Regulation des anaeroben Abbaus aromatischer Kohlenwasserstoffe in Aromatoleum aromaticum EbN1

Das genomsequenzierte β-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 und einige verwandte Arten weisen die ungewöhnliche Stoffwechselaktivität des anaeroben Abbaus von Kohlenwasserstoffen sowie phenolischen Verbindungen auf. Hierfür besitzt A. aromaticum mehrere sehr substratspezifische Stoffwechselwege. Trotz der starken chemischen Ähnlichkeit einiger Verbindungen, erfolgt die spezifische Induktion der katabolischen Enzyme ausschließlich in Anwesenheit des jeweiligen Substrates und nicht durch chemisch analoge Verbindungen. Mittelpunkt dieses Promotionsprojektes war der Mechanismus der spezifischen Sensierung von Kohlenwasserstoffen und phenolischen Substraten, sowie die Regulation der Induktion der jeweiligen Abbauwege. Durch die Kombination aus neu entwickelten und bereits etablierten biochemischen und molekularbiologischen Methoden, wurde eindeutig gezeigt, dass Ethylbenzol und p-Ethylphenol, trotz ihrer starken chemischen Ähnlichkeit, durch zwei vollständig getrennte Abbauwege mit spezifisch induzierten Enzymen metabolisiert werden. Hierfür wurden Kulturen des Stammes EbN1 unter denitrifizierenden Bedingungen neben Ethylbenzol und p-Ethylphenol auch auf Acetophenon, einem wichtigen Zwischenprodukt des anaeroben Ethylbenzolstoffwechsels, kultiviert. Die Messung der Aktivitäten aller beteiligten Enzyme, der Häm-Färbungen sowie der Immun- und Biotin-Blot-Analysen ermöglichten die Identifizierung und Differenzierung der Enzyme der beiden anaeroben Abbauwege. Weiterhin wurden Lücken des postulierten p-Ethylphenolabbauweges durch neu identifizierte Enzyme geschlossen. Zu den identifizierten Enzymen gehörte unter anderem eine Biotin-abhängige p-Hydroxyacetophenon-Carboxylase. Das aromatische Keton Acetophenon, Intermediat des anaeroben Ethylbenzolabbaus, kann durch A. aromaticum sowohl unter anaeroben als auch aeroben Bedingungen über eine ATP-abhängige Acetophenon-Carboxylase (ApcABCDE) metabolisiert werden. Um die Bedingungen genauer zu analysieren, unter denen das apc-bal Operon exprimiert ist, wurde ein Reporterstamm mit einem fluoreszierenden mCherry-Protein konstruiert. Dieser bildete die Grundlage für die Entwicklung eines spezifischen Acetophenon Bioreportersystems. Zu diesem Zweck, wurde eine Fusion des mCherry Gens mit dem ersten Gen des Operons (apcA) erstellt und in das Chromosom von A. aromaticum integriert. Die Expression dieses Fusionsproteins sowie dessen Fluoreszenzaktivität entsprach dem Expressionsmuster der Enzyme des Acetophenonmetabolismus. Zum anderen wurde nachgewiesen, dass die zugesetzte Acetophenonkonzentration, in einem Bereich von 25 bis 250 μM, proportional zur produzierten Menge an ApcA-mCherry war. Mit Ausnahme der beiden 1-Phenylethanol Enantiomere, welche von A. aromaticum leicht zu Acetophenon umgesetzt werden können, zeigten alle getesteten chemisch analogen Verbindungen keine oder deutlich schwächere Signale. Ein weiterer Teil dieser Dissertation betraf die Analyse des adiRS Operons, das für ein Zweikomponenten-Regulationssystem (TCS) kodiert, welches wahrscheinlich die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons in A. aromaticum reguliert. Hierfür wurde durch homologe Rekombination eine Chloramphenicol-resistente Mutante konstruiert, bei der die adiRS Gene deletiert wurden. Entgegen den Erwartungen wuchs die adiRS Deletionsmutante noch immer mit Acetophenon und Ethylbenzol. Allerdings wurden reduzierte Acetophenon-Carboxylase-Aktivitäten in Extrakten dieser Kulturen nachgewiesen. Überraschenderweise zeigte die Mutante zudem ungewöhnliche Induktionsmuster der EbDH und zwei paraloger Biotin-Carboxyl-Carrier-Proteine (XccB und XccB2), welche in Acetophenon- bzw. Ethylbenzol-abbauenden Zellen des Wildtyp-Stammes nicht induziert sind. Die Komplementation der adiRS Gene auf einem Plasmid führte nur zu einem teilweisen Ausgleich der beobachteten Abweichungen und nicht zum Phänotyp des Wildtyps. Weiterhin wurde das bereits beschriebene apcA-mCherry Reporterkonstrukt in das Chromosom der Deletionsmutante integriert. Die ermittelten Ergebnisse gaben Indizien für eine zeitverzögerte und verminderte Expression der apcA-mCherry Fusion, wenn die adiRS Gene deletiert waren. Die erhaltenen Daten sind konsistent mit der Annahme, dass die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons neben dem AdiRS-System möglicherweise durch ein zweites parallel wirkendes TCS beeinflusst wird. Ein möglicher Kandidat sind die xdiRS Genprodukte, welche hohe Ähnlichkeit zu AdiRS aufweisen. Abschließend wird ein vorläufiges Modell zur potentiellen Rolle der beiden TCS AdiRS und XdiRS in der Substraterkennung und -unterscheidung in A. aromaticum Stamm EbN1 vorgestellt. Schließlich wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von Primer-Extension-Analysen erstmals putative Transkriptionsstartpunkte für die am anaeroben Ethylbenzol- und Acetophenonabbau beteiligten Operons experimentell ermittelt. Den identifizierten Startpunkten, wurden durch den Vergleich mit Konsensussequenzen σ70-abhängiger Promotoren putative -35 und -10 Regionen zugeordnet. Im Falle des apc-bal Operons könnten der umfangreiche 5‘-untranslatierte Bereich und die vorhergesagte Sekundärstruktur mit einer berechneten minimalen freien Energie von -61,4 kcal mol-1 ein Indiz dafür sein, dass diese RNA-Struktur an der transkriptionellen oder translationellen Regulation beteiligt ist

