to the species-specific features in prokaryotic FADSs, including those from pathogens, that allow them to adopt alternative strategies in FMN and FAD biosynthesis and overall flavin homeostasis

Cristalización de proteínas redox y predicción estructural de la FAD sintetasa humana

Este trabajo ha abordado el estudio estructural de proteínas redox de interés biotecnológico y biomédico tales como el factor de inducción de la apoptosis humano, implicado en procesos de muerte celular (hAIF), la NADPH-flavodoxina reductasa del microorganismo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XacFPR) y las proteínas riboflavin quinasa humana (hRFK) y FAD sintetasa humana (hFADS_2), implicadas en la síntesis del cofactor FAD necesario para múltiples rutas metabólicas así como para la actividad de las flavoproteinas. Con este fin se han utilizado varias técnicas: la cristalografía de rayos X, la predicción estructural de proteínas y la microscopia de fuerzas atómicas. La técnica de cristalografía de rayos X aplicada a proteínas está basada en la obtención de cristales proteicos que difractan los rayos X proporcionando datos que conducen a la resolución de la estructura tridimensional de la proteína. Esta técnica se puede llevar a cabo en presencia de ligandos de manera que se consigue información de la interacción proteína - ligando. Durante el desarrollo de este trabajo se han identificado condiciones iniciales de cristalización de las proteínas riboflavin quinasa humana (hRFK) y de las especies mutantes del factor de inducción de la apoptosis humano (hAIF), así como la resolución de la estructura de la proteína XacFPR cocristalizada con NADP+ y/o un inhibidor de su actividad reductasa en la que no se observa densidad electrónica extra debida al ligando. Con el fin de avanzar en el conocimiento de la estructura de la enzima hFADS_2, y a falta de un modelo cristalográfico, se realizó una predicción de su estructura tridimensional así como un estudio morfológico del dominio C terminal mediante microscopia de fuerzas atómicas. Se observó que el dominio C terminal aislado dimeriza y que los monómeros presentan una altura promedio de 3,5 ± 0,5 nm, que se ajusta a las dimensiones encontradas en las predicciones

Structural and mechanistic insights into the cleavage of clustered O-glycan patches-containing glycoproteins by mucinases of the human gut

Mucinases of human gut bacteria cleave peptide bonds in mucins strictly depending on the presence of neighboring O-glycans. The Akkermansia muciniphila AM0627 mucinase cleaves specifically in between contiguous (bis) O-glycans of defined truncated structures, suggesting that this enzyme may recognize clustered O-glycan patches. Here, we report the structure and molecular mechanism of AM0627 in complex with a glycopeptide containing a bis-T (Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr) O-glycan, revealing that AM0627 recognizes both the sugar moieties and the peptide sequence. AM0627 exhibits preference for bis-T over bis-Tn (GalNAcα1-O-Ser/Thr) O-glycopeptide substrates, with the first GalNAc residue being essential for cleavage. AM0627 follows a mechanism relying on a nucleophilic water molecule and a catalytic base Glu residue. Structural comparison among mucinases identifies a conserved Tyr engaged in sugar-π interactions in both AM0627 and the Bacteroides thetaiotaomicron BT4244 mucinase as responsible for the common activity of these two mucinases with bis-T/Tn substrates. Our work illustrates how mucinases through tremendous flexibility adapt to the diversity in distribution and patterns of O-glycans on mucins

Sars-cov-2 seroprevalence in household domestic ferrets (Mustela putorius furo)

Animal infections with SARS-CoV-2 have been reported in different countries and several animal species have been proven to be susceptible to infection with SARS-CoV-2 both naturally and by experimental infection. Moreover, infections under natural conditions in more than 20 mink farms have been reported where humans could have been the source of infection for minks. However, little information is available about the susceptibility of pet animals under natural conditions and currently there is no SARS-CoV-2 epidemiological assessment occurrence in household ferrets. In this study, the presence of SARS-CoV-2 antibodies was evaluated in serum samples obtained from 127 household ferrets (Mustela putorius furo) in the Province of Valencia (Spain). Two ferrets tested positive to SARS-CoV-2 (1.57%) by in-house enzyme-linked immunosorbent assay based on receptor binding domain (RBD) of Spike antigen. Furthermore, anti- RBD SARS-CoV-2 antibodies persisted at detectable levels in a seropositive SARS-CoV-2 domestic ferret beyond 129 days since the first time antibodies were detected. This study reports for the first time the evidence of household pet ferrets exposure to SARS-CoV-2 in Spain to date

FUT8-directed core fucosylation of N-glycans is regulated by the glycan structure and protein environment

