Towards the identification of miRNAs targeting the translational machinery as novel cancer therapeutics

Increased protein production is a prerequisite for cell proliferation, thus rendering translation and ribosome deregulation a common hallmark of cancer cell biology. A frequently observed mechanism in malignancies is the overactivation of the translational process. As a consequence, strategies that selectively target the ribosomal machinery bear significant promise as cancer therapeutic approaches. To this end, this report provides a workflow for the identification of novel miRNA molecules with the ability to target and suppress ribosomal activity in cancer cells

Mediterranean diet related metabolite profiles and cognitive performance

Σκοπός: Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις πως η τήρηση της μεσογειακής διατροφής (MEDAS) ίσως συνεισφέρει σε καλύτερη γνωστική λειτουργία. Παρόλα αυτά, ο μηχανισμός αυτός δεν έχει τεκμηριωθεί. Αντικείμενο: Αποτυπώσαμε ένα μεταβολομικό προφίλ για την τήρηση της μεσογειακής διατροφής υπολογίζοντας τις συγχρονικές σχέσεις του με τις γνωστικές λειτουργίες. Μέθοδοι: Ένα σύνολο από 1250 υγιείς μεσήλικες Έλληνες από την Μελέτη Υγείας Ηπείρου (EHS) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση. Η τήρηση της μεσογειακής διατροφής αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το ερωτηματολόγιο 14 ερωτήσεων Mediterranean Diet Adherence Screener (MEDAS). Οι γνωστικές λειτουργίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τους γνωστικούς ελέγχους της προσοχής και εκτελεστικής γνωστικής ικανότητας αποτελούμενους από 2 μέρη (Trail Making Test), της προφορικής δοκιμής μνήμης ύστερης ανάκλασης αποτελούμενους από 2 μέρη (Verbal Fluency Test) και της εκτελεστικής γνωστικής ικανότητας βασιζόμενη στην λεκτική ευχέρεια (Logical Memory Test). Μία στοχευόμενη συλλογή μεταβολιτών (m=250) συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας μία υψηλής απόδοσης πλατφόρμα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR Platform). Με τη χρήση του Elastic Net Penalized Regression και με διπλό 10-Fold Cross-Validation, εκτιμήθηκε το μεταβολομικό προφίλ του MEDAS. Αξιολογήθηκαν οι σχέσεις του μεταβολομικού προφίλ και των γνωστικών λειτουργιών με πολύ-παραγοντικά μοντέλα παλινδρόμησης. Αποτελέσματα: Προέκυψε ένα μετοβολομικό προφίλ με 42 μεταβολίτες αποτελούμενο κυρίως από υποκατηγορίες λιποπρωτεϊνών και λιπαρών οξέων. Η συσχέτιση με το MEDAS είναι σημαντική (Pearson=0.35,p-value=5.5x10-37). Έπειτα από γνωστούς συγχυτικούς παράγοντες και διορθώνοντας για πολλαπλές συγκρίσεις, το μεταβολομικό προφίλ του MEDAS δεν σχετιζόταν σημαντικά με τις γνωστικές λειτουργίες. Κατακλείδα: Το μεταβολομικό προφίλ πλάσματος σχετιζόμενο με την Μεσογειακή Διατροφή δεν σχετίζεται με τις γνωστικές λειτουργίες του μεσήλικα μεσογειακού πληθυσμού.Background: A growing body of evidence suggests that adherence to the Mediterranean diet (MedDiet) may contribute to better cognitive performance. However, the underlying mechanisms are not clear. Objective: We created a metabolite profile for adherence to MedDiet and evaluated its cross-sectional association with cognitive performance. Methods: A total of 1250 healthy Greek middle-aged adults from the Epirus Health Study cohort were included in the analysis. Adherence to the MedDiet was assessed using the 14-point Mediterranean Diet Adherence Screener (MEDAS), and cognition was measured using the Trail Making Test, the Verbal Fluency test and the Logical Memory test. A targeted metabolite profiling (n = 250 metabolites) approach was applied using a high-throughput nuclear magnetic resonance platform. We used elastic net regularized regressions with a 10-fold cross-validation procedure to identify a metabolite profile for MEDAS. We evaluated the associations of the identified metabolite profile and MEDAS with cognitive tests using multivariable linear regression models. Results: We identified a metabolite profile composed of 42 metabolites, mainly lipoprotein subclasses and fatty acids, significantly correlated with MedDiet adherence (Pearson=0.35,P-Value=5.5x10-37). After adjusting for known risk factors and accounting for multiple testing, the metabolite profile and MEDAS were not associated with cognitive tests. Conclusions: A plasma metabolite profile related to better adherence to the MedDiet was not associated with cognitive performance in a middle-aged Mediterranean population

