From carbohydrates to drug-like fragments: Rational development of novel [alfa]-amylase inhibitors

K

Design, synthesis, molecular modelling and biological evaluation of modulators of the NF-kappaB activation

As a wide variety of pro-inflammatory cytokines are involved in the development of rheumatoid arthritis (RA), there is an urgent need for the discovery of novel therapeutic strategies. Among these, the inhibition of the NF-kappaB inducing kinase (NIK), a key enzyme of the NF-kappaB alternative pathway activation, represents a potential interesting approach. In fact, NIK is involved downstream of many tumor necrosis factor receptors (TNFR) like CD40, RANK or LTbetaR, implicated in the pathogenesis of RA. But, up to now, the number of reported putative NIK inhibitors is extremely limited. Firstly, we aimed to build a 3D-model of NIK and to study the binding of pyrazolo[4,3-c]isoquinolines with a view to highlight the structural elements responsible for their inhibitory potency. However, in the course of this work, we unexpectedly found that the pyrazolo[4,3-c]isoquinolines initially reported as NIK inhibitors were neither inhibitors of this enzyme nor of the alternative NF-kappaB pathway, but were in fact inhibitors of another kinase, the TGF-beta activated kinase 1 (TAK1) which is involved in the classical NF-kB activation pathway. Secondly, we report a virtual screening (VS) study combining various filters including high-throughput docking using a 3D-homology model and ranking by using different scoring functions. This work led to the identification of two molecular fragments, 4Hisoquinoline-1,3-dione and 2,7-naphtydrine-1,3,6,8-tetrone which inhibit NIK with an IC50 value of 51 and 90 µM, respectively. This study opens new perspectives in the field of the NF-kappaB alternative pathways inhibition.La polyarthrite rhumatoïde est une maladie grave touchant approximativement 1-2% de la population mondiale. Cliniquement, la polyarthrite rhumatoïde se manifeste par une arthrite symétrique associée à une destruction progressive du cartilage ainsi que de l'os des articulations, et est responsable de l'atteinte fonctionnelle des patients. Les méthodes thérapeutiques actuelles ne sont pas encore en mesure de contrecarrer son évolution. Elles permettent en effet d’en atténuer les symptômes inflammatoires chroniques, mais ne s’attaquent pas aux causes de la pathologie. Ainsi, l’élaboration de traitements thérapeutiques alternatifs, plus efficaces et accessibles à tous nécessite une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l’étiologie de cette maladie. La voie alternative d'activation du facteur de transcription NF-kappaB a récemment été identifiée comme directement impliquée dans un certain nombre de dysfonctionnements inflammatoires. C'est à ce titre que ce travail de thèse s'est concentré sur une enzyme impliquée dans cette cascade d'activation (la voie dite alternative). La première partie de ce travail fut essentiellement concentrée sur une étude structurale de notre cible. Nous avons donc eu l'occasion de construire, par homologie de séquence, le premier modèle 3D de NIK. Ensuite, sur base de cette structure modélisée, nous avons étudié le domaine kinase de notre cible grâce à un travail de mutagénèse dirigée. Nous avons d'abord sélectionné une série de résidus potentiellement intéressant à muter. Puis, en évaluant l'activité résiduelle des mutants générés, une dizaine d'acides aminés indispensables à l'activité de NIK ont été identifiés. Notre second objectif fut ensuite de concevoir et synthétiser des molécules capables d’interférer avec cette voie alternative d'activation de NF-kappaB. Pour ce faire, l'inhibition de la kinase NIK constituait la stratégie la plus intéressante. Or, les seules molécules décrites dans la littérature comme inhibitrices de cette cible étaient des pyrazolo-isoquinoléines brevetées par la société Aventis. Grâce à un travail de synthèse et suite à différents tests enzymatiques et cellulaires, nous avons d'abord démontré que ces composés étaient dépourvus d'activité vis-à-vis de NIK. Cette affirmation était en plus soutenue par un travail de docking des composés en question dans la structure modélisée de NIK. Et enfin, nous avons démontré quelle pourrait être la véritable cible de cette série et comment le mode d'action de celle-ci a pu être mal interprété. Afin d'identifier de nouveaux squelettes moléculaires dans la cadre de la recherche pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, une étude de screening virtuel de fragments a finalement été mise au point. Nous sommes partis d'une banque de molécules commerciales et, à la suite d'un important travail de sélection et de docking, ce sont 49 composés qui ont été achetés et testés sur NIK. Les deux principaux résultats ressortissant de ce travail de screening sont: - D'une part, un premier fragment a montré, à 50µM, un pouvoir inhibiteur de la voie alternative d'activation de NF-kappaB. De plus, une excellente sélectivité fût observée vis-à-vis de la voie classique, redoublant alors l'intérêt de ce composé. En testant des molécules analogues achetées ou synthétisées par nos soins, l'intérêt de la série fût validé. - D'autre part, un second composé inhibant l'activité kinase de NIK dans un test enzymatique fut également identifié. L'évaluation d'une série d'analogues a ensuite permis l'établissement des premières relations structure-activité dans la série. Enfin, un travail de docking a permis d'identifier les interactions responsables de l'affinité de ce composé pour le domaine kinase de notre cible. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mieux comprendre, à un niveau moléculaire, la kinase NIK dont l'inhibition constitue une stratégique particulièrement intéressante dans le cadre de la polyarthrite rhumatoïde. Alors que très peu de composés actifs étaient décris dans la littérature, notre travail sur la série des pyrazoloisoquinoléines d'Aventis a clarifié leur mode d'action et leur intérêt dans une stratégie d'inhibition de la voie alternative d'activation de NF-kappaB. Enfin, grâce à un ambitieux screening virtuel basé sur notre modèle 3D, deux squelettes moléculaires ont été identifiés et nous permettent de conclure ce travail sur d'encourageantes perspectives: la conception des premiers inhibiteurs chimiques de NIK et la validation d'une nouvelle et prometteuse stratégie thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.(DOCMED02) -- FUNDP, 201