FUT8 is an essential α-1,6-fucosyltransferase that fucosylates the innermost GlcNAc of N-glycans, a process called core fucosylation. In vitro, FUT8 exhibits substrate preference for the biantennary complex N-glycan oligosaccharide (G0), but the role of the underlying protein/peptide to which N-glycans are attached remains unclear. Here, we explored the FUT8 enzyme with a series of N-glycan oligosaccharides, N-glycopeptides, and an Asn-linked oligosaccharide. We found that the underlying peptide plays a role in fucosylation of paucimannose (low mannose) and high-mannose N-glycans but not for complex-type N-glycans. Using saturation transfer difference (STD) NMR spectroscopy, we demonstrate that FUT8 recognizes all sugar units of the G0 N-glycan and most of the amino acid residues (Asn-X-Thr) that serve as a recognition sequon for the oligosaccharyltransferase (OST). The largest STD signals were observed in the presence of GDP, suggesting that prior FUT8 binding to GDP-β-l-fucose (GDP-Fuc) is required for an optimal recognition of N-glycans. We applied genetic engineering of glycosylation capacities in CHO cells to evaluate FUT8 core fucosylation of high-mannose and complex-type N-glycans in cells with a panel of well-characterized therapeutic N-glycoproteins. This confirmed that core fucosylation mainly occurs on complex-type N-glycans, although clearly only at selected glycosites. Eliminating the capacity for complex-type glycosylation in cells (KO mgat1) revealed that glycosites with complex-type N-glycans when converted to high mannose lost the core Fuc. Interestingly, however, for erythropoietin that is uncommon among the tested glycoproteins in efficiently acquiring tetra-antennary N-glycans, two out of three N-glycosites obtained Fuc on the high-mannose N-glycans. An examination of the N-glycosylation sites of several protein crystal structures indicates that core fucosylation is mostly affected by the accessibility and nature of the N-glycan and not by the nature of the underlying peptide sequence. These data have further elucidated the different FUT8 acceptor substrate specificities both in vitro and in vivo in cells, revealing different mechanisms for promoting core fucosylation

Estructura económica de Risaralda

Para conocer la historia de un país, también es indispensable conocer como han estado conformadas sus ciudades y cómo ha sido su recorrido a través del tiempo para tener una perspectiva mucho más amplia de su economía durante cada coyuntura. Es por esto, que la Historia Económica de Risaralda busca poner a disposición y resaltar una visión bastante amplia de su recorrido histórico y económico, partiendo desde los primeros habitantes y estructuras económicas del territorio, datadas desde tiempo precoloniales, y atravesando por las diferentes transformaciones que fueron afectando a Risaralda durante la colonia y en los años posteriores a esta, especialmente con acontecimientos como la colonización antioqueña, que dejó arraigada la actividad agrícola como la más importante de la economía departamental, aunque la misma con el pasar de los años en el siglo XX fue perdiendo importancia a causa del auge manufacturero, y especialmente del auge de la terciarización sustentada en la actividad comercial. Este fenómeno de terciarización económica será considerado de forma tanto histórica como actual, identificando cual es la situación económica vigente de Risaralda, y a partir de ello darse una idea de lo que le puede deparar al territorio en los próximos años, donde los objetivos de sostenibilidad y calidad de vida parecen ser las claves de toda iniciativa

Molecular basis for bacterial N-glycosylation by a soluble HMW1C-like N-glycosyltransferase

Abstract Soluble HMW1C-like N-glycosyltransferases (NGTs) catalyze the glycosylation of Asn residues in proteins, a process fundamental for bacterial autoaggregation, adhesion and pathogenicity. However, our understanding of their molecular mechanisms is hindered by the lack of structures of enzymatic complexes. Here, we report structures of binary and ternary NGT complexes of Aggregatibacter aphrophilus NGT (AaNGT), revealing an essential dyad of basic/acidic residues located in the N-terminal all α-domain (AAD) that intimately recognizes the Thr residue within the conserved motif Asn0-X+1-Ser/Thr+2. Poor substrates and inhibitors such as UDP-galactose and UDP-glucose mimetics adopt non-productive conformations, decreasing or impeding catalysis. QM/MM simulations rationalize these results, showing that AaNGT follows a SN2 reaction mechanism in which the acceptor asparagine uses its imidic form for catalysis and the UDP-glucose phosphate group acts as a general base. These findings provide key insights into the mechanism of NGTs and will facilitate the design of structure-based inhibitors to treat diseases caused by non-typeable H. influenzae or other Gram-negative bacteria