FOXO1 controls protein synthesis and transcript abundance of mutant polyglutamine proteins, preventing protein aggregation

FOXO1, a transcription factor downstream of the insulin/insulin like growth factor axis, has been linked to protein degradation. Elevated expression of FOXO orthologs can also prevent the aggregation of cytosine adenine guanine (CAG)-repeat disease causing polyglutamine (polyQ) proteins but whether FOXO1 targets mutant proteins for degradation is unclear. Here, we show that increased expression of FOXO1 prevents toxic polyQ aggregation in human cells while reducing FOXO1 levels has the opposite effect and accelerates it. Although FOXO1 indeed stimulates autophagy, its effect on polyQ aggregation is independent of autophagy, ubiquitin–proteasome system (UPS) mediated protein degradation and is not due to a change in mutant polyQ protein turnover. Instead, FOXO1 specifically downregulates protein synthesis rates from expanded pathogenic CAG repeat transcripts. FOXO1 orchestrates a change in the composition of proteins that occupy mutant expanded CAG transcripts, including the recruitment of IGF2BP3. This mRNA binding protein enables a FOXO1 driven decrease in pathogenic expanded CAG transcript- and protein levels, thereby reducing the initiation of amyloidogenesis. Our data thus demonstrate that FOXO1 not only preserves protein homeostasis at multiple levels, but also reduces the accumulation of aberrant RNA species that may co-contribute to the toxicity in CAG-repeat diseases

miR-16-5p Promotes Erythroid Maturation of Erythroleukemia Cells by Regulating Ribosome Biogenesis

miRNAs constitute a class of non-coding RNA that act as powerful epigenetic regulators in animal and plant cells. In order to identify putative tumor-suppressor miRNAs we profiled the expression of various miRNAs during differentiation of erythroleukemia cells. RNA was purified before and after differentiation induction and subjected to quantitative RT-PCR. The majority of the miRNAs tested were found upregulated in differentiated cells with miR-16-5p showing the most significant increase. Functional studies using gain- and loss-of-function constructs proposed that miR-16-5p has a role in promoting the erythroid differentiation program of murine erythroleukemia (MEL) cells. In order to identify the underlying mechanism of action, we utilized bioinformatic in-silico platforms that incorporate predictions for the genes targeted by miR-16-5p. Interestingly, ribosome constituents, as well as ribosome biogenesis factors, were overrepresented among the miR-16-5p predicted gene targets. Accordingly, biochemical experiments showed that, indeed, miR-16-5p could modulate the levels of independent ribosomal proteins, and the overall ribosomal levels in cultured cells. In conclusion, miR-16-5p is identified as a differentiation-promoting agent in erythroleukemia cells, demonstrating antiproliferative activity, likely as a result of its ability to target the ribosomal machinery and restore any imbalanced activity imposed by the malignancy and the blockade of differentiation

Genomic regulation of ribosomal protein gene expression: molecular mechanisms and pharmacological exploitation