Mechanical behaviour of rubber blocks

This study investigates the behaviour of rubber blocks bonded between two plates under combined compression and shear loading, using experimental and numerical analyses, and also approximate analytical theories. First, experimental data from a series of compression and shear tests of rubber blocks with different aspect ratios are presented. Next, numerical simulations are carried out with three-dimensional finite element (FE) models, allowing insight to be gained into the stress and strain fields within the blocks. Existing analytical theories for blocks under compression and combined compressive and shear loading are then reviewed, and their accuracy is evaluated against test and numerical results. The study shows that those theories accounting for the effect of the axial shortening of the blocks provide a better description of the combined compression and shear behaviour, compared to theories, developed for laminated structural bearings with many thin rubber layers, that ignore this effect. An improved theory is also proposed, which better describes the effects of the bulging of the compressed blocks on their shear and flexural parameters and provides a better fit to experimental and numerical results

Mechanical behaviour of rubber bearings with low shape factor

This study investigates the mechanical behaviour of elastomeric bearings with a low shape factor (LSF). Such bearings can offer an effective solution for three-dimensional seismic isolation of structures, that is, isolation in vertical as well as horizontal directions. They could also be employed for developing low-cost isolation systems for developing countries due to their reduced weight and manufacturing cost. The first part of the study describes tests carried out at Tun Abdul Razak Research Centre (TARRC) on low-damping rubber double-shear test pieces and LSF bearings. The material tests are used to inform the development of a finite element (FE) model of the bearings, which is validated against the bearing test results. It is shown that the proposed FE model can be used to describe accurately the global non-linear horizontal force-displacement behaviour of the compressed bearings, while providing an insight into the local distribution of stresses and strains. It can also be used to investigate the bearing response under boundary conditions that differ from the one considered in the tests. The second part of the study illustrates the numerical simulations of shaking table tests carried out at the University of Naples Federico II on a structural prototype mounted on the low-damping LSF bearings. Useful insights are provided into the effect of the vertical bearing flexibility on the response and the attainment of critical conditions of zero tangent horizontal stiffness under horizontal displacements

