Duplications of KIAA1549 and BRAF screening by Droplet Digital PCR from formalin-fixed paraffin-embedded DNA is an accurate alternative for KIAA1549-BRAF fusion detection in pilocytic astrocytomas

Pilocytic astrocytomas represent the most common glioma subtype in young patients and account for 5.4% of all gliomas. They are characterized by alterations in the RAS–MAP kinase pathway, the most frequent being a tandem duplication on chromosome 7q34 involving the BRAF gene, resulting in oncogenic BRAF fusion proteins. BRAF fusion involving the KIAA1549 gene is a hallmark of pilocytic astrocytoma, but it has also been recorded in rare cases of gangliogliomas, 1p/19q co-deleted oligodendroglial tumors, and it is also a common feature of disseminated oligodendroglial-like leptomeningeal neoplasm. In some difficult cases, evidence for KIAA1549-BRAF fusion is of utmost importance for the diagnosis. Moreover, because the KIAA1549-BRAF fusion constitutively activates the MAP kinase pathway, it represents a target for drugs such as MEK inhibitors, and therefore, the detection of this genetic abnormality is highly relevant in the context of clinical trials applying such new approaches. In the present study, we aimed to use the high sensitivity of Droplet Digital PCR (DDPCR™) to predict KIAA1549-BRAF fusion on very small amounts of formalin-fixed paraffin-embedded tissue in routine practice. Therefore, we analyzed a training cohort of 55 pilocytic astrocytomas in which the KIAA1549-BRAF fusion status was known by RNA sequencing used as our gold standard technique. Then, we analyzed a prospective cohort of 40 pilocytic astrocytomas, 27 neuroepithelial tumors remaining difficult to classify (pilocytic astrocytoma versus ganglioglioma or diffuse glioma), 15 dysembryoplastic neuroepithelial tumors, and 18 gangliogliomas. We could demonstrate the usefulness and high accuracy (100% sensitivity and specificity when compared to RNA sequencing) of DDPCR™ to assess the KIAA1549-BRAF fusion from very low amounts of DNA isolated from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. BRAF duplication is both necessary and sufficient to predict this fusion in most cases and we propose that this single analysis could be used in routine practice to save time, money, and precious tissue

Responses of Nicotiana tabacum cells to microbial molecule treatments : early signaling events, influence of membrane dynamics, and sugar fluxes

Dans son environnement la plante est confrontée à une variété de microorganismes bénéfiques, neutres et pathogènes, qui sont fortement dépendants des ressources carbonées qu’elle libère dans le sol. Le transport de sucres, processus clé de la physiologie de la plante, est essentiel pour les interactions plantes-microorganismes et leur devenir. Au cours de l'évolution, les plantes ont acquis des mécanismes leur permettant de percevoir les signaux microbiens du milieu extérieur, et aboutissant à la transduction d’un signal spécifique puis à des réponses biologiques adaptées (défense versus mutualisme) à la stratégie du microorganisme. Ces réponses assurent la survie et le développement des plantes. Mes travaux de thèse, menés avec un système « d’interaction » simplifié, contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents au déterminisme des interactions plantes-microorganismes. Ce système a permis d’étudier, sur des suspensions cellulaires de N. tabacum, les réponses cellulaires précoces déclenchées suite à la perception de molécules microbiennes provenant de microorganismes à stratégie pathogène avirulent ou à stratégie mutualiste. Nous avons mesuré des évènements de signalisation et des flux de sucres induits en réponse à ces molécules microbiennes. Nos résultats ont mis en évidence que les chitotétrasaccharides (CO4), sécrétés par les champignons mycorhiziens à arbuscules dans les stades pré-symbiotiques de l’interaction, mobilisent les mêmes événements de signalisation précoce (H2O2 dépendant de la protéine rbohD, Ca2+ cytosolique, activation de MAPK) que la cryptogéine, un éliciteur des réactions de défense ; mais avec des réponses différentes en terme d’intensité et de cinétique. Les CO4 et la cryptogéine ont par ailleurs montré des impacts distincts sur les flux de sucres et l’expression de transporteurs impliqués. En complément nous avons montré un effet de la modification de la dynamique membranaire associée à la clathrine sur des évènements de signalisation déclenchés par la cryptogéine, ainsi que dans les flux entrants de sucres et l’expression de gènes de transporteurs de sucres. Enfin, l’analyse in silico de l’interactome de transporteurs de sucres chez la plante modèle A. thaliana, nous a permis d’apporter des connaissances supplémentaires quant aux évènements de régulations des transporteurs de sucres et l’identification de protéines régulatrices putatives en interaction avec ces derniers. L’ensemble de ces travaux ouvrent la voie à de nouvelles recherches visant à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la mise en place des interactions entre plantes et microorganismes.In their natural environment plants are in close interaction with beneficial, neutral, or pathogenic microbes, which are highly dependent on carbon resources exuded by plant roots. Sugar transport, which is a key process of plant physiology, is essential to support the fate of plant-microbe interactions. During evolution, plants have acquired the ability to perceive microbial molecules, initiating specific signal transduction cascades and leading to adapted response for microbe lifestyles (avirulent, virulent, or benefic). Plant survival will depend on the nature of the induced mechanisms. My PhD work, carried out on a simplified experimental system, contributes to the understanding of mechanisms underlying the determinism of plant-microbe interactions. We used Nicotiana tabacum cells in suspension exposed to microbial molecules derived from mutualistic or avirulent microbes. Using such a simplified system, we analyzed elements of the early signaling cascade and sugar fluxes. We have shown that CO4, which is originating from AMF, initiate early signaling components (rbohD-dependent H2O2, cytosolic Ca2+, MAPK activation) as cryptogein, a defense elicitor, but with distinct profile and amplitude. Those two molecules (CO4 and cryptogein) are responsible of different effects on sugar fluxes and the expression of the underlying sugar transporter genes. In addition, we presented an impact of the alteration of clathrin-mediated process on early signaling events triggered by cryptogein, as well as inward sugar fluxes and expression of sugar transporter genes. Finally, in silico analyses of sugar transporter interactome in Arabidopsis thaliana has provided some possible regulation mechanisms through the identification of new candidate proteins involved in sugar transporter regulation. These information open new perspectives towards a better understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in plant-microbe interactions