Ribosomes constitute the main macromolecular machines that catalyze protein synthesis within the cells of all domains of life. Each ribosome is assembled by the same set of 80 Ribosomal proteins- RPs and 4 ribosomal RNAs- rRNAs, which structurally associate into two subunits, the 40S and the 60S. Recently it has been revealed that mutations in ribosomal protein coding genes, the main components of the translational machinery, cause a group of pathologies termed ribosomopathies, as well as certain cancer types. Intriguingly, despite the ubiquitous expression of the associated ribosomal proteins, ribosomopathies mainly relate with toxicity in the red cell lineage and anemic clinical manifestations. An outstanding question that may shed light into ribosomopathies’ toxicity, is whether and how the ribosomal structure is altered during erythroid differentiation.This dissertation aims to address this issue by performing a detailed proteomic analysis of purified polysomes in an established model of erythroid differentiation (Murine Erythroleukemia Cells-MEL). Ribosomes were extracted out of different stages of differentiation through sucrose gradient ultracentrifugation, analyzed by label-free proteomics and combined with publicly available data through bioinformatic methods. Additionally, we sought for novel regulators of erythroid differentiation and thus focus on a specific microRNA molecule, miR-16-5p, with an interesting role in erythropoiesis and cancer. A main finding of the study was that erythroid differentiation associates with an extensive reprogramming of the overall ribosomal levels, characterized by an increase in monosomes and a decrease in polysomes. Moreover, the performed proteomic analysis identified 78 ribosomal proteins along with 1183 ribosome associated proteins (Raps). Notably, the main ribosomal structure, as assessed by the proteomic quantification of all ribosomal proteins, remained unaltered between immature and differentiated cells. This finding was verified through antibody detection of selected ribosomal proteins in the same samples. Moreover, a publicly available study was analyzed to reveal how ribosomal proteins are regulated in a whole-cell level derived out of 4 models of erythropoiesis. The latter analysis revealed that all RPs demonstrated excellent correlation in their expression levels between the samples, irrespective of their differentiation status. On the contrary, the ribosome-associated proteome, composed out of hundreds of proteins, seem to be dynamic and inconstant during erythroid differentiation. In total, 254 proteins demonstrated differential expression between the two samples, while 169 proteins were upregulated and 85 were downregulated. These factors functionally belong into various categories including RNA binding proteins, translational regulators as well as unexpected groups such as alternative splicing factors and mitochondrial proteins. Finally, miR-16-5p was identified as a strong regulator of erythroid differentiation by modulating ribosomal protein expression and its role was analyzed in the context of erythropoiesis and cancer development. In conclusion, the presented data suggests against a model of ribosome heterogeneity in erythropoiesis and proposes that alterations of the ribosomal levels as well as ribosome associated proteins are more important regulators of gene expression during differentiation. In total, this study represents a thorough analysis of the ribo-proteomic landscape and thus it enhances our understanding of ribosome regulation and deregulation in ribosomopathies and hematologic malignancies.Τα ριβοσώματα αποτελούν εξαιρετικά συντηρημένες μοριακές μηχανές, υπεύθυνες για τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών σε όλα τα ζωντανά κύτταρα. Για την βιογένεση κάθε ριβοσώματος απαιτείται η στοιχειομετρική συναρμογή 80 ριβοσωμικών πρωτεϊνών (Ribosomal Proteins- RPs) και 4 ριβοσωμικών RNAs σε δυο ριβοσωμικές υπομονάδες, τις 40S και 60S. Πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν ότι οι μεταλλάξεις πολλαπλών RP γονιδίων σχετίζονται με την ανάπτυξη και την προώθηση μιας ομάδας γενετικών διαταραχών που ονομάζονται ριβοσωμοπάθειες καθώς και επίκτητων ασθενειών, όπως ο καρκίνος. Στις συγκεκριμένες ασθένειες διαπιστώνεται μια ευαισθησία της αναπτυξιακής διεργασίας της ερυθροποίησης, καθώς οι ασθενείς με ριβοσωμοπάθειες εκδηλώνουν σχεδόν αποκλειστικά αδυναμία παραγωγής ερυθρών αιμοσφαιρίων (ανεπαρκής ερυθροποίηση) χωρίς άλλες εμφανείς διαταραχές. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής καταγραφή του ρόλου και της λειτουργίας του ριβοσώματος σε κύτταρα που υπόκεινται ερυθροκυτταρική διαφοροποίηση, της διαδικασίας δηλαδή η οποία απορρυθμίζεται δραματικά σε ασθενείς με ριβοσωμοπάθειες. Ως εκ τούτου, κεντρικοί στόχοι της διατριβής αποτελούν: α) Η καταγραφή των επιπέδων των ριβοσωμάτων, β) ο λεπτομερής χαρακτηρισμός της ριβοσωμικής σύνθεσης, μέσω της πρωτεϊνωματικής ανάλυσης απομονωμένων ριβοσωμάτων από στάδια της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης και γ) Ο εντοπισμός ρυθμιστών της ριβοσωμικής βιογένεσης με στόχο την φαρμακολογική αξιοποίησή τους στις ριβοσωμοπάθειες ή στον καρκίνο. Για την επίτευξη των παραπάνω στόχων αξιοποιήθηκαν καθιερωμένα κυτταρικά μοντέλα της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης, ιδιαιτέρως η ερυθρολευχαιμική σειρά Murine Erythroleukemia (MEL) Cells. Για την μελέτη των ριβοσωμάτων καθιερώθηκε και εκτελέσθηκε ένα πρωτόκολλο απομόνωσης βασισμένο στην υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας σακχαρόζης. Τα απομονωμένα και καθαρισμένα ριβοσώματα αναλύθηκαν με τη χρήση της τεχνικής φασματομετρίας μάζας σε σειρά. Παρατηρήθηκε ότι τα ριβοσώματα υφίστανται αυστηρή ρύθμιση στη διάρκεια της διαφοροποίησης, που χαρακτηρίζεται από αύξηση των επίπεδων των μονοσωμάτων και μείωση των πολυσωμάτων. Επιπλέον, στα πλαίσια της πρωτεϊνωματικής ανάλυσης των ριβοσωμάτων στα MEL κύτταρα εντοπίσθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες και 1183 πρωτεΐνες που συνδέονται με το ριβόσωμα. Η ποσοτική πρωτεϊνωματική ανάλυση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών ανέδειξε ότι η στοιχειομετρία της βασικής δομής του ριβοσώματος (των 78 ριβοσωμικών πρωτεϊνών) παραμένει αμετάβλητη στην διάρκεια της ερυθροδιαφοροποίησης. Η συγκεκριμένη παρατήρηση επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι 7 ριβοσωμικών πρωτεϊνών καθώς και με την ανάλυση δημοσιευμένων πρωτεϊνωματικών δεδομένων από 4 επιπλέον κυτταρικά μοντέλα της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης. Ακόμη, διερευνήθηκε η ρύθμιση των πρωτεϊνών που συνδέονται με το ριβόσωμα στα απομονωμένα ριβοσώματα των MEL κυττάρων. Στο πλαίσιο αυτής της ανάλυσης παρατηρήθηκε ότι οι 169 πρωτεΐνες ρυθμίζονται θετικά και οι 85 πρωτεΐνες μειώνουν τη συνδεσιμότητά τους με το ριβόσωμα στα διαφοροποιημένα κύτταρα. Η μοριακή λειτουργία των παραπάνω πρωτεϊνών βρέθηκε να αφορά ενδοκυτταρικές λειτουργίες, όπως η σύνδεση με RNA, το εναλλακτικό μάτισμα και η μιτοχονδριακή λειτουργία. Τέλος, παράλληλα με την εκτέλεση του κύριου μέρους της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στο πλαίσιο του εντοπισμού ρυθμιστών της ερυθροδιαφοροποίησης που επηρεάζουν τη λειτουργία του ριβοσώματος, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής καταγραφή της δράσης του microRNA: miR-16-5p σε διάφορα καρκινικά κυτταρικά μοντέλα. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ένα πολύπλευρο ογκοκατασταλτικό ρόλο του miR-16-5p σε κύτταρα ερυθρολευχαιμικά και καρκίνου του μαστού. Συνολικά, η παρούσα διατριβή αποτελεί μια ολοκληρωμένη ανάλυση του πρωτεϊνωματικού φάσματος του ριβοσώματος στην ερυθροδιαφοροποίηση με σημαντικές προεκτάσεις για την κατανόηση των ριβοσωμοπαθειών και των αιματολογικών νεοπλασιών

