Аппаратурное и инструментальное обеспечение флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии

The results of hardware and tool development in photodynamic therapy and fluorescence diagnostics performed by the Natural Research Center, A.M. Prokhorov General Physics Institute, Russian Academy of Sciences in collaboration with several research and medical institutes are presented. Physical and technical aspects of the problem are mentioned. We describe schemes and the principle of operation of devices which we use with our medical colleagues in clinical and experimental studies. Some results of clinical use of the developed devices and methods are presented. Представлены результаты аппаратных и инструментальных разработок в области фотодинамической терапии и флюоресцентной диагностики, проведенных Центром естественно-научных исследований Института общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук совместно с другими исследовательскими и медицинскими институтами. Приведены схемы и описаны принципы работы устройств, используемых в клинических и экспериментальных исследованиях. Представлены некоторые результаты использования разработанных устройств в клинической практике.

ПРИМЕНЕНИЕ УСТРОЙСТВ ДЛЯ ПРОСТРАНСТВЕННО-РАЗРЕШЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ НА ПРИМЕРЕ ДВУХСЛОЙНЫХ ФАНТОМОВ, СОДЕРЖАЩИХ МЕТАЛЛИЧЕСКИЕ НАНОЧАСТИЦЫ

The abilities of the optical probe for fluorescence-guided stereotactic biopsy were investigated by means of a multifiber probe under 532 or 632.8 nm excitation. The set of multilayered phantoms representing a border between normal brain-tissue and a tumor with photosensitizer and gold nanoparticles (spheres or stars) in different concentrations were made to investigate the macroscopic parameters observed during the neurosurgical biopsy sample collection by means of the optical probe. These investigantions will allow to define the border of a brain tumor and control the type of tissue being collected by a stereotactic cannula during surgery. The impact of gold nanospheres and gold nanostars added in different concentrations to the bottom-layer of phantom was analyzed by fluorescence quenching or enhancement due to energy transfer between nanoparticles and fluorescent molecules. The results allow determining the tumor border and to make the biopsy uptake more efficient by observing the character of signal change while penetrating a tumor and while going out of it.Исследованы возможности применения зонда для стереотаксической биопсии при флуоресцентной навигации при возбуждении 532 или 632,8 нм. Для исследования макроскопических параметров, наблюдаемых во время забора образцов при стереотаксической биопсии с помощью оптического зонда, был сделан набор полужидких, полутвердых многослойных фантомов, моделирующих границу между нормальной мозговой тканью и опухолью с фотосенсибилизатором и наночастицами золота (сферы и звезды) в различных концентрациях. Было проанализировано влияние золотых наносфер и нанозвезд, добавленных в разных концентрациях к нижнему слою фантома, на усиление флуоресценции за счет переноса энергии между наночастицами и флуоресцентными молекулами. Результаты позволяют определить границу опухоли и повысить эффективность биопсии, наблюдая характер изменения флуоресцентного сигнала при прохождении зонда через опухоль

Фото и спектральный флуоресцентный анализ области травмы спинного мозга на животных моделях

