Bioprospecção de Fonsecaea pedrosoi em amostras ambientais por amplificação em círculo rolante (RCA)

Orientadora: Profa. Dra. Vania Aparecida VicenteCoorientadora: Profa. Dra. Renata Rodrigues GomesDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 23/03/2018Inclui referênciasResumo: As Leveduras negras sao fungos ascomicetos pigmentados de desenvolvimento lento predominatemente leveduriforme que ocupam diversos nichos ecológicos nos ecossistemas. As especies associadas a infecções em hospedeiros humanos e animais estão taxonomicamente acomodadas na ordem Chaetothyriales dentro da família Herpotrichiellaceae, reunindo entre outros os agentes causais da doença cromoblastomicose, uma micose subcutânea crônica, caracterizada pela presença de corpos muriformes no tecido hospedeiro. Dados epidemiológicos demonstram que a infecção ocorre por implantação frequentemente associada a um trauma por fragmentos vegetais. A região norte do Brasil é considerada área endêmica da doença, principalmente devido às características ocupacionais predominantemente rurais e extrativistas da população. O maior agente etiológico da cromoblastomicose é a espécie Fonsecaea pedrosoi, porém sua recuperação de substratos ambientais é restrita. Neste contexto, o objetivo principal deste estudo foi a investigação ambiental de F. pedrosoi em diversos nichos e substratos, atraves de amostras procedentes de áreas endêmicas da doença, por meio de ferramentas moleculares e métodos específicos de isolamento. Um total de 87 amostras foi analisado por ambos os métodos. Para o screening molecular foi aplicado o método de sonda cadeado baseado na técnica de Amplificação em Círculo Rolante (RCA) no DNA total das amostras estudadas. O agente de cromoblastomicose F. pedrosoi foi detectado pela sonda e amplificado por RCA em amostras de solo, material em decomposição e folha da planta Solanum paniculatum (jurubeba). O limite de detecção do método foi de 2.88x107 cópias do DNA de interesse. Para o isolamento foi utilizado o metodo seletivo de flotação em óleo mineral e a identificação dos isolados foi realizada por marcadores morfológicos e moleculares. Através do isolamento foram recuperadas 175 colônias negras, sendo 08 isolados morfologicamente semelhantes aos agentes de cromoblastomicose, identificados molecularmente como F. multimorphosa (n= 01), F. brasiliensis (n=04), C. ambígua (n=02) e C. guayanensis (n=01). Das amostras selecionadas pelo método molecular não foi possivel recuperar nenhuma linhagem de especies relacionadas à doença cromoblastomicose. Este foi o primeiro estudo a utilizar o método de sonda cadeado baseado em RCA como ferramenta de seleção ambiental o qual demonstrou a presença do DNA de F. pedrosoi em plantas. Entretanto, a baixa taxa de desenvolvimento e a natureza oligotrófica das espécies patogênicas, pode limitar a recuperação por métodos de isolamento, justificando a limitação do método e não recuperação das espécies patógenas das amostras positivas. Em conclusão, a sonda cadeado baseada em RCA é uma ferramenta adicional nos estudos destes agentes, a qual pode contribuir para inferência de dados sobre rotas de infeção da cromoblastomicose e da ocorrência ambiental destes patógenos. Palavras-chave: Leveduras negras. Sonda cadeado. Detecção ambiental. Chaetothyriales. Cromoblastomicose.Abstract: Black yeasts are melanized ascomycetous fungi, predominantly yeast-like, present in many ecological niches and ecosystems. The species associated with human and animal infections belong to the Chaetothyriales order, Herpotrichiellaceae family. Chromoblastomycosis is a chronic subcutaneous mycosis characterized by the presence of muriform cells in the host tissue. Epidemiological data demonstrate that the infection occurs by the implantation of the black yeast by trauma with plant fragments. The northern region of Brazil is an endemic area of the disease, due to the predominantly rural and extractive occupational characteristics of the population. The major etiological agent of chromoblastomycosis is Fonsecaea pedrosoi, but its recovery from environmental substrates is restricted. In this context, this study aim to investigate the presence of F. pedrosoi in several ecological niches and substrates from endemic areas of chromoblastomycosis by molecular tools and isolation by flotation in mineral oil. A total of 87 samples were analyzed for both methods. For the molecular screening, we applied the padlock probe based on the Rolling Circle Amplification (RCA) in the total DNA of the samples studied. Fonsecaea pedrosoi was detected by the padlock probe and RCA in soil, decomposing plant material and leaf of the plant Solanum paniculatum (jurubeba). The limit of detection of this method was 2.88×107 copies of the DNA. The selective method of flotation in mineral oil was performed and the isolates were idenfied by morphological and molecular markers. A total of 175 black colonies were recovered, 8 were macro and micromorphology similar to chromoblastomycosis agents and were identified by molecular methods as F. multimorphosa (n = 1), F. brasiliensis (n = 4), C. ambigua (n = 2) and C. guayanensis (n = 1). From the samples positive by the molecular method, no chromoblastomycosis agents were isolated. This was the first study to use padlock probe based on RCA for environmental detection of F. pedrosoi DNA in plants. In addition, the low development and the oligotrophic nature of the pathogenic species may limit the isolation by conventional techniques. In conclusion, the padlock probe based on RCA is an additional tool for these agents studies and contributes to elucidate the infection routes of chromoblastomycosis and environmental occurrence of these pathogens. Key-words: Black yeasts. Padlock Probe. Evironmental detection. Chaetothyriales, Chromoblastomycosis

PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS PATOGÊNICAS EM AMOSTRAS DE FEZES

A família Enterobacteriaceae (filo Proteobacteria, classe Gammaproteobacteria e ordem Enterobacteriales) compreende as bactérias Gram-negativas e agrega 42 gêneros, amplamente distribuídos no ambiente e, como o próprio nome sugere, compõe a microbiota intestinal dos animais. Essa família inclui diversos gêneros de micro-organismos patogênicos para o homem e para os animais, destacando-se os gêneros Salmonella, Shigella e Yersinia. O isolamento de espécies patogênicas a partir de material fecal envolve uma série de dificuldades, como o baixo título no qual são eliminadas nas fezes de indivíduos saudáveis; baixa competitividade diante da microbiota intestinal; necessidades especiais relacionadas à fisiologia e metabolismo; e o tamanho da população quando comparada às outras espécies que compõem a microbiota fecal. O objetivo com este trabalho foi avaliar quatro protocolos para isolamento de enterobactérias patogênicas em fezes de animais saudáveis. O primeiro consistiu no isolamento direto a partir das fezes (protocolo A). Estas foram diluídas em 10 mL de Água Peptonada Tamponada (APT) e, posteriormente, semeadas em Ágar MacConckey (MC). O segundo protocolo consistiu na diluição das fezes em APT e transferência de 100 uL para Caldo Muller Kaufmann Tetrationato (MKtt), que foi, então, incubado a 36 °C/24 horas e após o isolamento em ágar MC (protocolo B). O terceiro protocolo consistiu no pré-enriquecimento das fezes em APT e enriquecimento seletivo em MKtt e isolamento em ágar MC (protocolo C). O quarto protocolo foi similar ao terceiro, entretanto o enriquecimento seletivo foi em meio semissólido Rappaport Vassiliadis (MSRV) incubado a 42 °C/24 horas (protocolo D). Foi realizada uma adaptação nas recomendações do uso do meio MSRV e repicadas todas as culturas que demonstraram desenvolvimento microbiano independente da formação de zona de migração. Como material biológico, foram utilizadas seis amostras de fezes de morcegos. As amostras 1 e 2 não apresentaram desenvolvimento de culturas de enterobactérias em nenhum dos protocolos utilizados. As amostras 3 e 4 não apresentaram resposta nos protocolos A e B. As amostras 5 e 6 apresentaram desenvolvimento de enterobactérias nos quatro protocolos utilizados, sendo os protocolos B, C e D os que permitiram os isolamentos de enterobactérias patogênicas (Salmonella – protocolo B; Shigella – protocolos C e D; Ye­rsinia – protocolo D). Essa avaliação preliminar indica que as etapas de enriquecimento seletivo são indispensáveis para o isolamento de enterobactérias patogênicas em material fecal de indivíduos sem sinais de infecção. O estudo está em continuidade a fim de aumentar o número de amostras.Palavras-chave: Coprocultura. Morcegos. Salmonella. Shigella. Yersinia