Isolation of a HypC–HypD complex carrying diatomic CO and CN− ligands

The HypC and HypD maturases are required for the biosynthesis of the Fe(CN)2CO cofactor in the large subunit of [NiFe]-hydrogenases. Using infrared spectroscopy we demonstrate that an anaerobically purified, Strep-tagged HypCD complex from Escherichia coli exhibits absorption bands characteristic of diatomic CO and CN− ligands as well as CO2. Metal and sulphide analyses revealed that along with the [4Fe–4S]2+ cluster in HypD, the complex has two additional oxygen-labile Fe ions. We prove that HypD cysteine 41 is required for the coordination of all three ligands. These findings suggest that the HypCD complex carries minimally the Fe(CN)2CO cofactor

Regulation des anaeroben Abbaus aromatischer Kohlenwasserstoffe in Aromatoleum aromaticum EbN1

Das genomsequenzierte β-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 und einige verwandte Arten weisen die ungewöhnliche Stoffwechselaktivität des anaeroben Abbaus von Kohlenwasserstoffen sowie phenolischen Verbindungen auf. Hierfür besitzt A. aromaticum mehrere sehr substratspezifische Stoffwechselwege. Trotz der starken chemischen Ähnlichkeit einiger Verbindungen, erfolgt die spezifische Induktion der katabolischen Enzyme ausschließlich in Anwesenheit des jeweiligen Substrates und nicht durch chemisch analoge Verbindungen. Mittelpunkt dieses Promotionsprojektes war der Mechanismus der spezifischen Sensierung von Kohlenwasserstoffen und phenolischen Substraten, sowie die Regulation der Induktion der jeweiligen Abbauwege. Durch die Kombination aus neu entwickelten und bereits etablierten biochemischen und molekularbiologischen Methoden, wurde eindeutig gezeigt, dass Ethylbenzol und p-Ethylphenol, trotz ihrer starken chemischen Ähnlichkeit, durch zwei vollständig getrennte Abbauwege mit spezifisch induzierten Enzymen metabolisiert werden. Hierfür wurden Kulturen des Stammes EbN1 unter denitrifizierenden Bedingungen neben Ethylbenzol und p-Ethylphenol auch auf Acetophenon, einem wichtigen Zwischenprodukt des anaeroben Ethylbenzolstoffwechsels, kultiviert. Die Messung der Aktivitäten aller beteiligten Enzyme, der Häm-Färbungen sowie der Immun- und Biotin-Blot-Analysen ermöglichten die Identifizierung und Differenzierung der Enzyme der beiden anaeroben Abbauwege. Weiterhin wurden Lücken des postulierten p-Ethylphenolabbauweges durch neu identifizierte Enzyme geschlossen. Zu den identifizierten Enzymen gehörte unter anderem eine Biotin-abhängige p-Hydroxyacetophenon-Carboxylase. Das aromatische Keton Acetophenon, Intermediat des anaeroben Ethylbenzolabbaus, kann durch A. aromaticum sowohl unter anaeroben als auch aeroben Bedingungen über eine ATP-abhängige Acetophenon-Carboxylase (ApcABCDE) metabolisiert werden. Um die Bedingungen genauer zu analysieren, unter denen das apc-bal Operon exprimiert ist, wurde ein Reporterstamm mit einem fluoreszierenden mCherry-Protein konstruiert. Dieser bildete die Grundlage für die Entwicklung eines spezifischen Acetophenon Bioreportersystems. Zu diesem Zweck, wurde eine Fusion des mCherry Gens mit dem ersten Gen des Operons (apcA) erstellt und in das Chromosom von A. aromaticum integriert. Die Expression dieses Fusionsproteins sowie dessen Fluoreszenzaktivität entsprach dem Expressionsmuster der Enzyme des Acetophenonmetabolismus. Zum anderen wurde nachgewiesen, dass die zugesetzte Acetophenonkonzentration, in einem Bereich von 25 bis 250 μM, proportional zur produzierten Menge an ApcA-mCherry war. Mit Ausnahme der beiden 1-Phenylethanol Enantiomere, welche von A. aromaticum leicht zu Acetophenon umgesetzt werden können, zeigten alle getesteten chemisch analogen Verbindungen keine oder deutlich schwächere Signale. Ein weiterer Teil dieser Dissertation betraf die Analyse des