Étude de la régulation des calmodulines de Nicotiana tabacum par le monoxyde d’azote

Rapport de stage de Master II R SPE IPMMaste

Réponses des cellules de Nicotiana tabacum à des molécules microbiennes : évènements de signalisation précoce, influence de la dynamique membranaire et flux de sucres

In their natural environment plants are in close interaction with beneficial, neutral, or pathogenic microbes, which are highly dependent on carbon resources exuded by plant roots. Sugar transport, which is a key process of plant physiology, is essential to support the fate of plant-microbe interactions. During evolution, plants have acquired the ability to perceive microbial molecules, initiating specific signal transduction cascades and leading to adapted response for microbe lifestyles (avirulent, virulent, or benefic). Plant survival will depend on the nature of the induced mechanisms. My PhD work, carried out on a simplified experimental system, contributes to the understanding of mechanisms underlying the determinism of plant-microbe interactions. We used Nicotiana tabacum cells in suspension exposed to microbial molecules derived from mutualistic or avirulent microbes. Using such a simplified system, we analyzed elements of the early signaling cascade and sugar fluxes. We have shown that CO4, which is originating from AMF, initiate early signaling components (rbohD-dependent H2O2, cytosolic Ca2+, MAPK activation) as cryptogein, a defense elicitor, but with distinct profile and amplitude. Those two molecules (CO4 and cryptogein) are responsible of different effects on sugar fluxes and the expression of the underlying sugar transporter genes. In addition, we presented an impact of the alteration of clathrin-mediated process on early signaling events triggered by cryptogein, as well as inward sugar fluxes and expression of sugar transporter genes. Finally, in silico analyses of sugar transporter interactome in Arabidopsis thaliana has provided some possible regulation mechanisms through the identification of new candidate proteins involved in sugar transporter regulation. These information open new perspectives towards a better understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in plant-microbe interactions.Dans son environnement la plante est confrontée à une variété de microorganismes bénéfiques, neutres et pathogènes, qui sont fortement dépendants des ressources carbonées qu’elle libère dans le sol. Le transport de sucres, processus clé de la physiologie de la plante, est essentiel pour les interactions plantes-microorganismes et leur devenir. Au cours de l'évolution, les plantes ont acquis des mécanismes leur permettant de percevoir les signaux microbiens du milieu extérieur, et aboutissant à la transduction d’un signal spécifique puis à des réponses biologiques adaptées (défense versus mutualisme) à la stratégie du microorganisme. Ces réponses assurent la survie et le développement des plantes. Mes travaux de thèse, menés avec un système « d’interaction » simplifié, contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents au déterminisme des interactions plantes-microorganismes. Ce système a permis d’étudier, sur des suspensions cellulaires de N. tabacum, les réponses cellulaires précoces déclenchées suite à la perception de molécules microbiennes provenant de microorganismes à stratégie pathogène avirulent ou à stratégie mutualiste. Nous avons mesuré des évènements de signalisation et des flux de sucres induits en réponse à ces molécules microbiennes. Nos résultats ont mis en évidence que les chitotétrasaccharides (CO4), sécrétés par les champignons mycorhiziens à arbuscules dans les stades pré-symbiotiques de l’interaction, mobilisent les mêmes événements de signalisation précoce (H2O2 dépendant de la protéine rbohD, Ca2+ cytosolique, activation de MAPK) que la cryptogéine, un éliciteur des réactions de défense ; mais avec des réponses différentes en terme d’intensité et de cinétique. Les CO4 et la cryptogéine ont par ailleurs montré des impacts distincts sur les flux de sucres et l’expression de transporteurs impliqués. En complément nous avons montré un effet de la modification de la dynamique membranaire associée à la clathrine sur des évènements de signalisation déclenchés par la cryptogéine, ainsi que dans les flux entrants de sucres et l’expression de gènes de transporteurs de sucres. Enfin, l’analyse in silico de l’interactome de transporteurs de sucres chez la plante modèle A. thaliana, nous a permis d’apporter des connaissances supplémentaires quant aux évènements de régulations des transporteurs de sucres et l’identification de protéines régulatrices putatives en interaction avec ces derniers. L’ensemble de ces travaux ouvrent la voie à de nouvelles recherches visant à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la mise en place des interactions entre plantes et microorganismes

