Mapping of amino acid residues on the hepatitis B virus capsid involved in its envelopment

Während der Morphogenese des Hepatitits-B-Virus (HBV) wird das cytosolisch gebildete Nukleokapsid, welches u.a. das virale Genom enthält, durch Interaktion mit den transmembran lokalisierten viralen Hüllproteinen an zellulären Membranen umhüllt und erscheint anschließend als Virion im ER-Lumen, von wo aus es aus einer infizierten Leberzelle sekretiert wird. Hierfür wird ein direkter Kontakt des Kapsids mit den Hüllproteinen postuliert. Seit einiger Zeit ist die Kristallstruktur eines rekombinanten HBV-Kapsids bekannt. In dieser Arbeit wurden 52 einzelne Alaninsubstitutionen von Aminosäureseitenketten hergestellt, die auf der Oberfläche des Kapsids lokalisiert sind und mögliche Kontaktstellen für die Hüllproteine darstellen. Die Phenotypen der Mutationen hinsichtlich Virionbildung wurden anschließend durch Transkomplementation eines corenegativen HBV-Genoms nach transienter Transfektion in Leberzellen, Immunpräzipitation von Kapsiden und Virionen sowie radioaktiver Markierung des viralen Genoms durch die endogene Polymerase Reaktion (EPR) charakterisiert. 13 der Punktmutationen erschienen Negativ im Nachweis von Nukleokapsiden durch die EPR. 28 Mutationen zeigten einen Wildtyp-Phänotyp; hier wurden sowohl zelluläre Nukleokapside als auch sekretierte Virionen nachgewiesen. 11 Mutationen zeigten den gesuchten Phänotyp: Es konnten zwar zelluläre Nukleokapside jedoch keine sekretierten Virionen nachgewiesen werden. Die Positionen dieser Punktmutationen zeigten zwei Kluster auf der Oberfläche des Kapsids auf. Beide Bereiche dieser Kluster stellen potentielle Kontaktstellen zu den viralen Hüllproteinen dar.Es gibt derzeit noch keine Zelllinie, die sich mit Hepatitis-B-Viren infizieren lässt. Der hierfür notwendige HBV-Rezeptor ist bisher noch unbekannt. Jedoch führt die Transfektion von viralem Genom in Leberzellen zur Bildung von infektiösen Virionen, so dass anzunehmen ist, dass die frühen Prozesse des Infektionszyklus in kultivierten Leberzelllinien gestört sind. Es wird vermutet, dass durch Inkulturnahme von Leberzellen der virale Rezeptor verloren gegangen ist, was möglicherweise durch Expression eines künstlichen Rezeptors für Virusbindung und Aufnahme wiederhergestellt werden kann. Zur Herstellung eines solchen Rezeptors wurde die cDNA der schweren und leichten Kette eines monoklonalen PräS1-Antikörpers MA18/7 gegen die Hüllproteine mittels RT-PCR aus einer Maus-Hybridomzelllinie kloniert. Die schwere Kette wurde mit der Transmembrandomäne eines IgD fusioniert. Es konnte gezeigt werden, dass nach transienter Transfektion beide Ketten stabil in Leberzellen expremiert wurden, dass dieses künstliche Rezeptorkonstrukt in der Zellmembran lokalisiert war und nach außen zeigte. Die Inkubation MA18/7 transfizierter Zellen mit HBV-Virionen zeigte zwar eine Bindung an der Zelloberfläche, führte jedoch nicht zu einer Infektion

Hepatitis B Virus Particle Formation in the Absence of Pregenomic RNA and Reverse Transcriptase

Cytoplasmic hepatitis B virus (HBV) capsids are not enveloped and secreted unless the packaged RNA pregenome is reverse transcribed. The expression of the capsid protein C, together with envelope proteins in the absence of pregenomic RNA, produced normal amounts of intracellular capsids, but the secretion of virion-like particles was greatly reduced. The I97L C protein mutant, allowing immature nucleocapsid envelopment in the background of an HBV genome, did not promote the envelopment of capsids lacking a pregenome, suggesting that this mutation is not sufficient to induce secretion competence independently of the pregenome

