Molecular pathomechanisms of muscular dystrophies

This study aimed at elucidating molecular pathways behind muscular dystrophies, inherited disorders causing progressive weakness and loss of skeletal muscle, with the perspectives of demonstrating the pathogenicity of newly identified mutations, understanding the biology of muscle diseases, and finding options for their treatment. Tibial muscular dystrophy (TMD) and limb-girdle muscular dystrophy type 2J (LGMD2J) are caused by mutations in the C-terminal (M-band) part of the sarcomeric protein titin, whereas LGMD2A results from mutations in the muscle-specific protease calpain 3 (CAPN3). In yeast two-hybrid studies aiming at identifying proteins secondarily affected in the diseases, the multifunctional TRIM-related protein myospryn (CMYA5) was identified as a novel binding partner for both M-band titin and CAPN3. The interactions were confirmed by coimmunoprecipitation, and localization of myospryn at the M-band level was supported by multiple methods. Coexpression studies identified myospryn as a proteolytic substrate for CAPN3, and suggested that myospryn may attenuate its autolytic activation. The biological role of the titin myospryn interaction remained unresolved, and the mouse model of TMD/LGMD2J showed normal myospryn localization. However, since the TMD/LGMD2J mutations disrupt the myospryn binding site in titin, they are likely to have a downstream functional effect on myospryn. LGMD1D is caused by dominant mutations in the ubiquitous co-chaperone DNAJB6. LGMD1D muscle showed a myofibrillar pathology, with cytoplasmic accumulations of DNAJB6, aggregated Z-disc-associated proteins, and autophagic rimmed vacuoles. Expression of DNAJB6 constructs in zebrafish embryos confirmed a toxic effect of the mutant cytoplasmic DNAJB6b isoform, and cell culture studies demonstrated a slower turnover and impaired anti-aggregation activity of mutant DNAJB6. Protein interaction studies indicated an association of DNAJB6 with the chaperone-assisted selective autophagy (CASA) pathway, and a modulatory effect of BAG3 on DNAJB6 pathogenicity in zebrafish suggested that CASA has active role in the pathogenesis of LGMD1D. Welander distal myopathy (WDM) results from a dominant mutation in the prion-related domain (PRD) of the RNA-binding protein TIA1, a regulator of splicing and translation, and a component of stress granules (SGs). RT-PCR analysis of selected TIA1 target genes did not show splicing changes in WDM muscle, suggesting that the pathogenesis does not involve extensive mis-splicing. IF microscopy revealed accumulation of TIA1 and other SG proteins in WDM muscle, while image analysis of transfected cells, and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies indicated a mild increase in the SG-forming propensity of mutant TIA1. These findings suggest that increased aggregation of the TIA1 PRD causes muscle pathology in WDM, either directly through inappropriate protein aggregation or