The purpose of the work is to follow the dynamics of changes in fluorescent signals in the near-surface layers of tissue of injured areas of the back of laboratory animals, which will allow, by indirect evidence, to evaluate the information content of fluorescence diagnosis for subsequent possible diagnostic monitoring of photodynamic therapy of the spinal cord. The model animals were Wistar rats. Two types of contusions were modeled: pneumo-contusion and contusion by a falling load. Methylene blue and indocyanine green were used as photosensitizers. Fluorescence measurements were carried out by imaging and spectrometric methods. A stroboscopic fluorescence imager with an excitation wavelength of 630 nm was used to acquire fluorescence images. The LESA-01-BIOSPEC  spectrometer with a He-Ne laser excitation allowed to obtain spectra. It was shown that both methods make it possible to estimate the fluorescence value of methylene blue and indocyanine green in the tissues under study. Moreover, the photographic method also allows to obtain the spatial distribution of fluorescence. The general trend found in the data is a more intense and uniform fluorescence of the dorsal region of rats with methylene blue and a less intense, but more contrasting distribution of indocyanine green. The presented methods are non-invasive, which makes them attractive for diagnostic use. However, due to the shallow depth of signal reception, the condition of the spine can be determined only indirectly, by the condition of the near-surface layers of tissue that accumulate the photosensitizer.Цель работы – проследить  динамику изменения флуоресцентных  сигналов  в приповерхностных слоях  тканей  травмированных участков спины лабораторных животных, что позволит, по косвенным признакам, оценить информативность флуоресцентной диагностики для последующего возможного диагностического мониторинга фотодинамической терапии спинного мозга. Модельными животными были крысы Вистар. Моделировалось два типа контузий: пневмоконтузия и контузия падающим грузом. Флуоресцентные измерения  проводились  фотографическим   и  спектрометрическим   методом с  препаратами  метиленовый  синий  и  индоцианин зеленый. Для фоторегистрации  флуоресцентного  ответа  использовался  стробоскопический флуоресцентный  имиджер с длиной волны возбуждения 630 нм. Спектральные  измерения проводились  с помощью спектрометра  ЛЕСА-01-БИОСПЕК, с возбуждением He-Ne  лазером  (632,8 нм). Показано,  что  оба  метода  позволяют  оценивать  величину  флуоресценции  метиленового  синего  и индоцианина зелёного в исследуемых тканях, а фотографический метод позволяет также получить пространственное распределение флуоресценции. Общая тенденция, обнаруженная в полученных данных – более интенсивная и равномерная флуоресценции дорсальной области крыс метиленовым синим, и менее интенсивное, но более контрастное распределение индоцианина зелёного. Представленные методы неинвазивны, что делает их привлекательными для диагностического использования. Однако из-за малой глубины приема сигнала состояние позвоночника можно определить лишь косвенно, по состоянию приповерхностных слоев тканей, накапливающих фотосенсибилизатор

Взаимосвязь спектроскопических и структурных свойств j-агрегатов индоцианина зеленого

Indocyanine green (ICG), when in free form in a liquid, can form stable nanoparticle structures or colloidal solution, while changing its spectroscopic properties. In the work, the aggregation degree and the average size of nanoparticles depending on the concentration of a colloidal solution of indocyanine green (ICG NPs) in the form of J-aggregates were investigated by various methods based on light scattering. The size of nanoparticles is an important parameter from the point of view of clinical application, because the technique of intravenous administration of drugs, in order to avoid microvascular thrombosis and embolism, provides dosage forms with inclusions of individual molecules or their clusters, not exceeding 500 nm diameter. In turn, small nanoparticles less than 30 nm lead to prolonged circulation of the drug in the body with an increased possibility of permeation into cells of healthy tissue. In the course of studies, it was found that an increase in the concentration of ICG NPs in the solution leads to an increase in the average size of spontaneously formed J-aggregates, which, in turn, leads to a decrease in the absorption coefficient in the aggregates. Presumably, this phenomenon, i.e. the established nonlinear dependence of the J-aggregate absorption on its size, can be explained by the formation of absorption centers on the J-aggregate surface in the form of mobile surface molecules. The threshold range of ICG molecule concentration was determined, at which there is a transition from aggregation with an increase in size with a slow addition of ICG J-aggregate molecules in height to a rapid addition in width.Индоцианин зеленый (ICG), находясь в растворе, способен образовывать стабильные структуры наночастиц или коллоидный раствор, изменяя при этом свои спектроскопические свойства. В работе различными методами, основанными на светорассеянии, были исследованы степень агрегации и средний размер наночастиц в зависимости от концентрации коллоидного раствора наночастиц индоцианина зеленого (ICG NPs) в форме J-агрегатов. Размер наночастиц представляет собой важный параметр с точки зрения клинического применения, так как техника внутривенного введения препаратов, с целью избежания тромбозов микрососудов и эмболии, предусматривает лекарственные формы с включениями, в виде отдельных молекул или их кластеров, не превышающими в диаметре 500 нм. С другой стороны, наночастицы размером менее 30 нм длительно циркулируют в организме и могут проникать в клетки здоровой ткани. В ходе исследований, было установлено, что увеличение концентрации ICG NPs в растворе ведет к увеличению среднего размера спонтанно формируемых J-агрегатов, что в свою очередь ведет к уменьшению коэффициента поглощения в агрегатах. Предположительно, нелинейная зависимость поглощения J-агрегата от его размера, может быть объяснен формированием центров поглощения на поверхности J-агрегата в виде подвижных поверхностных молекул. Был определен пороговый диапазон концентрации молекул ICG, при котором происходит переход от агрегации с увеличением размера с медленным прибавлением молекул J-агрегата ICG в высоту, но с быстрым прибавлением в ширину

