Genetics and mechanisms of rare inherited neuromuscular disorders : a focus on neurofilament light

Hereditary neuromuscular disorders are a heterogenous group of diseases affecting motor nerves and musculature. The clinical distinction between nerve or muscle originating disorders can be difficult since both neuronal loss and muscle disruption lead to muscle weakness and atrophy. The underlying genetic cause of a neuromuscular disease and its pathological molecular mechanism need to be unraveled to develop disease modifying treatments. Fortunately, next-generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the molecular diagnostics of hereditary diseases. High throughput technologies can be used to efficiently sequence all possible pathogenic variants in an individual’s genome to discover the affected gene. However, the gene variant behind the disorder does not directly indicate the mechanism of disease. To discover treatable processes, the cellular and molecular alterations caused by the mutant gene must be modelled in appropriate systems. In this dissertation I aimed to discover genetic causes behind rare hereditary neuromuscular disease in adult patients, evaluate the efficacy of NGS in this patient group, and model NEFL (neurofilament light) nonsense variants that cause Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease with induced pluripotent stem cell (iPSC) derived motor neurons (iPSC-MN) to discover treatable mechanisms of disease. In a cohort of 100 adult patients, we discovered pathogenic variants in 27% of patients with varied hereditary disorders such as myopathy, neuropathy, spasticity, ataxia, and parkinsonism using clinical whole-exome sequencing (WES). Twelve of the variants in 13 patients were novel changes in known disease-associated genes, thus we expanded the genetic causes and phenotypes of these disorders. I showed WES to be efficient and potentially cost-effective in the molecular diagnosis of adult patients with suspected hereditary origin of disease. In addition, we discovered Finnish patients with previously uncharacterized phenotypes linked to PYROXD1 variants. The Finnish patients had a late-onset limb-girdle muscular dystrophy (LGMD)-like phenotype in contrast to the previously described congenital myopathy with myofibrillar changes. Nonsense variants in the NEFL gene cause a severe, early-onset form of axonal CMT through an uncharacterized mechanism. Studies on dominant NEFL variants indicate the axon degeneration to be caused by mutant protein aggregation, however, the disease mechanism behind nonsense cases is still elusive. I characterized a novel pathogenic recessive nonsense variant p.R367X in NEFL causing CMT. I showed the novel variant to lead to nonsense-mediated decay of mRNA and to neurofilament light polypeptide (NFL) protein loss in iPSC-MN of the patient. We generated isogenic NEFL knockout cell lines from control iPSC to more accurately assay the effects of NFL loss. I characterized the patient and isogenic gene-edited iPSC-MN devoid of NFL and described specific molecular alterations in the neurons. I showed the absence of the integral neurofilament (NF) protein NFL to be causative in recessive NEFL CMT but not to affect iPSC-MN differentiation or the growth of elaborate axonal connections in patient or isogenic gene-edited models. Furthermore, the neurons were able to produce NFs without compensation from other intermediate filament proteins. However, there were fewer NFs and their composition was altered by NFL absence and reduction of neurofilament heavy polypeptide (NFH). The loss of NFL reduced axon diameter, decreased amplitude of miniature post-synaptic currents (EPSCs) and increased movement of axonal mitochondria in iPSC-MNs. Clinical studies on patients and Nefl knockout mouse models have shown similar mechanisms of disease as our iPSC-MN model. The caliber of large axons is also reduced in patients with NEFL nonsense mutations. In the patients the reduction of axon size and loss of large myelinated axons leads to decreased nerve conduction velocity. The synaptic function of NFL has not been previously described in human models, but NFL has been shown to bind glutamatergic receptors in mice. The reduced amplitude in EPSCs suggests a synaptic regulatory role of NFL also in humans warranting further research. The loss of NFL in the synapse could reduce the excitability of spinal motor neurons leading to reduced activity. Increase of mitochondrial movement in axons without NFL adds to previous research on mice indicating NFs and NFL working as scaffolds for organelles in axons. The increase in mitochondrial movement could reduce the amount of correctly localized active mitochondria and lead to local metabolic deficiencies predisposing axons to degeneration. My iPSC-MN modelling studies show the usability of stem cell-based models in studying the mechanisms of axonal neuropathy and its pathological processes. Further research is needed to pinpoint the translatable pathological alterations in the human axons that could be targeted for treatments in patients.Perinnöllisten neuromuskulaaritautien ryhmä on kokoelma lihas- ja hermoperäisiä sairauksia, jotka aiheuttavat liike oireita. Potilaiden kliinisten oireiden perusteella voi olla vaikea erottaa johtuvatko liike oireet hermojen vai lihasten toimintahäiriöstä, sillä molemmat johtavat lihasheikkouteen. Hoitojen kehittämiseksi oireiden perimmäiset syyt ja molekyylitason mekanismit tulee selvittää. Nykyään perinnöllisen sairauden tautimekanismin selvityksessä voidaan käyttää geneettisiä uuden sukupolven sekvensointimenetelmiä, kuten eksomisekvensointia. Näillä menetelmillä pystytään jopa sekvensoimaan potilaan koko genomi ja selvittämään missä geenissä oleva virhe eli mutaatio johtaa taudinkuvaan. Taudin oireiden geneettisen syyn selvitys ei kuitenkaan riitä hoitojen kehittämiseen. Geneettisen muutoksen aikaansaava molekyylitason tautimekanismi tulee selvittää juuri niissä solutyypeissä, jotka kyseisessä taudissa rapistuvat. Tautimekanismin yksityiskohtainen selvitys voi paljastaa prosesseja, joihin voisi vaikuttaa lääkinnällisesti, ja näin hidastaa taudin etenemistä tai estää sen pahentumista. Tämän väitöskirjan tavoitteina on selvittää harvinaisten perinnöllisten neuromuskulaaritautien genetiikkaa, arvioida uuden sukupolven sekvensointimenetelmien tehokkuutta tässä tautiryhmässä ja mallintaa NEFL (neurofilament light) geenin nonsense-mutaatiosta johtuvan aksonirappeumansairauden, Charcot-Marie-Tooth neuropatian (CMT), tautimekanismeja kantasoluista erilaistetuilla liikehermosoluilla. Harvinaisten perinnöllisten neuromuskulaaritautien sekvensointiprojektissa 27 % potilaista sai taudilleen geneettinen syyn eksomisekvensoinnilla. Potilasryhmä koostui 100 potilaasta, joilla oli vaihtelevia taudinkuvia, kuten myopatiaa, neuropatiaa, spastisuutta, ataksiaa ja parkinsonismia. Löysimme kaksitoista uutta mutaatiota kolmeltatoista potilaalta geeneistä, jotka on aiemmin liitetty neuromuskulaaritauteihin. Tutkimukseni osoittaa, että eksomisekvensointi on tehokas menetelmä neurmuskulaaritautien geneettisten syiden selvittämiseksi aikuispotilailla, joilla epäillään perinnöllistä tautia. Tämän lisäksi kuvailin uuden oireenkuvan suomalaisilla myopatiapotilailla, joilla on mutaatioita PYROXD1 (Pyridine Nucleotide-Disulphide Oxidoreductase Domain 1) geenissä. Heidän oireensa alkoivat aikuisiässä ja taudinkuva vastaa limb-girdle tyyppistä lihasdystrofiaa (LGMD), aiemmin kuvatuilla potilailla lihasoireet alkoivat varhaisessa lapsuudessa eivätkä muistuttaneet LGMDtä. NEFL geenissä esiintyvät nonsense-mutaatiot johtavat peittyvästi periytyvään aksonirappeumasairauteen, jossa oireet alkavat tavallisesti lapsuudessa. Peittyvästi periytyvien NEFL muutosten tautimekanismi on yhä selvittämättä. Vallitsevasti periytyvien NEFL muutosten ajatellaan aiheuttavan aksonirappeumaa proteiinin epätavallisen kasautumisen seurauksena. Löysin uuden peittyvästi periytyvä muutoksen p.R367X NEFL geenissä, joka aiheuttaa varhain alkavaa aksonirappeumaa. Tutkin uutta muutosta potilaan soluista tehdyillä kantasoluilla, jotka erilaistin liikehermosoluiksi. Osoitin että vallitsevasti periytyvien muutosten vastaisesti, tämä uusi peittyvästi periytyvä muutos johtaa NEFL lähetti-RNA molekyylin hajotuksen kautta proteiinin (NFL) puutokseen. Mallintaakseni NFL proteiinin puutosta tehokkaasti, poistin NEFL geenin terveistä kantasoluista geenieditoinnilla. Osoitin geenieditoiduilla ja NEFL potilassoluilla, että NFL proteiinin puutos johtaa CMT neuropatiaan, vaikkakin NFL proteiinin puutos ei häirinnyt kantasoluista erilaistettujen liikehermosolujen kypsymistä tai aksonien pituuskasvua. Tämän lisäksi solut pystyivät tuottamaan neurofilamentteja ilman NFL proteiinia. Näiden filamenttien rakenne oli kuitenkin muuttunut ja niitä esiintyi harvemmin. Tutkimukseni paljasti NFL proteiinin puutoksen johtavan kapeampiin aksoneihin, alentuneisiin elektrofysiologisiin vasteisiin synapsissa ja mitokondrioiden liikkeen lisääntymiseen erilaistetuissa liikehermosoluissa. Aiemmat kliiniset tutkimukset NEFL neuropatiapotilailla ja kokeet Nefl poistogeenisillä hiirillä ovat viitanneet NFL proteiinin puutoksen johtavan yllä mainittuihin fenotyyppeihin. Aksonit, ja etenkin myelinoidut aksonit, ovat kapeampia potilailla, joilla on peittyvästi periytyvä neuropatia NEFL geenin mutaation seurauksena. Kapeat aksonit johtavat aktiopotentiaaleja hitaammin hermosolun soomasta aksonien kärkeen, joka johtaa heikompaan lihasvasteeseen ja oireisiin. Osoitin ensimmäistä kertaa ihmissoluilla, että NFL puutos johtaa alentuneisiin synaptisiin elekrofysiologisiin vasteisiin, tämä vaikutus on aiemmin todettu vain Nefl poistogeenisillä hiirimalleilla. Näiden hiirimallien avulla on osoitettu NFL proteiinin tukevan glutamaattireseptorien toimintaa synapsissa. Sillä molemmissa malleissa elektrofysiologiset vasteet ovat alentuneet, myös ihmisillä NFL saattaa tukea synapsin toimintaa. NFL toimintaa synapseissa tulisi tutkia tarkemmin, jotta sen rooli aksonirappeumassa pystyttäisiin todentamaan. Nefl poistogeenisten hiiritutkimusten ja tämän väitöskirjan NFL puutosmallien tulosten perusteella voimme todeta NFL proteiinin toimivan mitokondrioiden ankkurina aksoneissa. Molemmissa malleissa NFL puutos johtaa mitokondrioiden lisääntyneeseen liikkeeseen. Tämä lisääntynyt liike voi vähentää paikallaan olevien aktiivisten mitokondrioiden määrää kriittisissä solunsisäisissä sijainneissa, johtaen paikallisiin energiavajeisiin ja aksonin degeneraatioon. Tämä työ osoittaa, että kantasolupohjaisia hermosolumalleja pystytään hyödyntämään aksonirappeumatautien mallinnuksessa. Tässä väitöskirjassa esitettyjä patologisia molekyylitason mekanismeja perinnöllisissä aksonirappeumasairauksissa tulisi jatkossa tutkia lisää, jotta voisimme paikantaa lääkinnällisiä kohteita taudin oireiden lievittämiseen tai etenemisen pysäyttämiseksi

Legal-historical review of privacy and data protection

Yksityisyys ja tietosuoja ovat nykyisin keskeisiä perusoikeuksia, joita pidetään välttämättöminä nykyaikaisessa demokraattisessa yhteiskunnassa. Samalla yksityisyys on tutkijoille hankala käsite sen moniulotteisuuden sekä kulttuurin ja aikaan sitoutumisensa vuoksi, eikä yleismaailmallista määritelmää yksityisyydelle ole. Tutkielman rakenne ja taustalla oleva teoreettinen viitekehys pohjautuu oikeustieteilijä James Q. Whitmanin teorialle kahdesta yksityisyydestä, jolla hän kuvaa eurooppalaisten ja yhdysvaltalaisten perustavanlaatuisesti eroavaa suhdetta yksityisyyteen. Tutkimuskysymyksenä on selvittää lähdeaineiston avulla niitä tekijöitä, jotka ovat olleet vaikutta-massa yksityisyyden syntyyn ja kehittymiseen Yhdysvalloissa ja Euroopassa. Toisena tutkimuskysymyksenä on selvittää muutostekijöitä Whitmanin kuvaaman eron syntymisen taustalla. Varsinai-sesti yksityisyyden synty oikeutena voidaan ajoittaa yksittäiseen Yhdysvalloissa vuonna 1890 julkaistuun oikeustieteelliseen artikkeliin. Yksityisyyttä merkittävästi uudempi oikeus, tietosuoja, syntyi vasta 1960-luvulla tietotekniikan kehittymisen myötä ensin Yhdysvalloissa ja myöhemmin Euroo-passa. Tutkielmassa tarkastellaan niitä teknologisia ja yhteyskunnallisia muutoksia, joiden seurauksena yksityisyys lopulta tunnistettiin itsenäiseksi oikeudeksi ja lopulta perusoikeudeksi toisen maailman-sodan jälkeen ja miten tämä tapahtui. Tarkastelu tapahtuu kontekstuaalisen oikeushistorian keinoin ja tutkielmassa kuvataan ylätasolla yksityisyyden ja tietosuojan kehityskaari 1800-luvulta 1980-luvulle Yhdysvalloissa ja Euroopassa ja kiinnitetään se luontevilta vaikuttaviin käännepisteisiin. Näitä käännepisteitä tutkielmassa hahmotellaan sen selvittämiseksi, miten yksityisyys oikeudellise-na käsitteenä syntyi uuden ajan alussa common law’n puitteissa Englannissa ja siirtyi siirtolaisten mukana Yhdysvaltoihin ja miten tietosuoja syntyi Atlantin molemmin puolin