Truly Target-Focused Pharmacophore Modeling: A Novel Tool for Mapping Intermolecular Surfaces

Pharmacophore models are an accurate and minimal tridimensional abstraction of intermolecular interactions between chemical structures, usually derived from a group of molecules or from a ligand-target complex. Only a limited amount of solutions exists to model comprehensive pharmacophores using the information of a particular target structure without knowledge of any binding ligand. In this work, an automated and customable tool for truly target-focused (T²F) pharmacophore modeling is introduced. Key molecular interaction fields of a macromolecular structure are calculated using the AutoGRID energy functions. The most relevant points are selected by a newly developed filtering cascade and clustered to pharmacophore features with a density-based algorithm. Using five different protein classes, the ability of this method to identify essential pharmacophore features was compared to structure-based pharmacophores derived from ligand-target interactions. This method represents an extremely valuable instrument for drug design in a situation of scarce ligand information available, but also in the case of underexplored therapeutic targets, as well as to investigate protein allosteric pockets and protein-protein interactions

KinFragLib: Exploring the Kinase Inhibitor Space Using Subpocket-Focused Fragmentation and Recombination

Protein kinases play a crucial role in many cell signaling processes, making them one of the most important families of drug targets. In this context, fragment-based drug design strategies have been successfully applied to develop novel kinase inhibitors, usually following a knowledge-driven approach to optimize a focused set of fragments to a potent kinase inhibitor. Alternatively, KinFragLib is a new method that allows to explore and extend the chemical space of kinase inhibitors using data-driven fragmentation and recombination, built on available structural kinome data from the KLIFS database for over 2,500 kinase DFG-in complexes. The computational fragmentation method splits the co-crystallized non-covalent kinase inhibitors into fragments with respect to their 3D proximity to six predefined functionally relevant subpocket centers. The resulting fragment library consists of six subpocket pools with over 7,000 fragments, available at https://github.com/volkamerlab/KinFragLib.KinFragLib offers two main applications: (i) In-depth analyses of the chemical space of known kinase inhibitors, subpocket characteristics and connections, as well as (ii) subpocket-informed recombination of fragments to generate potential novel inhibitors. The latter showed that recombining only a subset of 624 representative fragments generated a combinatorial library of 6.7 million molecules, containing, besides some known kinase inhibitors, more than 99% novel chemical matter compared to ChEMBL and 63% molecules compliant with Lipinski\u27s rule of five. <br /

NF-κB inducing kinase (NIK) inhibitors: Identification of new scaffolds using virtual screening

As a wide variety of pro-inflammatory cytokines are involved in the development of rheumatoid arthritis (RA), there is an urgent need for the discovery of novel therapeutic strategies. Among these, the inhibition of the NF-κB inducing kinase (NIK), a key enzyme of the NF-κB alternative pathway activation, represents a potential interesting approach. In fact, NIK is involved downstream of many tumor necrosis factor receptors (TNFR) like CD40, RANK or LTβR, implicated in the pathogenesis of RA. But, up to now, the number of reported putative NIK inhibitors is extremely limited. In this work, we report a virtual screening (VS) study combining various filters including high-throughput docking using a 3D-homology model and ranking by using different scoring functions. This work led to the identification of two molecular fragments, 4H-isoquinoline-1,3-dione (5) and 2,7-naphthydrine-1,3,6,8-tetrone (6) which inhibit NIK with an IC50 value of 51 and 90 μM, respectively. This study opens new perspectives in the field of the NF-κB alternative pathway inhibition. © 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved