Protocol: methodology for chromatin immunoprecipitation (ChIP) in Chlamydomonas reinhardtii

We report on a detailed chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. The protocol is suitable for the analysis of nucleosome occupancy, histone modifications and transcription factor binding sites at the level of mononucleosomes for targeted and genome-wide studies. We describe the optimization of conditions for crosslinking, chromatin fragmentation and antibody titer determination and provide recommendations and an example for the normalization of ChIP results as determined by real-time PCR

Genome-wide analysis on Chlamydomonas reinhardtii reveals the impact of hydrogen peroxide on protein stress responses and overlap with other stress transcriptomes.

Reactive oxygen species (ROS) are produced by and have the potential to be damaging to all aerobic organisms. In photosynthetic organisms, they are an unavoidable byproduct of electron transfer in both the chloroplast and mitochondrion. Here, we employ the reference unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii to identify the effect of H2O2 on gene expression by monitoring the changes in the transcriptome in a time-course experiment. Comparison of transcriptomes from cells sampled immediately prior to the addition of H2O2 and 0.5 and 1 h subsequently revealed 1278 differentially abundant transcripts. Of those transcripts that increase in abundance, many encode proteins involved in ROS detoxification, protein degradation and stress responses, whereas among those that decrease are transcripts encoding proteins involved in photosynthesis and central carbon metabolism. In addition to these transcriptomic adjustments, we observe that addition of H2O2 is followed by an accumulation and oxidation of the total intracellular glutathione pool, and a decrease in photosynthetic O2 output. Additionally, we analyze our transcriptomes in the context of changes in transcript abundance in response to singlet O2 (O2*), and relate our H2O2 -induced transcripts to a diurnal transcriptome, where we demonstrate enrichments of H2O2 -induced transcripts early in the light phase, late in the light phase and 2 h prior to light. On this basis several genes that are highlighted in this work may be involved in previously undiscovered stress remediation pathways or acclimation responses

VIPP2 interacts with VIPP1 and HSP22E/F at chloroplast membranes and modulates a retrograde signal for HSP22E/F gene expression

VIPP proteins aid thylakoid biogenesis and membrane maintenance in cyanobacteria, algae, and plants. Some members of the Chlorophyceae contain two VIPP paralogs termed VIPP1 and VIPP2, which originate from an early gene duplication event during the evolution of green algae. VIPP2 is barely expressed under nonstress conditions but accumulates in cells exposed to high light intensities or H2O2, during recovery from heat stress, and in mutants with defective integration (alb3.1) or translocation (secA) of thylakoid membrane proteins. Recombinant VIPP2 forms rod-like structures in vitro and shows a strong affinity for phosphatidylinositol phosphate. Under stress conditions, >70% of VIPP2 is present in membrane fractions and localizes to chloroplast membranes. A vipp2 knock-out mutant displays no growth phenotypes and no defects in the biogenesis or repair of photosystem II. However, after exposure to high light intensities, the vipp2 mutant accumulates less HSP22E/F and more LHCSR3 protein and transcript. This suggests that VIPP2 modulates a retrograde signal for the expression of nuclear genes HSP22E/F and LHCSR3. Immunoprecipitation of VIPP2 from solubilized cells and membrane-enriched fractions revealed major interactions with VIPP1 and minor interactions with HSP22E/F. Our data support a distinct role of VIPP2 in sensing and coping with chloroplast membrane stress

Multiomics resolution of molecular events during a day in the life of Chlamydomonas.