Toksisuustestauksen soveltuvuus suomalaisten yhdyskuntajätevesien tarkkailuun ja haitallisten aineiden riskinarviointiin

Yhdyskuntajätevedenpuhdistamolle tuleva jätevesi on laadultaan vaihtelevaa ja harvoin pelkästään kotitalouksien jätevettä. Viemäreihin päätyy lukuisia kemiallisia yhdisteitä, joiden kemiallisia ja biologisia ominaisuuksia ei tunneta. Tässä raportissa käsitellään jätevesien haitallisuuden arviointia biologisia menetelmiä käyttäen, esitellään käytettävissä olevia menetelmiä sekä luodaan katsaus näiden menetelmien käyttöön eri maissa. Raportin lopussa ehdotetaan eräitä jatkotoimenpiteitä, joilla voitaisiin edistää jätevesien haittavaikutusten arviointia ja pyrkiä ennalta ehkäisemään ympäristön pilaantumista. Myrkyllisyystestien ja muiden biologisten menetelmien käyttöä suositellaan tarkkailumenetelmäksi kemiallisten analyysien ohella, puhdistusprosessien toimivuuden seurannan ja kehittämisen apuna, puhdistamoon tulevien vesien laadun tarkkailussa ja tuntemattomien haitta-aineiden jäljittämisessä. Raportissa pyritään tuomaan esiin biologisten menetelmien edut ja mahdollisuudet, kehittämistarpeet sekä rajoitukset, joita niihin liittyy

One dose of preoperative, intravenous, prophylactic antibiotics significantly lowers postoperative infection rate in septoplasty—a study of 772 operations

Publisher Copyright: © 2021 John Wiley & Sons LtdObjectives Postoperative infection is the most common complication after septoplasty. Pre- or postoperative prophylactic antibiotics are commonly used, although no official guidelines exist. Design We retrospectively collected data on postoperative infections from 772 septoplasties performed in 2015, 2016 and 2018, and classified the infections according to surgical site infection (SSI) criteria by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). We evaluated the infections according to antibiotic use (preoperative or postoperative, both, or none) and accounted for patient and surgical confounding factors. We compared the results with three previous studies from our department to find out the trend in the occurrence of postoperative infections and in the use of antibiotics. Results Twenty-nine cases (3.8%) fulfilled CDC infection criteria. Any kind of antibiotic prophylaxis reduced the risk of SSI (p = .018). One dose of intravenous cefuroxime before incision was the most effective preventive measure (p = .045). We found no significant effect of postoperative antibiotics. However, postoperative antibiotics lowered the infection rate to 1.8% compared to 6.1% among those not treated with any antibiotics. The only other factor reducing the risk of SSI was local anaesthesia compared with general anaesthesia. Conclusion Preoperative antibiotic prophylaxis effectively reduced postoperative infection rate after septoplasty.Peer reviewe

Absence of NEFL in patient-specific neurons in early-onset Charcot-Marie-Tooth neuropathy

Objective: We used patient-specific neuronal cultures to characterize the molecular genetic mechanism of recessive nonsense mutations in neurofilament light (NEFL) underlying early-onset Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease. Methods: Motor neurons were differentiated from induced pluripotent stem cells of a patient with early-onset CMT carrying a novel homozygous nonsense mutation in NEFL. Quantitative PCR, protein analytics, immunocytochemistry, electron microscopy, and single-cell transcriptomics were used to investigate patient and control neurons. Results: We show that the recessive nonsense mutation causes a nearly total loss of NEFL messenger RNA (mRNA), leading to the complete absence of NEFL protein in patient's cultured neurons. Yet the cultured neurons were able to differentiate and form neuronal networks and neurofilaments. Single-neuron gene expression fingerprinting pinpointed NEFL as the most downregulated gene in the patient neurons and provided data of intermediate filament transcript abundancy and dynamics in cultured neurons. Blocking of nonsense-mediated decay partially rescued the loss of NEFL mRNA. Conclusions: The strict neuronal specificity of neurofilament has hindered the mechanistic studies of recessive NEFL nonsense mutations. Here, we show that such mutation leads to the absence of NEFL, causing childhood-onset neuropathy through a loss-of-function mechanism. We propose that the neurofilament accumulation, a common feature of many neurodegenerative diseases, mimics the absence of NEFL seen in recessive CMT if aggregation prevents the proper localization of wild-type NEFL in neurons. Our results suggest that the removal of NEFL as a proposed treatment option is harmful in humans.Peer reviewe