indirectly by compromising cellular metabolism.Lihasrappeumat ovat perinnöllisiä sairauksia, jotka johtavat luurankolihasten etenevään heikkouteen ja surkastumiseen. Ne aiheutuvat geenivirheistä useissa lihassyyn rakenneosissa, ja monet sairauteen johtavista molekyylitason mekanismeista tunnetaan huonosti. Tässä väitöskirjassa tutkittiin joidenkin lihasrappeumien tautimekanismeja, tavoitteena osoittaa tunnistettujen geenivirheiden patogeenisuus sekä ymmärtää lihastautien molekyylibiologiaa, esimerkiksi hoitojen kehittämistä ajatellen. Suomalaiseen tautiperintöön kuuluvat tibiaalinen lihasdystrofia (TMD) ja hartia-lantiotyypin lihasrappeuma 2J (LGMD2J) aiheutuvat virheistä titiinissä, sarkomeerien keskeisessä rakenne- ja säätelyproteiinissa. Tutkimuksessa tunnistettiin titiinin viallisen osan sitoutumiskumppaniksi myospryyni (myospryn, CMYA5), joka toimii solun kalvoliikenteessä ja viestinvälityksessä. TMD/LGMD2J-hiirimallin lihaksessa ei havaittu poikkeavaa myospryynin sijoittumista, mutta toiminnallinen vaikutus myospryyniin on todennäköinen. Myospryyni tunnistettiin myös LGMD2A-lihasrappeuman taustalla olevan kalpaiini 3 proteaasin substraatiksi ja mahdolliseksi säätelijäksi. Kuvatut proteiinivuorovaikutukset lisäävät lihaksen molekyylibiologian perustuntemusta ja voivat jatkossa auttaa TMD/LGMD2J- ja LGMD2A-tautien synnyn ymmärtämisessä. Hartia-lantiotyypin lihasrappeuma 1D (LGMD1D) aiheutuu proteiinien laadunvalvontakoneistoon kuuluvan kaitsijaproteiini DNAJB6:n geenivirheistä, joiden seurauksena lihassyihin kertyy proteiinisakkautumia. DNAJB6:n virheellisen muodon todettiin aiheuttavan lihastautia seeprakalan alkiossa tuotettuna, mikä sopii yhteen LGMD1D:n vallitsevan periytymismallin kanssa. Soluviljelmissä havaittiin, että geenivirheet hidastavat DNAJB6:n hajotusta sekä haittaavat kaitsijaproteiinin kykyä estää proteiinien aggregaatiota. Tutkimuksissa onnistuttiin myös vahvistamaan DNAJB6:n epäilty vuorovaikutus hiljattain kuvatun ja lihaksen toiminnalle tärkeäksi todetun CASA-mekanismin (chaperone-assisted selective autophagy, kaitsijaproteiiniavusteinen selektiivinen autofagia) kanssa sekä saatiin viitteitä tämän autofagiareitin suorasta osallisuudesta LGMD1D:n synnyssä. Ruotsissa ja Suomessa melko yleinen Welanderin distaalinen myopatia (WDM) aiheutuu geenivirheistä TIA1:ssä, joka on lähetti-RNA:n silmukoinnin ja proteiinitranslaation säätelijä sekä soluihin stressitilanteissa muodostuvien stressijyvästen (stress granule) rakenneosa. Tutkittujen TIA1:n kohdegeenien silmukoinnissa ei todettu muutoksia WDM-lihaksessa. Sen sijaan lihasnäytteissä nähtiin TIA1:n ja muiden proteiinien kasaumia, ja soluviljelmissä tehdyissä toiminnallisissa kokeissa havaittiin virheellisen TIA1:n muodostavan stressijyväsiä hieman normaaliproteiinia tehokkaammin. Tulosten perusteella WDM vaikuttaa siis johtuvan poikkeavasta stressijyväsproteiinien käyttäytymisestä, joka on viime aikoina havaittu merkittäväksi ilmiöksi myös hermorappeumasairauksien synnyssä