Dynamique membranaire associée au transport de sucres lors des interactions plantes-microorganismes

National audienceLa plante contrôle la population de microorganismes présents dans et autour des racines par le biais de l’exsudation de sucres issus des photosynthétats. Le type d’interaction entre plantes et microorganismes est en lien avec les échanges trophiques existant entre eux. Lors de la symbiose mutualiste mycorhizienne, la plante bénéficie d’un apport de nutriments (phosphate, azote, …) par le partenaire fongique, qui en échange reçoit des sucres. Dans une relation plante/pathogène, le microorganisme va, au contraire, détourner les sucres apportés par la plante sans contrepartie. Au-delà du rôle de source de carbone dans les interactions plantes/microorganismes (IPM), les sucres agissent également comme des molécules de signalisation. Malgré l’identification des protéines responsables du transport de sucres aux interfaces biotrophes, les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les microorganismes (mutualistes et pathogènes) exploitent la distribution des sucres produits par la plante sont encore mal connus. Pour cela, nous souhaitons caractériser la dynamique membranaire végétale en lien avec le transport de sucres au cours des IPM (pathogènes ou mutualistes). Le projet sera d’abord mené sur des suspensions cellulaires de Nicotiana tabacum, afin d’analyser les flux de sucres (glucose et saccharose) au travers de la membrane plasmique végétale des cellules soumises à diverses molécules microbiennes (éliciteurs, effecteurs et/ou facteurs stimulant la mycorhization). Puis, nous rechercherons, par criblage des bases géniques, les transporteurs de sucres du tabac. Ensuite nous suivrons par RT-qPCR l’expression des principaux candidats dans nos cellules. Enfin, nous analyserons la localisation intracellulaire des transporteurs sélectionnés, et observerons leurs dynamiques membranaires en réponse aux différentes molécules microbiennes. Dans une seconde étape, le projet sera développé et les résultats seront validés sur plante entière en interaction avec des champignons mycorhiziens et pathogènes

Dynamique membranaire associée au transport de sucres dans les interactions plantes microorganismes