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii displays metabolic flexibility in response to a changing environment. We analyzed expression patterns of its three genomes in cells grown under light-dark cycles. Nearly 85% of transcribed genes show differential expression, with different sets of transcripts being up-regulated over the course of the day to coordinate cellular growth before undergoing cell division. Parallel measurements of select metabolites and pigments, physiological parameters, and a subset of proteins allow us to infer metabolic events and to evaluate the impact of the transcriptome on the proteome. Among the findings are the observations that Chlamydomonas exhibits lower respiratory activity at night compared with the day; multiple fermentation pathways, some oxygen-sensitive, are expressed at night in aerated cultures; we propose that the ferredoxin, FDX9, is potentially the electron donor to hydrogenases. The light stress-responsive genes PSBS, LHCSR1, and LHCSR3 show an acute response to lights-on at dawn under abrupt dark-to-light transitions, while LHCSR3 genes also exhibit a later, second burst in expression in the middle of the day dependent on light intensity. Each response to light (acute and sustained) can be selectively activated under specific conditions. Our expression dataset, complemented with coexpression networks and metabolite profiling, should constitute an excellent resource for the algal and plant communities

Selective Bispecific T Cell Recruiting Antibody and Antitumor Activity of Adoptive T Cell Transfer

Background: One bottleneck for adoptive T cell therapy (ACT) is recruitment of T cells into tumors. We hypothesized that combining tumor-specific T cells, modified with a marker antigen and a bispecific antibody (BiAb) that selectively recognizes transduced T cells and tumor cells would improve T cell recruitment to tumors and enhance therapeutic efficacy. Methods: SV40 T antigen-specific T cells from T cell receptor (TCR)-I-transgenic mice were transduced with a truncated human epidermal growth factor receptor (EGFR) as a marker protein. Targeting and killing by combined ACT and anti-EGFR-anti-EpCAM BiAb therapy was analyzed in C57Bl/6 mice (n = six to 12 per group) carrying subcutaneous tumors of the murine gastric cancer cell line GC8 (SV40+ and EpCAM+). Anti-EGFR x anti-c-Met BiAb was used for targeting of human tumor-specific T cells to c-Met+ human tumor cell lines. Differences between experimental conditions were analyzed using the Student's t test, and differences in tumor growth with two-way analysis of variance. Overall survival was analyzed by log-rank test. All statistical tests were two-sided. Results: The BiAb linked EGFR-transduced T cells to tumor cells and enhanced tumor cell lysis. In vivo, the combination of ACT and Biab produced increased T cell infiltration of tumors, retarded tumor growth, and prolonged survival compared with ACT with a control antibody (median survival 95 vs 75 days, P < .001). In human cells, this strategy enhanced recruitment of human EGFR-transduced T cells to immobilized c-Met and recognition of tyrosinase+ melanoma cells by TCR-, as well as of CEA+ colon cancer cells by chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells. Conclusions: BiAb recruitment of tumor-specific T cells transduced with a marker antigen to tumor cells may enhance efficacy of AC

Selective bispecific T cell recruiting antibody and antitumor activity of adoptive T cell transfer

Background: One bottleneck for adoptive T cell therapy (ACT) is recruitment of T cells into tumors. We hypothesized that combining tumor-specific T cells, modified with a marker antigen and a bispecific antibody (BiAb) that selectively recognizes transduced T cells and tumor cells would improve T cell recruitment to tumors and enhance therapeutic efficacy.Methods: SV40 T antigen–specific T cells from T cell receptor (TCR)-I–transgenic mice were transduced with a truncated human epidermal growth factor receptor (EGFR) as a marker protein. Targeting and killing by combined ACT and anti-EGFR–anti-EpCAM BiAb therapy was analyzed in C57Bl/6 mice (n = six to 12 per group) carrying subcutaneous tumors of the murine gastric cancer cell line GC8 (SV40+ and EpCAM+). Anti-EGFR x anti-c-Met BiAb was used for targeting of human tumor-specific T cells to c-Met+ human tumor cell lines. Differences between experimental conditions were analyzed using the Student’s t test, and differences in tumor growth with two-way analysis of variance. Overall survival was analyzed by log-rank test. All statistical tests were two-sided.Results: The BiAb linked EGFR-transduced T cells to tumor cells and enhanced tumor cell lysis. In vivo, the combination of ACT and Biab produced increased T cell infiltration of tumors, retarded tumor growth, and prolonged survival compared with ACT with a control antibody (median survival 95 vs 75 days, P < .001). In human cells, this strategy enhanced recruitment of human EGFR–transduced T cells to immobilized c-Met and recognition of tyrosinase+ melanoma cells by TCR-, as well as of CEA+ colon cancer cells by chimeric antigen receptor (CAR)–modified T cells.Conclusions: BiAb recruitment of tumor-specific T cells transduced with a marker antigen to tumor cells may enhance efficacy of ACT