18F-Radiolabeled porous silicon particles for drug delivery : Tracer development and evaluation in rats

Poor biopharmaceutical properties such as low solubility and low permeability in the gastrointestinal (GI) tract plight many existing drugs and new chemical entities, presenting an impediment for efficient drug therapy. Incorporation of the drug to a delivery system based on a nanostructured material is increasingly investigated as a strategy to overcome these limitations and to achieve controlled and targeted delivery. Porous silicon (PSi) is a promising material for carrier-mediated drug delivery because of its biocompatibility, high chemical stability, and facile elimination from the body. Moreover, the physicochemical properties of PSi can be tailored by variation of the fabrication parameters and surface modifications to suit diverse payloads. Positron emission tomography (PET), a sensitive and quantitative method of molecular imaging, is a potent tool for drug delivery system development. Already at the preclinical stage PET can be employed for the investigation of drug delivery carrier biodistribution in vivo, thereby facilitating the selection of the most promising material candidates for further development and future drug delivery studies. In this dissertation, a direct nucleophilic radiolabeling method with a short-lived positron emitter fluorine-18 (18F) was developed for three different surface-modified PSi materials: thermally hydrocarbonized PSi (THCPSi), thermally carbonized PSi (TCPSi), and thermally oxidized PSi (TOPSi). Out of the investigated materials, nanosized [18F]THCPSi emerged as the one with the highest potential for imaging and drug delivery in terms radiolabeling yield, label stability, and biocompatibility in cell models in vitro, and was therefore forwarded to biodistribution studies in rats. After oral administration, [18F]THCPSi nanoparticles were shown to pass intact through the GI tract in 4 to 6 hours. Modification of [18F]THCPSi with a self-assembled layer of a fungal hydrophobin (HFBII) changed the hydrophilicity of the material bringing about bioadhesive properties that promoted gastric retention of the protein-coated nanoparticles. Intravenous delivery of [18F]THCPSi nanoparticles resulted in their rapid accumulation to the liver and spleen alluding to rapid immune recognition and removal of the particles from the bloodstream by macrophages of the mononuclear phagocyte system (MPS). HFBII-coating of the nanoparticles altered the adsorption of plasma proteins to the particle surface, which translated also to a change in the biodistribution pattern in vivo. In conclusion, the present work establishes 18F-radiolabeled particle tracers as useful means for the evaluation of new PSi-based drug delivery systems with PET.Lääkeaineen biofarmaseuttisesti epäedulliset ominaisuudet, kuten niukkaliukoisuus ja huono permeabiliteetti ruoansulatuskanavassa voivat muodostua esteeksi tehokkaalle lääkehoidolle. Eräs uusi strategia näiden ongelmien ratkaisuun on lääkeaineen liittäminen nanorakenteiseen lääkeainekuljettimeen, jonka avulla sitä voidaan annostella säädellysti sekä kohdennetusti. Huokoinen pii (PSi) on lupaava materiaali lääkeainekuljettimien kehitykseen, sillä sen on osoitettu olevan hyvin bioyhteensopivaa, biohajoavaa sekä kemiallisesti stabiilia. Tämän lisäksi huokoisen piin fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia voidaan räätälöidä sen valmistusparametrejä muokkaamalla sekä erilaisin pintamodifikaatioin soveltumaan useiden erilaisten aineiden kuljetukseen. Positroniemissiotomografia (PET) on herkkä ja kvantitatiivinen molekyylikuvantamisen menetelmä, joka soveltuu hyvin lääkeainekuljettimien kehitystyön tueksi. Jo kehityksen prekliinisessä vaiheessa positroniemissiotomografiaa voidaan käyttää lääkeainekuljettimen biojakauman selvittämiseen in vivo, edesauttaen lupaavimpien materiaalikandidaattien valintaa jatkokehitykseen ja tuleviin lääkeaineiden annostelukokeisiin. Tässä väitöskirjassa kehitettiin suora nukleofiilinen radioleimausmenetelmä lyhytikäisellä positronisäteilijällä, fluori-18:lla (18F) kolmelle erilaiselle pintamuokatulle PSi-materiaalille (THCPSi, TCPSi ja TOPSi). Tutkituista materiaaleista nanokokoinen termisesti hydrokarbidoitu [18F]THCPSi osoittautui soveltuvimmaksi kuvantamiseen ja lääkeainekuljetukseen perustuen sen radioleimauksen saantoon, leiman stabiilisuuteen sekä bioyhteensopivuuteen solumalleissa. Oraalisen annon jälkeen [18F]THCPSi -nanopartikkelit kulkeutuivat muuttumattomina läpi rotan ruoansulatuskanavan 4 - 6 tunnissa. [18F]THCPSi:n muokkaus itsejärjestäytyvällä kerroksella sienestä peräisin olevaa hydrofobiinia (HFBII) muutti materiaalin hydrofiilisyyttä ja teki siitä bioadhesiivisen. Nämä muutokset johtivat proteiinilla muokattujen nanopartikkelienpidättymiseen mahaan. Suonensisäisen annon jälkeen [18F]THCPSi -nanopartikkelit kertyivät maksaan ja pernaan, mikä viittaa niiden tunnistamiseen immuunijärjestelmässä ja siitä seuraavaan nopeaan poistoon verenkierrosta näissä elimissä olevien makrofagien toimesta. Päällystäminen hydrofobiinilla johti muutoksiin veriplasman proteiinien adsorptiossa nanopartikkelien pinnalle. Tämän seurauksena myös biodistribuutiossa havaittiin muutos in vivo. Johtopäätöksenä todettakoon, että tässä työssä 18F-radioleimatut partikkelimerkkiaineet on osoitettu hyödyllisiksi työkaluiksi uusien PSi-pohjaisten lääkeainekuljettimien arviointiin positroniemissiotomografian avulla