adiRS Operons, das für ein Zweikomponenten-Regulationssystem (TCS) kodiert, welches wahrscheinlich die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons in A. aromaticum reguliert. Hierfür wurde durch homologe Rekombination eine Chloramphenicol-resistente Mutante konstruiert, bei der die adiRS Gene deletiert wurden. Entgegen den Erwartungen wuchs die adiRS Deletionsmutante noch immer mit Acetophenon und Ethylbenzol. Allerdings wurden reduzierte Acetophenon-Carboxylase-Aktivitäten in Extrakten dieser Kulturen nachgewiesen. Überraschenderweise zeigte die Mutante zudem ungewöhnliche Induktionsmuster der EbDH und zwei paraloger Biotin-Carboxyl-Carrier-Proteine (XccB und XccB2), welche in Acetophenon- bzw. Ethylbenzol-abbauenden Zellen des Wildtyp-Stammes nicht induziert sind. Die Komplementation der adiRS Gene auf einem Plasmid führte nur zu einem teilweisen Ausgleich der beobachteten Abweichungen und nicht zum Phänotyp des Wildtyps. Weiterhin wurde das bereits beschriebene apcA-mCherry Reporterkonstrukt in das Chromosom der Deletionsmutante integriert. Die ermittelten Ergebnisse gaben Indizien für eine zeitverzögerte und verminderte Expression der apcA-mCherry Fusion, wenn die adiRS Gene deletiert waren. Die erhaltenen Daten sind konsistent mit der Annahme, dass die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons neben dem AdiRS-System möglicherweise durch ein zweites parallel wirkendes TCS beeinflusst wird. Ein möglicher Kandidat sind die xdiRS Genprodukte, welche hohe Ähnlichkeit zu AdiRS aufweisen. Abschließend wird ein vorläufiges Modell zur potentiellen Rolle der beiden TCS AdiRS und XdiRS in der Substraterkennung und -unterscheidung in A. aromaticum Stamm EbN1 vorgestellt. Schließlich wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von Primer-Extension-Analysen erstmals putative Transkriptionsstartpunkte für die am anaeroben Ethylbenzol- und Acetophenonabbau beteiligten Operons experimentell ermittelt. Den identifizierten Startpunkten, wurden durch den Vergleich mit Konsensussequenzen σ70-abhängiger Promotoren putative -35 und -10 Regionen zugeordnet. Im Falle des apc-bal Operons könnten der umfangreiche 5‘-untranslatierte Bereich und die vorhergesagte Sekundärstruktur mit einer berechneten minimalen freien Energie von -61,4 kcal mol-1 ein Indiz dafür sein, dass diese RNA-Struktur an der transkriptionellen oder translationellen Regulation beteiligt ist

Dynamic behaviour and seismic response of structures isolated with low shape factor bearings

This study investigates the mechanical behaviour of laminated elastomeric bearings with a low shape factor (LSF) and the dynamic response of structures mounted on them. Axial loads have a significant influence on the mechanical behavior of the LSF bearings. Most of existing theories and mechanical models for laminated bearings cannot be employed for LSF bearings because they disregard the important effects of axial shortening and bulging of the rubber layers on the horizontal bearing stiffness. In this study, a simplified model originally developed for slender rubber blocks is employed for describing the mechanical behavior of LSF bearings, and validated against the experimental results on low-damping LSF bearings manufactured and tested at Tun Abdul Razak Research Center (TARRC). The proposed model is then used to simulate the seismic response of a structural prototype mounted on the low-damping LSF bearings and tested at University of Naples Federico II on a shaking table under horizontal seismic input. Further analyses are carried out to evaluate how the bearing shape factor affects the dynamic and seismic response of the prototype. The study provides some useful insight into the complex mechanical behavior of LSF bearings and of structures mounted on them