Dissection of the HSF1-dependent stress response with a special focus on the chloroplast HSP70 system in Chlamydomonas reinhardtii

Wechselnde Umweltbedingungen wie Temperaturveränderungen oder der Zugang zu Nährstoffen erfordern spezielle genetische Anpassungsprogramme, vor allem von sessilen Organismen wie Pflanzen. Ein solcher hochkonservierter Mechanismus, der unter anderem vor Temperaturspitzen schützt, ist die von Hitzeschockfaktoren (HSF) kontrollierte Hitzeschockantwort (HSR). Dabei werden vermehrt spezifische Hitzestressproteine (HSPs, Chaperone) gebildet, die Proteine vor Denaturierung schützen. In Pflanzen hat sich ein hochkomplexes regulatorisches Netzwerk gebildet, das aus über 20 HSFs besteht, das eine genaue Feinabstimmung der HSR auf die jeweiligen Stressbedingungen erlaubt. Das hohe Maß an Komplexität der HSR in Pflanzen erschwert die wissenschaftliche Zugänglichkeit jedoch erheblich. Um die grundlegenden Prinzipien der HSR in Pflanzen zu verstehen griffen wir deshalb auf einen einfacheren Modellorganismus zurück, der Pflanzen sehr nahe steht aber nur einen einzigen HSF (HSF1) enthält, der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Im Rahmen dieser Arbeit wurden dazu drei Ansätze verfolgt. Als erstes wurden verschiedene chemische Substanzen eingesetzt die unterschiedliche Schritte während der Aktivierung und Abschaltung der HSR hemmen um darüber die Regulation der HSR aufzuklären. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von HSF1 eine entscheidende Rolle in der Aktivierung der HSR spielt, das auslösende Momentum die Anhäufung von falsch gefalteten Proteinen ist und das HSP90A aus dem Cytosol eine wichtige modulierende Rolle bei der HSR spielt. Als zweites wurde die Veränderung sämtlicher Transkripte mithilfe von Microarrays gemessen, um vor allem pflanzenspezifische Prozesse zu identifizieren, die auf erhöhte Temperaturen gezielt angepasst werden müssen. Dabei konnte die Chlorophyll Biosynthese und der Transport von Proteinen in den Chloroplasten als neue, pflanzenspezifische Ziele der Stressantwort identifiziert werden. Des Weiteren konnte direkt gezeigt werden, das HSF1 auch plastidäre Chaperone reguliert, im Gegensatz zu mitochondrialen Chaperonen die getrennt gesteuert werden. Als letztes wurde gezielt die Expression wichtiger Gene für die Stressantwort (HSF1/HSP70B) unterdrückt, um den Einfluss dieser Gene auf die HSR genauer zu studieren. Dazu habe ich ein in der einzelligen Grünalge neuartiges System entwickelt, basierend auf dem RNAi Mechanismus, dass es erlaubt abhängig von der Stickstoffquelle im Nährmedium auch essentielle Gene gezielt auszuschalten. Dieses System erlaubte es zu zeigen, dass HSF1 selbst während des Stresses die Expression seiner RNA erhöht, und dies gezielt tut um die Stressantwort weiter zu verstärken. Es konnte weiter gezeigt werden, dass das Chloroplasten Chaperon HSP70B ein essentielles Protein für das Zellwachstum ist, welches mithilfe des induzierbaren RNAi Systems genauer untersucht werden kann. Dabei wurde festgestellt, dass die HSP70B vermittelte Assemblierung und Disassemblierung des VIPP1 Proteins entscheidend ist für dessen Funktion in der Zelle. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass HSP70B wahrscheinlich verantwortlich ist für die Faltung eines oder mehrerer noch unbekannter Enzyme der Arginin Biosynthese oder der Stickstofffixierung, und das diese Prozesse wahrscheinlich die essentielle Funktion von HSP70B darstellen