Koetun luokkatovereiden ja opettajien sosiaalisen tuen yhteys kiusaamisen kohteena olemiseen ja koulujen välisiin eroihin kiusaamisen yleisyydessä

Tutkielmassa pyritään vastaamaan ensinnäkin kysymykseen siitä, onko kokemus luokkatovereiden ja opettajien sosiaalisen tuen puutteesta yhteydessä koulukiusaamisen kohteena olemiseen. Toiseksi tutkielmassa tarkastellaan sitä, voidaanko koulujen välisiä eroja kiusaamisen yleisyydessä selittää koulujen eroilla oppilaiden kokeman keskimääräisen luokkatovereiden ja opettajien sosiaalisen tuen suhteen. Tutkielma kytkeytyy sosiaalista tukea ja kiusaamista koskevan tutkimuskirjallisuuden lisäksi sosiaalista pääomaa käsitteleviin tutkimuksiin, joissa on tarkasteltu paikallisyhteisöjen sosiaalisen pääoman merkitystä. Aineistona tutkielmassa käytettiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen toteuttamasta vuoden 2017 Kouluterveyskyselystä (8.- ja 9.-luokkalaiset) rajattua osa-aineistoa, jossa oli yhteensä 51 619 vastaajaa jakautuneena 399 yksittäiseen kouluun. Analyysimenetelmänä toimi kaksitasoinen logistinen regressio (satunnaisvakiomalli, random intercept model). Tutkielmassa käytetyt keskeisimmät selittävät muuttujat luokiteltiin yksilötason selittäviin muuttujiin (oppilaan kokemus luokkatovereiden ja opettajien sosiaalisesta tuesta) sekä koulutason selittäviin muuttujiin (luokkatovereiden sekä opettajien tuen koulukohtainen keskiarvo ja keskihajonta). Lisäksi analyyseissa otettiin huomioon muita aiempien tutkimusten perusteella relevantteja yksilötason selittäviä muuttujia (sukupuoli, luokka-aste, perhetekijät, vertaissuhteet ja mielenterveys). Tutkielman keskeinen tulos on, että mitä vähemmän oppilas koki saaneensa luokkatovereiltaan sosiaalista tukea, sitä suurempi oli oppilaan kiusaamisen kohteena olemisen veto (odds). Esimerkiksi niiden oppilaiden, jotka eivät kokeneet koskaan saaneensa luokkatovereiltaan sosiaalista tukea, kiusaamisen kohteena olemisen veto oli noin viisinkertainen luokkatovereiden tukea aina saaneisiin verrattuna, kun kaikki selittävät muuttujat otettiin huomioon. Sen sijaan kokemus opettajien sosiaalisen tuen puutteesta ei kasvattanut kiusattuna olemisen vetoa, kun kaikki selittävät muuttujat huomioitiin: opettajien sosiaalista tukea aina kokeneiden oppilaiden veto oli suurempi kuin niiden, jotka eivät kokeneet saaneensa opettajilta lainkaan tukea tai jotka kokivat saaneensa opettajien tukea usein tai joskus. Tähän tulokseen liittyy kuitenkin merkittäviä epävarmuustekijöitä. Lisäksi tulokset antavat ainoastaan viitteitä siitä, että koulujen erot luokkatovereiden ja opettajien keskimääräisen sosiaalisen tuen suhteen saattavat selittää koulujen välisiä eroja kiusaamisen yleisyydessä. Tulosten mukaan luokkatovereiden sosiaalisen tuen puute on merkittävä kiusattuna olemisen riskitekijä, ja tämä havainto vastaa aikaisemmissa tutkimuksissa saatuja tuloksia. Sen sijaan opettajien sosiaalista tukea koskevat tulokset ovat osittain ristiriidassa aiemman tutkimustiedon kanssa, joten erityisesti opettajien sosiaalisen tuen yhteyttä kiusaamiseen tulisi tutkia lisää. Aineiston koulut olivat myös hyvin samankaltaisia keskimääräisen sosiaalisen tuen tason suhteen, joten jatkotutkimuksissa saattaisi olla tarpeen käyttää tarkempia sosiaalisen tuen mittareita ja ottaa tarkasteluihin mukaan koulutason lisäksi myös luokkataso