INCIDÊNCIA DE BACTÉRIAS ENTEROPATOGÊNICAS EM FEZES DE MORCEGOS NO MUNICÍPIO DE JOAÇABA, SC

Morcegos são animais que se adaptam facilmente aos ambientes urbanos. A interação de animais silvestres com humanos é responsável pela crescente incidência de zoonoses, bem como permite a disseminação de patógenos típicos dos humanos e animais domésticos na fauna silvestre. O fluxo de contaminação ocorre pelo contato direto com animais contaminados ou pela transmissão indireta, por meio de vetores invertebrados ou resíduos de fezes. O estudo avaliou a incidência de enterobactérias patogênicas ao homem, isoladas a partir das fezes de morcegos capturados em um fragmento florestal antropizado, no Município de Joaçaba, SC. O período de coleta foi de agosto de 2013 a maio de 2014, totalizando oito meses de esforço amostral. Foram analisadas 23 amostras fecais provenientes de 29 espécimes diferentes de morcegos: Sturnira lilium, Nyctinomops laticaudatus, Molossus molossus, Arthibeus lituratus, Eptesicus brasiliensis, Eptesicus furinalis e Histiotus velatus. As coproculturas foram realizadas empregando três protocolos de isolamento. O primeiro consistiu no isolamento direto a partir das fezes. Estas foram diluídas em 10 mL de água peptonada tamponada e, posteriormente, semeadas em ágar MacConckey. O segundo protocolo consistiu no pré-enriquecimento das fezes em água peptonada tamponada seguido de enriquecimento seletivo em Caldo Muller Kaufmann Tetrationato e isolamento em ágar MacConckey. No terceiro protocolo buscou-se o isolamento de salmonelas móveis empregando o meio semissólido Rappaport Vassiliadis como meio seletivo após o pré-enriquecimento em água peptonada tamponada. A identificação bioquímica foi realizada com kits de identificação bioquímica (EMP/MIO/Lisina/Citrato de Simmons/Rhamnose). De um total de 359 culturas isoladas, 25,35% pertencem ao gênero Citrobacter, sendo este o mais frequente, seguido de Serratia sp. 22,01%, Escherichia coli 13,09%, Klebsiella sp. 11,98%, Providencia sp. 11,98%, Morganella morganii 6,41%, Proteus sp. 4,46%, Enterobacter sp. 2,79%, Yersinia sp. 0,84%, Shigella sp. 0,56%, Salmonella arizonae 0,28%, Salmonella spp. 0,28%. As enterobactérias identificadas no estudo atuam como parte da microbiota intestinal comum de mamíferos, porém são potencialmente patogênicas ao homem, podendo atuar como oportunistas causadoras de infecção, de interesse para a saúde pública.Palavras-chave: Zoonoses. Urbanização. Animais silvestres. Doença Bacter

INCIDÊNCIA DE BACTÉRIAS ENTEROPATOGÊNICAS EM FEZES DE MORCEGOS NO MUNICÍPIO DE JOAÇABA, SC.

Morcegos são animais que se adaptam facilmente em ambientes urbanos. A interação de animais silvestres com humanos é responsável pela crescente incidência de zoonoses, bem como afeta a propagação de patógenos na fauna silvestre. A contaminação ocorre pelo contato direto com animais contaminados ou pela transmissão indireta, através de vetores invertebrados ou animais domésticos. O estudo avalia a incidência de bactérias consideradas patogênicas ao homem, isoladas a partir das fezes de morcegos capturados em um fragmento florestal antropizado, localizado no município de Joaçaba, Santa Catarina. O período de coleta foi de agosto de 2013 a maio de 2014, totalizando oito meses de esforço amostral. Foram analisadas 15 amostras fecais provenientes de 15 espécimes diferentes de morcegos, sendo estas Sturnira lilium, Nyctinomos platicaudatus, Molossus molossus, Arthibeus lituratus, Eptesicus brasiliensis e Histiotus velatus. O método utilizado para o isolamento de enterobactérias foi o de Coprocultura, com a utilização de Ágar MacConckey, sendo identificados seis gêneros e duas espécies da família Enterobacteriaceae por meio de 10 provas bioquímicas. De um total de 171 cepas isoladas, 23,39% pertencem ao gênero Citrobacter, sendo este o mais frequente, seguido de Klebsiella (19,88%), Serratia (19,29%), Escherichia coli (13,45%), Providencia (11,11%), Morganella morganii (8,77%), Proteus (2,33%) e Enterobacter (1,75%). As Enterobactérias identificadas no estudo atuam como parte da microbiota intestinal comum de mamíferos, porém, são potencialmente patogênicas ao homem, podendo atuar como oportunistas causadores de infecção, de interesse para a saúde pública.Palavras-chave: Zoonoses. Urbanização. Animais Silvestres. Doença Bacteriana

Bioprospecção de Fonsecaea pedrosoi em amostras ambientais por amplificação em círculo rolante (RCA)