Фотоиндуцированные процессы наночастиц оксида железа для усиления лазерной терапии

Nanoparticles are used as drug carriers to increase the selectivity and effectiveness of therapy, as well as for combined therapy that utilizes different effects. Iron oxide nanoparticles are promising in this aspect. Due to magnetic properties, they can be used as a contrast agent for magnetic resonance imaging. Also, iron oxide nanoparticles could be coated with a photosensitizer for photodynamic therapy and their laser or magnetic heating can be used for phototherapy. Local enhancement of the electromagnetic field near iron oxide nanoparticles can increase the fluorescence intensity of photosensitizers and the efficiency of singlet oxygen generation. This paper presents the results of a study of iron oxide nanoparticles focused on the photophysical aspects of the formation of “hot spots” under laser irradiation. The photoinduced effects of iron oxide nanoparticles observed in in vitro experiments lead to the rupture of lysosomes. Theoretical modeling showed that the heating of iron oxide nanoparticles with a radius of 35 nm under the action of laser radiation is about 89°C and 19°C for wavelengths of 458 and 561 nm, respectively. Local field enhancement occurs in pairs of nanoparticles of various sizes and strongly depends on the distance between them. The maximum gain is achieved at small distances between nanoparticles. For a dimer of nanoparticles with radii of 10 and 35 nm at a distance of 1 nm, an enhancement factor of two orders of magnitude was obtained. The investigated phenomenon of «hot spots» is in demand for precision therapy, because the photo-induced processes occur at small distances between nanoparticles, in areas of their high accumulation.Наночастицы используются в качестве носителей лекарственных средств для повышения селективности и эффективности терапии, а также для сочетанной терапии, объединяющей разные виды воздействия. Перспективными в этом аспекте являются наночастицы оксида железа. Благодаря магнитным свойствам, они могут быть применяться в качестве контраста для магнитно-резонансной томографии. Также наночастицы оксида железа могут быть покрыты фотосенсибилизатором для фотодинамической терапии, а их лазерный или магнитный нагрев этих частиц может используется для проведения фототерапии. При этом локальное усиление электромагнитного поля вблизи наночастиц оксида железа может повысить интенсивность флуоресценции фотосенсибилизаторов и эффективность генерации синглетного кислорода.В работе представлены результаты исследования наночастиц оксида железа, сфокусированного на фотофизических аспектах образования «горячих точек» при лазерном облучении. Фотоиндуцированные эффекты наночастиц оксида железа, наблюдаемые в экспериментах in vitro, приводят к разрыву лизосом. Теоретическое моделирование показало, что нагрев наночастиц оксида железа радиусом 35 нм под действием лазерного излучения составляет порядка 89˚С и 19˚С для длин волн 458 и 561 нм, соответственно. Локальное усиление поля возникает в парах из наночастиц различного размера и сильно зависит от расстояния между ними. Максимальное усиление достигается при малых расстояниях между наночастицами. Для димера наночастиц с радиусами 10 нм и 35 нм на расстоянии 1 нм получен фактор усиления на два порядка. Рассмотренное явление «горячих точек» востребовано для прецизионной терапии, так как фотоиндуцированные процессы возникают на малых расстояниях между наночастицами, в областях с их высоким накоплением