Radiolabeling of Theranostic Nanosystems

In the recent years, progress in nanotechnology has significantly contributed to the development of novel pharmaceutical formulations to overcome the drawbacks of conventional treatments and improve the therapeutic outcome in many diseases, especially cancer. Nanoparticle vectors have demonstrated the potential to concomitantly deliver diagnostic and therapeutic payloads to diseased tissue. Due to their special physical and chemical properties, the characteristics and function of nanoparticles are tunable based on biological molecular targets and specific desired features (e.g., surface chemistry and diagnostic radioisotope labeling). Within the past decade, several theranostic nanoparticles have been developed as a multifunctional nanosystems which combine the diagnostic and therapeutic functionalities into a single drug delivery platform. Theranostic nanosystems can provide useful information on a real-time systemic distribution of the developed nanosystem and simultaneously transport the therapeutic payload. In general, the diagnostic functionality of theranostic nanoparticles can be achieved through labeling gamma-emitted radioactive isotopes on the surface of nanoparticles which facilitates noninvasive detection using nuclear molecular imaging techniques, such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT), meanwhile, the therapeutic effect arises from the potent drug released from the nanoparticle. Moreover, some radioisotopes can concurrently emit both gamma radiation and high-energy particles (e.g., alpha, beta, and Auger electrons), prompting the use either alone for radiotheranostics or synergistically with chemotherapy. This chapter provides an overview of the fundamentals of radiochemistry and relevant radiolabeling strategies for theranostic nanosystem development as well as the methods for the preclinical evaluation of radiolabeled nanoparticles. Furthermore, preclinical case studies of recently developed theranostic nanosystems will be highlighted.Peer reviewe

Ovatko varhaiset maladaptiiviset skeemat yhteydessä epävakaan persoonallisuushäiriön oireisiin masentuneilla osastohoitoa vaativilla aikuisilla potilailla?