miR-16-5p Promotes Erythroid Maturation of Erythroleukemia Cells by Regulating Ribosome Biogenesis

miRNAs constitute a class of non-coding RNA that act as powerful epigenetic regulators in animal and plant cells. In order to identify putative tumor-suppressor miRNAs we profiled the expression of various miRNAs during differentiation of erythroleukemia cells. RNA was purified before and after differentiation induction and subjected to quantitative RT-PCR. The majority of the miRNAs tested were found upregulated in differentiated cells with miR-16-5p showing the most significant increase. Functional studies using gain- and loss-of-function constructs proposed that miR-16-5p has a role in promoting the erythroid differentiation program of murine erythroleukemia (MEL) cells. In order to identify the underlying mechanism of action, we utilized bioinformatic in-silico platforms that incorporate predictions for the genes targeted by miR-16-5p. Interestingly, ribosome constituents, as well as ribosome biogenesis factors, were overrepresented among the miR-16-5p predicted gene targets. Accordingly, biochemical experiments showed that, indeed, miR-16-5p could modulate the levels of independent ribosomal proteins, and the overall ribosomal levels in cultured cells. In conclusion, miR-16-5p is identified as a differentiation-promoting agent in erythroleukemia cells, demonstrating antiproliferative activity, likely as a result of its ability to target the ribosomal machinery and restore any imbalanced activity imposed by the malignancy and the blockade of differentiation