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ LaF3, ДОПИРОВАННЫХ Nd3+, ДЛЯ БИОИМИДЖИНГА В БЛИЖНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ ПО АП-КОНВЕРСИОННОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПРИ МИКРОСКОПИИ С МУЛЬТИФОТОННЫМ ВОЗБУЖДЕНИЕМ

Recent developments in the field of biophotonics facilitate the raise of interest to inorganic nanoparticles (NPs) doped with Nd3+ ions, because of their near-infrared (NIR) absorption. These NPs are interesting bioimaging probes for deep tissue visualization, while they can also act as local thermometers in biological tissues. Despite the good possibilities for visualization of NPs with Nd3+ ions in NIR spectral range, difficulties arise when studying the cellular uptake of these NPs using commercially available fluorescence microscopy systems, since the selection of suitable luminescence detectors is limited. However, Nd3+ ions are able to convert NIR radiation into visible light, showing upconversion properties. In this paper we found optimal parameters to excite upconversion luminescence of Nd3++:LaF NPs in living cells and to compare the distribution of the NPs inside the cell culture of human macrophages THP-1 obtained by two methods. Firstly, by detecting the upconversion luminescence of the NPs inVIS under NIR multiphoton excitation using laser scanning confocal microscopy and secondly, using transmission electron microscopy.Последние разработки в области биофотоники способствуют повышению интереса к неорганическим наночастицам (НЧ), допированным ионами Nd3+, из-за их поглощения в ближнем инфракрасном (БИК) спектральном диапазоне. Эти НЧ являются перспективными зондами для глубокой визуализации тканей, в то же время они могут служить локальными термометрами в биологических тканях. Несмотря на хорошие возможности визуализации НЧ с ионами Nd3+ в БИК спектральном диапазоне, при изучении внутриклеточного распределения этих НЧ с использованием коммерчески доступных флуоресцентных микроскопических систем возникают трудности из-за ограниченности выбора подходящих детекторов люминесценции. Однако, ионы Nd3+ способны преобразовывать БИК излучение в видимый свет, демонстрируя ап-конверсионные свойства. В этой работе мы определили оптимальные параметры для возбуждения ап-конверсионной люминесценции НЧ Nd3+: LaF в живых клетках и сравнили распределение НЧ внутри клеток культуры человеческих макрофагов THP-1, полученное двумя методами. Во-первых, путем регистрации ап-конверсионной люминесценции НЧ в видимом диапазоне при многофотонном возбуждении в БИК диапазоне спектра с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и, во-вторых, с использованием просвечивающей электронной микроскопии

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ КРОВОТОКА НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ АНГИОГРАФИИ В БЛИЖНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ

The results of evaluation of the soft tissue perfusion of the foot in patients with diabetes and critical lower limb ischemia (CLI) via fluorescence angiography (FAG) in the near-infrared range are represented in the article. The study included 4 diabetic patients with CLI. All patients underwent lower-limb balloon percutaneous transluminal angioplasty. To evaluate the soft tissue perfusion of the foot via FAG the following parameters have been used: T0m - time to reach maximum for fluorescence intensity after intravenous administration of Indocyanine green; TIm- time of onset of maximum fluorescence intensity after its appearance in the area of interest; Im - the level of the maximum fluorescence intensity. The region of interest was the skin around the wound of the foot. The median FAG parameters in the region of interest on the foot were as follows: prior to surgery T0m = 164 sec (148–181), TIm = 48 sec (38–56); after surgery: T0m = 80 sec (69–92); TIm = 27 sec (20–39); (p <0,05). No adverse reactions were registered in the study. Despite the small sample we were able to achieve statistical significance in the difference between the parameters prior to and after surgery. Further prospective studies with extended samples of patients are needed.В работе представлены результаты оценки перфузии мягких тканей стопы у пациентов с сахарным диабетом и критической ишемией нижних конечностей с помощью метода флуоресцентной ангиографии (ФАГ) в ближнем инфракрасном диапазоне. В исследование были включены 4 пациента с сахарным диабетом и критической ишемией нижних конечностей. Всем пациентам была выполнена чрескожная транслюминальная баллонная ангиопластика артерий нижних конечностей. Для оценки перфузии тканей стопы при помощи метода флуоресцентной ангиографии были определены следующие параметры: T0m – время достижения максимальной интенсивности флуоресценции с момента внутривенного введения индоцианина зеленого; TIm – время наступления максимальной интенсивности флуоресценции с момента ее появления в зоне интереса; Im – уровень максимальной интенсивности флуоресценции. Зоной интереса являлась кожа в околораневой зоне стопы. В результате были получены медианы параметров ФАГ в исследуемой области стопы: до операции – T0m = 164 с (от 148 до 181), TIm = 48 с (от 38 до 56), и после операции – T0m = 80 с (от 69 до 92), TIm = 27 с (от 20 до 39) (р<0,05). В ходе исследования неблагоприятных реакций зафиксировано не было. Несмотря на небольшую выборку, удалось получить статистически значимую разницу указанных параметров у пациентов до и после операции. Необходимо проведение дальнейших проспективных исследований с расширением выборки пациентов

An objective comparison of detection and segmentation algorithms for artefacts in clinical endoscopy

We present a comprehensive analysis of the submissions to the first edition of the Endoscopy Artefact Detection challenge (EAD). Using crowd-sourcing, this initiative is a step towards understanding the limitations of existing state-of-the-art computer vision methods applied to endoscopy and promoting the development of new approaches suitable for clinical translation. Endoscopy is a routine imaging technique for the detection, diagnosis and treatment of diseases in hollow-organs; the esophagus, stomach, colon, uterus and the bladder. However the nature of these organs prevent imaged tissues to be free of imaging artefacts such as bubbles, pixel saturation, organ specularity and debris, all of which pose substantial challenges for any quantitative analysis. Consequently, the potential for improved clinical outcomes through quantitative assessment of abnormal mucosal surface observed in endoscopy videos is presently not realized accurately. The EAD challenge promotes awareness of and addresses this key bottleneck problem by investigating methods that can accurately classify, localize and segment artefacts in endoscopy frames as critical prerequisite tasks. Using a diverse curated multi-institutional, multi-modality, multi-organ dataset of video frames, the accuracy and performance of 23 algorithms were objectively ranked for artefact detection and segmentation. The ability of methods to generalize to unseen datasets was also evaluated. The best performing methods (top 15%) propose deep learning strategies to reconcile variabilities in artefact appearance with respect to size, modality, occurrence and organ type. However, no single method outperformed across all tasks. Detailed analyses reveal the shortcomings of current training strategies and highlight the need for developing new optimal metrics to accurately quantify the clinical applicability of methods

Hardware and tool equipment for fluorescence diagnostics and photodynamic therapy

The results of hardware and tool development in photodynamic therapy and fluorescence diagnostics performed by the Natural Research Center, A.M. Prokhorov General Physics Institute, Russian Academy of Sciences in collaboration with several research and medical institutes are presented. Physical and technical aspects of the problem are mentioned. We describe schemes and the principle of operation of devices which we use with our medical colleagues in clinical and experimental studies. Some results of clinical use of the developed devices and methods are presented. </p

Hardware and tool equipment for fluorescence diagnostics and photodynamic therapy

The results of hardware and tool development in photodynamic therapy and fluorescence diagnostics performed by the Natural Research Center, A.M. Prokhorov General Physics Institute, Russian Academy of Sciences in collaboration with several research and medical institutes are presented. Physical and technical aspects of the problem are mentioned. We describe schemes and the principle of operation of devices which we use with our medical colleagues in clinical and experimental studies. Some results of clinical use of the developed devices and methods are presented