Dissection of the HSF1-dependent stress response with a special focus on the chloroplast HSP70 system in Chlamydomonas reinhardtii

Wechselnde Umweltbedingungen wie Temperaturveränderungen oder der Zugang zu Nährstoffen erfordern spezielle genetische Anpassungsprogramme, vor allem von sessilen Organismen wie Pflanzen. Ein solcher hochkonservierter Mechanismus, der unter anderem vor Temperaturspitzen schützt, ist die von Hitzeschockfaktoren (HSF) kontrollierte Hitzeschockantwort (HSR). Dabei werden vermehrt spezifische Hitzestressproteine (HSPs, Chaperone) gebildet, die Proteine vor Denaturierung schützen. In Pflanzen hat sich ein hochkomplexes regulatorisches Netzwerk gebildet, das aus über 20 HSFs besteht, das eine genaue Feinabstimmung der HSR auf die jeweiligen Stressbedingungen erlaubt. Das hohe Maß an Komplexität der HSR in Pflanzen erschwert die wissenschaftliche Zugänglichkeit jedoch erheblich. Um die grundlegenden Prinzipien der HSR in Pflanzen zu verstehen griffen wir deshalb auf einen einfacheren Modellorganismus zurück, der Pflanzen sehr nahe steht aber nur einen einzigen HSF (HSF1) enthält, der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Im Rahmen dieser Arbeit wurden dazu drei Ansätze verfolgt. Als erstes wurden verschiedene chemische Substanzen eingesetzt die unterschiedliche Schritte während der Aktivierung und Abschaltung der HSR hemmen um darüber die Regulation der HSR aufzuklären. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von HSF1 eine entscheidende Rolle in der Aktivierung der HSR spielt, das auslösende Momentum die Anhäufung von falsch gefalteten Proteinen ist und das HSP90A aus dem Cytosol eine wichtige modulierende Rolle bei der HSR spielt. Als zweites wurde die Veränderung sämtlicher Transkripte mithilfe von Microarrays gemessen, um vor allem pflanzenspezifische Prozesse zu identifizieren, die auf erhöhte Temperaturen gezielt angepasst werden müssen. Dabei konnte die Chlorophyll Biosynthese und der Transport von Proteinen in den Chloroplasten als neue, pflanzenspezifische Ziele der Stressantwort identifiziert werden. Des Weiteren konnte direkt gezeigt werden, das HSF1 auch plastidäre Chaperone reguliert, im Gegensatz zu mitochondrialen Chaperonen die getrennt gesteuert werden. Als letztes wurde gezielt die Expression wichtiger Gene für die Stressantwort (HSF1/HSP70B) unterdrückt, um den Einfluss dieser Gene auf die HSR genauer zu studieren. Dazu habe ich ein in der einzelligen Grünalge neuartiges System entwickelt, basierend auf dem RNAi Mechanismus, dass es erlaubt abhängig von der Stickstoffquelle im Nährmedium auch essentielle Gene gezielt auszuschalten. Dieses System erlaubte es zu zeigen, dass HSF1 selbst während des Stresses die Expression seiner RNA erhöht, und dies gezielt tut um die Stressantwort weiter zu verstärken. Es konnte weiter gezeigt werden, dass das Chloroplasten Chaperon HSP70B ein essentielles Protein für das Zellwachstum ist, welches mithilfe des induzierbaren RNAi Systems genauer untersucht werden kann. Dabei wurde festgestellt, dass die HSP70B vermittelte Assemblierung und Disassemblierung des VIPP1 Proteins entscheidend ist für dessen Funktion in der Zelle. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass HSP70B wahrscheinlich verantwortlich ist für die Faltung eines oder mehrerer noch unbekannter Enzyme der Arginin Biosynthese oder der Stickstofffixierung, und das diese Prozesse wahrscheinlich die essentielle Funktion von HSP70B darstellen