Effectiveness of clinical exome sequencing in adult patients with difficult-to-diagnose neurological disorders

Objectives Clinical diagnostics in adults with hereditary neurological diseases is complicated by clinical and genetic heterogeneity, as well as lifestyle effects. Here, we evaluate the effectiveness of exome sequencing and clinical costs in our difficult-to-diagnose adult patient cohort. Additionally, we expand the phenotypic and genetic spectrum of hereditary neurological disorders in Finland. Methods We performed clinical exome sequencing (CES) to 100 adult patients from Finland with neurological symptoms of suspected genetic cause. The patients were classified as myopathy (n = 57), peripheral neuropathy (n = 16), ataxia (n = 15), spastic paraplegia (n = 4), Parkinsonism (n = 3), and mixed (n = 5). In addition, we gathered the costs of prior diagnostic work-up to retrospectively assess the cost-effectiveness of CES as a first-line diagnostic tool. Results The overall diagnostic yield of CES was 27%. Pathogenic variants were found for 14 patients (in genes ANO5, CHCHD10, CLCN1, DES, DOK7, FKBP14, POLG, PYROXD1, SCN4A, TUBB3, and TTN) and likely pathogenic previously undescribed variants for 13 patients (in genes ABCD1, AFG3L2, ATL1, CACNA1A, COL6A1, DYSF, IRF2BPL, KCNA1, MT-ATP6, SAMD9L, SGCB, and TPM2). Age of onset below 40 years increased the probability of finding a genetic cause. Our cost evaluation of prior diagnostic work-up suggested that early CES would be cost-effective in this patient group, in which diagnostic costs increase linearly with prolonged investigations. Conclusions Based on our results, CES is a cost-effective, powerful first-line diagnostic tool in establishing the molecular diagnosis in adult neurological patients with variable symptoms. Importantly, CES can markedly shorten the diagnostic odysseys of about one third of patients.Peer reviewe

Attitudes towards genetic testing and information : does parenthood shape the views?

This study examines how parents of pediatric patients might differ in their views and attitudes towards genetic technology and information when compared to adult patients. There is surprisingly little evidence on how parents compare to other parts of population in their attitudes. Previous empirical studies often relate health-related preferences and attitudes to factors such as age, education, and income instead of parental status, thus evading comparison of parents to others as health-related decision makers. Findings related to the parental status can be useful when implementing genetic technology in clinical practice. We conducted a survey of views on genetic technology and information for groups of adult neurology patients (n = 68) and parents of pediatric neurology patients (n = 31) to shed some light on this issue. In addition to our own survey instrument, we conducted other surveys to gain insight on psychosocial factors that might affect these attitudes. The results suggest that parents are more concerned about their children's genetic risk factors when compared to the attitudes of adult patients about their own risk. For both groups, negative emotional state was associated with more concerns towards genetic information. Our study provides insights on how parental views might affect the acceptance of genetic technology and information.Peer reviewe

Recessive PYROXD1 mutations cause adult-onset limb-girdle-type muscular dystrophy

Peer reviewe

ALS and Parkinson's disease genes CHCHD10 and CHCHD2 modify synaptic transcriptomes in human iPSC-derived motor neurons

Mitochondrial intermembrane space proteins CHCHD2 and CHCHD10 have roles in motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy and axonal neuropathy and in Parkinson's disease. They form a complex of unknown function. Here we address the importance of these two proteins in human motor neurons. We show that gene edited human induced pluripotent stem cells (iPSC) lacking either CHCHD2 or CHCHD10 are viable and can be differentiated into functional motor neurons that fire spontaneous and evoked action potentials. Mitochondria in knockout iPSC and motor neurons sustain ultrastructure but show increased proton leakage and respiration, and reciprocal compensatory increases in CHCHD2 or CHCHD10. Knockout motor neurons have largely overlapping transcriptome profiles compared to isogenic control line, in particular for synaptic gene expression. Our results show that the absence of either CHCHD2 or CHCHD10 alters mitochondrial respiration in human motor neurons, inducing similar compensatory responses. Thus, pathogenic mechanisms may involve loss of synaptic function resulting from defective energy metabolism.Peer reviewe