An evaluation of stress-softening behaviour of HDNR bearings on the seismic response of base-isolated structures

In the last few decades, high damping natural rubber (HDNR) bearings have been extensively employed for seismic isolation of bridges and buildings because of their low horizontal stiffness and high damping capacity, which allows shifting the vibration period of the isolated structure away from where the earthquake input has the highest energy content and at the same time controlling the motion of the system. In HDNR material, filler is added to the natural rubber in order to improve its properties such as stiffness and dissipative capacity. The addition of the filler induces also a stress-softening behavior, known as “Mullins effect”. This effect makes the response of HDNR bearings path-history dependent and thus may influence the seismic performance of isolated systems. Published literature has suggested that the initial “virgin” properties of the material are eventually recovered. Accordingly, current seismic codes make the assumption that “Mullins effect” is a reversible phenomenon. The present work aims at studying the consequences of such strain-history dependent behavior on the seismic response of structural systems isolated with HDNR bearings. In particular, the first part of the paper reports a wide experimental campaign carried out on a large number of virgin rubber samples in order to better investigate some aspects of the stress-softening behavior of filled rubber, such as the direction-dependence and the recovery prosperities, and to characterize the stable and transient response under different strain histories. Test results are used to define a model for simulating the behavior of HDNR bearings in shear, which is an advancement in the description of both the stable and the transient behaviors. The proposed model has been used to analyze the seismic response of a simplified isolated structure modeled as a S-DOF (single degree of freedom) system under ground motions with different characteristics and by considering two different conditions for the bearings: one assuming the virgin (or fully recovered) rubber properties and the other assuming the stable (or fully scragged) rubber properties. The obtained results show that, except for the special case of near-fault (NF) ground motions, the differences between the responses are limited although not negligible, whereas for NF records, the assumption of the virgin (or fully recovered) condition significantly reduces the effect of this type of motion on isolated structures

Influence of high damping natural rubber bearing model on the seismic response evaluation of isolated bridges

High damping natural rubber (HDNR) bearings are extensively employed in seismic isolation of both bridges and buildings. In HDNR material, a filler is added to the natural rubber to increase its stiffness and dissipation capacity. However, the addition of the filler induces also a stress-softening behaviour under cyclic loadings related to the internal microstructure breakdown or sometime referred to as damage. This phenomenon may significantly influence the seismic response of isolated systems given its recovery characteristics. The present work aims to study the consequences of such softening behaviour on the seismic performance of bridges isolated with HDNR bearings. For this purpose, the response of an isolated bridge pier under different seismic inputs is analyzed by pointing out the differences between the results obtained by considering two different conditions for the bearings, one assuming the "virgin" rubber properties and the other assuming the "stable" or "scragged" properties

Biaxial shear behaviour of HDNR with Mullins effect and deformation-induced anisotropy

High damping natural rubber (HDNR) bearings, commonly employed to isolate structures, are subjected to biaxial horizontal deformations by the seismic motion. If they have virgin material properties, biaxial models including the stress softening due to the Mullins effect should be used for describing their force–deformation behaviour. Specific studies oriented at characterizing and modelling the biaxial behaviour of HDNR bearings accounting for the stress-softening are very few in number because they would require a large number of virgin isolators or long times of rest between two consecutive tests. Moreover, available studies consider the Mullins effect as an isotropic phenomenon, whereas experimental investigations have shown that it is direction-dependent and thus induces anisotropy of the rubber behaviour. This paper describes an extensive experimental campaign carried out on a large number of small material test pieces aimed at achieving a satisfactory characterization of the biaxial anisotropic response of a highly dissipative rubber compound. These results are then used to develop a two-dimensional constitutive model for the virgin HDNR material accounting for the directiondependence of the Mullins effect, based on the concept of representative directions applied to the biaxial shear deformation state. Because for commonly employed laminated HDNR bearings under design actions the approximation of uniform simple shear is realistic, the proposed material model can also be used to simulate the global bidirectional horizontal response of the bearings