High Affinity, Developability and Functional Size: The Holy Grail of Combinatorial Antibody Library Generation

Since the initial description of phage display technology for the generation of human antibodies, a variety of selection methods has been developed. The most critical parameter for all in vitro-based approaches is the quality of the antibody library. Concurrent evolution of the libraries has allowed display and selection technologies to reveal their full potential. They come in different flavors, from naïve to fully synthetic and differ in terms of size, quality, method of preparation, framework and CDR composition. Early on, the focus has mainly been on affinities and thus on library size and diversity. Subsequently, the increased awareness of developability and cost of goods as important success factors has spurred efforts to generate libraries with improved biophysical properties and favorable production characteristics. More recently a major focus on reduction of unwanted side effects through reduced immunogenicity and improved overall biophysical behavior has led to a re-evaluation of library design

Characterization of Binding Mode of Action of a Blocking Anti-Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)‑B Monoclonal Antibody, MOR8457, Reveals Conformational Flexibility and Avidity Needed for PDGF-BB To Bind PDGF Receptor‑β

Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) is an important mitogen and cell survival factor during development. PDGF-BB binds PDGF receptor-β (PDGFRβ) to trigger receptor dimerization and tyrosine kinase activation. We present the pharmacological and biophysical characterization of a blocking PDGF-BB monoclonal antibody, MOR8457, and contrast this to PDGFRβ. MOR8457 binds to PDGF-BB with high affinity and selectivity, and prevents PDGF-BB induced cell proliferation competitively and with high potency. The structural characterization of the MOR8457-PDGF-BB complex indicates that MOR8457 binds with a 2:1 stoichiometry, but that binding of a single MOR8457 moiety is sufficient to prevent binding to PDGFRβ. Comparison of the MOR8457-PDGF-BB structure with that of the PDGFRβ-PDGF-BB complex suggested the potential reason for this was a substantial bending and twisting of PDGF-BB in the MOR8457 structure, relative to the structures of PDGF-BB alone, bound to a PDGF-BB aptamer or PDGFRβ, which makes it nonpermissive for PDGFRβ binding. These biochemical and structural data offer insights into the permissive structure of PDGF-BB needed for agonism as well as strategies for developing specific PDGF ligand antagonists

Characterization of activating mutations of NOTCH3 in T cell acute lymphoblastic leukemia and anti-leukemic activity of NOTCH3 inhibitory antibodies

Notch receptors have been implicated as oncogenic drivers in several cancers, the most notable example being NOTCH1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). To characterize the role of activated NOTCH3 in cancer, we generated an antibody that detects the neo-epitope created upon gamma-secretase cleavage of NOTCH3 to release its intracellular domain (ICD3), and sequenced the negative regulatory region (NRR) and PEST domain coding regions of NOTCH3 in a panel of cell lines. We also characterize NOTCH3 tumor-associated mutations that result in activation of signaling and report new inhibitory antibodies. We determined the structural basis for receptor inhibition by obtaining the first co-crystal structure of a NOTCH3 antibody with the NRR protein and defined two distinct epitopes for NRR antibodies. The antibodies exhibit potent anti-leukemic activity in cell lines and tumor xenografts harboring NOTCH3 activating mutations. Screening of primary T-ALL samples reveals that two of 40 tumors examined show active NOTCH3 signaling. We also identified evidence of NOTCH3 activation in 12 of 24 patient-derived orthotopic xenograft models, two of which exhibit activation of NOTCH3 without activation of NOTCH1. Our studies provide additional insights into NOTCH3 activation and offer a path forward for identification of cancers that are likely to respond to therapy with NOTCH3 selective inhibitory antibodies