Tutkimuksen tarkoitus: Masennus ja epävakaa persoonallisuushäiriö ovat hoidon piirissä yleisiä psykiatrisia häiriöitä, joita luonnehtii monimuotoinen kärsimys ja toimintakyvyn lasku, sekä kohonnut riski itsemurhaan. Masennus ja epävakaa persoonallisuushäiriö esiintyvät usein yhdessä ja häiriöiden yhteisesiintyvyys on yhteydessä masennuksen kulkuun. Varhaiset maladaptiiviset skeemat puolestaan viittaavat varhain elämässä sisäistyneisiin itseä ja muita koskeviin merkitsevästi haitallisiin tulkintatapoihin. Skeemat ovat yhteydessä sekä masennuksen että epävakaan persoonallisuushäiriön oireisiin ja oireiden vakavuusasteeseen, mutta skeemojen yhteyttä psykiatriseen yhteisesiintyvyyteen on kaikesta huolimatta tutkittu vain vähän. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli perehtyä epävakaan persoonallisuushäiriön ja masennuksen väliseen yhteisesiintyvyyteen tarkastelemalla skeemojen yhteyttä epävakaan persoonallisuushäiriön oireisiin osastohoitoa vaativassa masentuneessa potilasväestössä. Menetelmät: Otos koostui 43:sta aikuisesta osastohoitoa vaativasta potilaasta (29 naista ja 14 miestä). Epävakaan persoonallisuushäiriön oireita kartoitettiin Structured Clinical Interview for DSM-III-R Personality Disorders ja skeemoja Young Schema Questionnaire-S2-extended itsearviointikyselyjen avulla. Itsearvioituja epävakaan persoonallisuushäiriön oireita ennustettiin kolmiosaisen lineaarisen regressiomallin avulla: Ensimmäisessä vaiheessa epävakaan persoonallisuushäiriön oireet lisättiin malliin riippuvaksi muuttujaksi ja skeemat riippumattomiksi muuttujiksi ja lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin jokaiselle skeemalle erikseen. Seuraavaksi sukupuoli, ikä, koulutustaso ja työllisyysstatus lisättiin malliin kovariaateiksi. Kolmannessa vaiheessa malliin lisättiin kovariaatiksi myös Center for Epidemiological Studies Depression Scale itsearviointikyselyn avulla mitattu tutkimuksen aikainen masennusoireilu. Tutkimustulokset ja johtopäätökset: Kymmenen kahdeksastatoista maladaptiivisesta skeemasta oli merkitsevästi positiivisessa yhteydessä lisääntyneisiin itsearvioituihin epävakaan persoonallisuushäiriön oireisiin. Kuitenkin vain yksi skeema, Ylikriittisyys ja Vaativuus, oli itsenäisessä positiivisessa yhteydessä epävakaan persoonallisuushäiriön oireisiin ja selitti vaihtelua epävakaan persoonallisuushäiriön oireissa yli tutkimuksen aikaisten masennusoireiden, sukupuolen, iän, koulutustason ja työllisyysstatuksen vaikutuksen. Tämän tutkimuksen perusteella Ylikriittisyys ja Vaativuus voi toimia spesifinä kognitiivisena riskitekijänä epävakaan persoonallisuushäiriön oireiden ja niiden vakavuusasteen kasvuun masentuneessa väestössä.Objective: Major Depressive Disorder (MDD) and Borderline Personality Disorder (BPD) are serious psychiatric disorders highly prevalent in clinical settings, characterized by multiple forms of distress, functional decline, and increased risk of suicide. MDD and BPD often co-occur and the co-occurrence of the disorders is associated with the course of MDD. Early Maladaptive Schemas (EMSs) refer to maladaptive internalized representations of the self in relation to others that develop early in life. EMSs are associated with depressive and BPD symptomatology and symptom severity. However, the associations between EMSs and psychiatric comorbidity have rarely been studied. The aim of the present study was to provide new insight into the comorbidity of BPD and MDD by focusing on the associations between EMSs and BPD symptomatology among depressed inpatient population. Methods: The sample consisted of 43 adult inpatients (29 women and 14 men). BPD symptomatology was measured via Structured Clinical Interview for DSM-III-R Personality Disorders and EMSs via Young Schema Questionnaire-S2-Extended self-report questionnaires. A three-level linear regression model was created to predict self-reported BPD symptomatology: In level 1, linear regression analysis was conducted for each individual EMS separately, EMSs entered as predictors for BPD symptomatology. In level 2, gender, age, education level and employment status were added to the model as covariates. In level 3, also current level of depressive symptoms measured via Center for Epidemiological Studies Depression Scale was added to the model as a covariate. Results and conclusions: Higher scores on 10 of the 18 EMSs were significantly positively associated with elevated self-reported BPD symptomatology. However, only one EMS, Unrelenting Standards and Hypercriticalness, was independently positively associated with self-reported BPD symptomatology and explained variance over the effect of current depressive symptom state, gender, age, education level and employment status. According to the findings of the present study, Unrelenting Standards and Hypercriticalness may act a specific cognitive risk factor for elevated BPD symptomatology and symptom severity among depressed individuals

Neuromuscular Diseases Due to Chaperone Mutations: A Review and Some New Results

Skeletal muscle and the nervous system depend on efficient protein quality control, and they express chaperones and cochaperones at high levels to maintain protein homeostasis. Mutations in many of these proteins cause neuromuscular diseases, myopathies, and hereditary motor and sensorimotor neuropathies. In this review, we cover mutations in DNAJB6, DNAJB2, αB-crystallin (CRYAB, HSPB5), HSPB1, HSPB3, HSPB8, and BAG3, and discuss the molecular mechanisms by which they cause neuromuscular disease. In addition, previously unpublished results are presented, showing downstream effects of BAG3 p.P209L on DNAJB6 turnover and localization

Increasing Role of Titin Mutations in Neuromuscular Disorders

Peer reviewe

Kaitsijamutaatiot neuromuskulaaritaudeissa

Vertaisarvioitu.Kaitsijaproteiinien eli kaperonien ja kokaperonien geenivirheet aiheuttavat neuromuskulaaritauteja vaihtelevilla mekanismeilla. Peittyvästi periytyvät taudit liittyvät tyypillisesti kaitsijaproteiinin toiminnan puutokseen, kun taas vallitsevasti periytyvien taustalla voi olla kaitsijaproteiinikoneiston häiriintyminen (esimerkiksi DNAJB6- ja BAG3-geenivirheet) tai muut solumyrkylliset vaikutukset (sHSP-geenivirheet). Tautimekanismien selviäminen on viime vuosina avannut mahdollisuuksia myös tämän kasvavan tautiryhmän hoitoyrityksille.Peer reviewe