National audiencePar le biais de l’exsudation de sucres issus de la photosynthèse, la plante contrôle la population de microorganismes bénéfiques et pathogènes présents dans la rhizosphère. Audelà du rôle de source de carbone, les sucres peuvent également agir en tant que molécules de signalisation essentielles à la physiologie et au développement de la plante, mais aussi dans les réponses aux stress biotiques et abiotiques. Le type d’interaction entre les plantes et les microorganismes (IPM) est en lien direct avec les échanges trophiques existant entre les deux partenaires. Lors de la symbiose mutualiste mycorhizienne, la plante bénéficie d’un apport de nutriments (phosphate, azote...) par le partenaire fongique, qui en échange reçoit des sucres. Dans une relation plante/pathogène, le microorganisme va, au contraire, détourner les sucres apportés par la plante sans contrepartie. Malgré l’identification des protéines responsables du transport de sucres aux interfaces biotrophes, les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les micro-organismes (mutualistes et pathogènes) exploitent la distribution des sucres produits par la plante sont encore mal connus à ce jour. Pour cela, nous souhaitons caractériser la dynamique membranaire végétale en lien avec le transport de sucres au cours des IPM (pathogènes ou mutualistes), chez Nicotiana tabacum. Le projet est d’abord mené sur des suspensions cellulaires de tabac, afin d’analyser les flux de sucres (saccharose, glucose et fructose) au travers de la membrane plasmique végétale des cellules soumises à diverses molécules microbiennes (éliciteurs, facteurs stimulant la mycorhization). En parallèle, nous identifions par criblage des bases de données de gènes et de protéines, les transporteurs de sucres putatifs du tabac. Cette étape sera suivie par l'analyse de l'expression par RT-qPCR des principaux candidats exprimés dans nos cellules. Enfin, nous analyserons la localisation intracellulaire de transporteurs sélectionnés afin d'observer leurs régulations par dynamique membranaire, en réponse à des microorganismes ou des molécules microbiennes. Dans une seconde étape, le projet sera développé et les résultats seront validés sur plante entière, où les racines seront en interaction avec des molécules microbiennes ou des champignons mycorhiziens et pathogènes

Analyse des interactions trophiques entre les plantes et les microorganismes par des biosenseurs de sucres

National audienc

Membrane dynamics of sugar transports in plant-microbe interactions

National audiencePlants can influence populations of mutualistic and pathogenic microorganisms present in their rhizosphere through exudation of sugars, a carbon source crucial for their growth and development. Beside their nutritional role, sugars could act as signaling molecules in plant-microorganism interactions. Mycorrhizal symbiosis is a mutualistic association in which the plant receives mineral nutrients (phosphate, nitrogen...) by the fungal partner, which in return receives sugars. In a pathogenic association, the microorganism diverts sugars provided by the plant without any compensation. Microorganisms are thus able to manipulate the host to modify fluxes of sugar(s). Despite the identification of sugar transport proteins at biotrophic interfaces, molecular and cellular mechanisms by which microorganisms operate the distribution of sugars produced by plants are still poorly understood. In this context, we aim to characterize plant membrane dynamics related to the transport of sugars in mutualistic and pathogenic interactions. The project is first conducted on Nicotiana tabacum cell suspension to analyze sugar flows (sucrose and glucose) through the plasma membrane of WT and endocytosis affected mutant cells subjected to various microbial molecules (e.g. defense elicitors, mycorrhizal factors). Secondly, tobacco sugar transporters are identified by screening gene and protein databases, and characterized by expression analysis to select leading candidates. Finally, selected carriers will be localized at the cellular level and their dynamic into the membrane system will be followed in response to mutualistic and pathogenic microorganisms or microbial molecules

Membrane dynamics of sugar transports in tobacco-microbe interactions

SPEINRAUBIPM DOCTPlants can influence microorganism population through exudation of sugars notably as carbon source. Indeed, the type of plant-microorganism interaction (PMI) is linked to the trophic exchanges between plant and microorganism. Microorganisms are thus able to “manipulate” the host to modify sugar fluxes. In mycorrhizal symbiosis, the plant has a supply of nutrients by the fungal partner, which in return receives sugars. In pathogenic relationship, the microorganism will divert sugars provided by the plant without compensation. Despite identification of sugar transporters at biotrophic interfaces, molecular and cellular mechanisms by which microorganisms operate the distribution of sugars are poorly understood. Our aim is to characterize plant membrane dynamics related to sugar transport in PMI. The project is conducted on various tobacco cell suspensions. First, we analyzed cell responses to different microbial molecule treatments (mycorrhizal factors and elicitor). Secondly, we measured uptake of sugars in cells upon microbial molecules. Then, we followed expression of genes encoding sugar transporters in response to microbial molecules using screening gene and protein databases of tobacco sugar transporters