Evaluation of Organo [18F]Fluorosilicon Tetrazine as a Prosthetic Group for the Synthesis of PET Radiotracers

Fluorine-18 is the most widely used positron emission tomography (PET) radionuclide currently in clinical application, due to its optimal nuclear properties. The synthesis of 18F-labeled radiotracers often requires harsh reaction conditions, limiting the use of sensitive bio- and macromolecules as precursors for direct radiolabeling with fluorine-18. We aimed to develop a milder and efficient in vitro and in vivo labeling method for trans-cyclooctene (TCO) functionalized proteins, through the bioorthogonal inverse-electron demand Diels-Alder (IEDDA) reaction with fluorine-18 radiolabeled tetrazine ([18F]SiFA-Tz). Here, we used TCO-modified bovine serum albumin (BSA) as the model protein, and isotopic exchange (IE) (19F/18F) chemistry as the labeling strategy. The radiolabeling of albumin-TCO with [18F]SiFA-Tz ([18F]6), providing [18F]fluoroalbumin ([18F]10) in high radiochemical yield (99.1 ± 0.2%, n = 3) and a molar activity (MA) of 1.1 GBq/µmol, confirmed the applicability of [18F]6 as a quick in vitro fluorination reagent for the TCO functionalized proteins. While the biological evaluation of [18F]6 demonstrated defluorination in vivo, limiting the utility for pretargeted applications, the in vivo stability of the radiotracer was dramatically improved when [18F]6 was used for the radiolabeling of albumin-TCO ([18F]10) in vitro, prior to administration. Due to the detected defluorination in vivo, structural optimization of the prosthetic group for improved stability is needed before further biological studies and application of pretargeted PET imaging

Efficient cartridge purification for producing high molar activity [18F]fluoro-glycoconjugates via oxime formation

Introduction 18F-fluoroglycosylation via oxime formation is a chemoselective and mild radiolabeling method for sensitive molecules. Glycosylation can also improve the bioavailability, in vivo kinetics, and stability of the compound in blood, as well as accelerate clearance of biomolecules. A typical synthesis procedure for 18F-fluoroglycosylation with [18F]FDG (2-deoxy-2-[18F]fluoro-d-glucose) and [18F]FDR (5-deoxy-5-[18F]fluoro-d-ribose) involves two HPLC (high performance liquid chromatography) purifications: one after 18F-fluorination of the carbohydrate to remove its labeling precursor, and a second one after the oxime formation step to remove the aminooxy precursor. The two HPLC purifications can be time consuming and complicate the adaptation of the synthetic strategy in nuclear medicine applications and automated synthesis. We have developed a procedure in which SPE (solid phase extraction) and resin purification methods replace both of the needed HPLC purification steps. Methods We used [18F]FDR and [18F]FDG as prosthetic groups to radiolabel two aminooxy-modified model molecules, a tetrazine and a PSMA (prostate specific membrane antigen) inhibitor. After fluorination, the excess carbohydrate precursor was removed by derivatizing it with 4,4′-dimethoxytrityl chloride (DMT-Cl). The DMT moiety increases the hydrophobicity of the unreacted precursor making the separation from the fluorinated precursor possible with simple C18 Sep-Pak cartridge. For removal of the aminooxy precursor, we used a commercially available aldehyde resin (AminoLink, Thermo Fisher Scientific). C18 Sep-Pak SPE cartridge was used to separate [18F]FDR and [18F]FDG from the 18F-fluoroglycoconjugate end product. Results [18F]FDR and [18F]FDG were efficiently purified from their precursors, free fluorine-18, and other impurities. The aldehyde resin quantitatively removed the unreacted aminooxy precursors after the oxime formation. The fluorine-18 labeled oxime end products were obtained with high radiochemical purity (>99%) and molar activity (>600 GBq μmol−1). Conclusions We have developed an efficient cartridge purification method for producing high molar activity 18F-glycoconjugates synthesized via oxime formation.Peer reviewe