Orientadora: Profa. Dra. Vania Aparecida VicenteCoorientadora: Profa. Dra. Renata Rodrigues GomesDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 23/03/2018Inclui referênciasResumo: As Leveduras negras sao fungos ascomicetos pigmentados de desenvolvimento lento predominatemente leveduriforme que ocupam diversos nichos ecológicos nos ecossistemas. As especies associadas a infecções em hospedeiros humanos e animais estão taxonomicamente acomodadas na ordem Chaetothyriales dentro da família Herpotrichiellaceae, reunindo entre outros os agentes causais da doença cromoblastomicose, uma micose subcutânea crônica, caracterizada pela presença de corpos muriformes no tecido hospedeiro. Dados epidemiológicos demonstram que a infecção ocorre por implantação frequentemente associada a um trauma por fragmentos vegetais. A região norte do Brasil é considerada área endêmica da doença, principalmente devido às características ocupacionais predominantemente rurais e extrativistas da população. O maior agente etiológico da cromoblastomicose é a espécie Fonsecaea pedrosoi, porém sua recuperação de substratos ambientais é restrita. Neste contexto, o objetivo principal deste estudo foi a investigação ambiental de F. pedrosoi em diversos nichos e substratos, atraves de amostras procedentes de áreas endêmicas da doença, por meio de ferramentas moleculares e métodos específicos de isolamento. Um total de 87 amostras foi analisado por ambos os métodos. Para o screening molecular foi aplicado o método de sonda cadeado baseado na técnica de Amplificação em Círculo Rolante (RCA) no DNA total das amostras estudadas. O agente de cromoblastomicose F. pedrosoi foi detectado pela sonda e amplificado por RCA em amostras de solo, material em decomposição e folha da planta Solanum paniculatum (jurubeba). O limite de detecção do método foi de 2.88x107 cópias do DNA de interesse. Para o isolamento foi utilizado o metodo seletivo de flotação em óleo mineral e a identificação dos isolados foi realizada por marcadores morfológicos e moleculares. Através do isolamento foram recuperadas 175 colônias negras, sendo 08 isolados morfologicamente semelhantes aos agentes de cromoblastomicose, identificados molecularmente como F. multimorphosa (n= 01), F. brasiliensis (n=04), C. ambígua (n=02) e C. guayanensis (n=01). Das amostras selecionadas pelo método molecular não foi possivel recuperar nenhuma linhagem de especies relacionadas à doença cromoblastomicose. Este foi o primeiro estudo a utilizar o método de sonda cadeado baseado em RCA como ferramenta de seleção ambiental o qual demonstrou a presença do DNA de F. pedrosoi em plantas. Entretanto, a baixa taxa de desenvolvimento e a natureza oligotrófica das espécies patogênicas, pode limitar a recuperação por métodos de isolamento, justificando a limitação do método e não recuperação das espécies patógenas das amostras positivas. Em conclusão, a sonda cadeado baseada em RCA é uma ferramenta adicional nos estudos destes agentes, a qual pode contribuir para inferência de dados sobre rotas de infeção da cromoblastomicose e da ocorrência ambiental destes patógenos. Palavras-chave: Leveduras negras. Sonda cadeado. Detecção ambiental. Chaetothyriales. Cromoblastomicose.Abstract: Black yeasts are melanized ascomycetous fungi, predominantly yeast-like, present in many ecological niches and ecosystems. The species associated with human and animal infections belong to the Chaetothyriales order, Herpotrichiellaceae family. Chromoblastomycosis is a chronic subcutaneous mycosis characterized by the presence of muriform cells in the host tissue. Epidemiological data demonstrate that the infection occurs by the implantation of the black yeast by trauma with plant fragments. The northern region of Brazil is an endemic area of the disease, due to the predominantly rural and extractive occupational characteristics of the population. The major etiological agent of chromoblastomycosis is Fonsecaea pedrosoi, but its recovery from environmental substrates is restricted. In this context, this study aim to investigate the presence of F. pedrosoi in several ecological niches and substrates from endemic areas of chromoblastomycosis by molecular tools and isolation by flotation in mineral oil. A total of 87 samples were analyzed for both methods. For the molecular screening, we applied the padlock probe based on the Rolling Circle Amplification (RCA) in the total DNA of the samples studied. Fonsecaea pedrosoi was detected by the padlock probe and RCA in soil, decomposing plant material and leaf of the plant Solanum paniculatum (jurubeba). The limit of detection of this method was 2.88×107 copies of the DNA. The selective method of flotation in mineral oil was performed and the isolates were idenfied by morphological and molecular markers. A total of 175 black colonies were recovered, 8 were macro and micromorphology similar to chromoblastomycosis agents and were identified by molecular methods as F. multimorphosa (n = 1), F. brasiliensis (n = 4), C. ambigua (n = 2) and C. guayanensis (n = 1). From the samples positive by the molecular method, no chromoblastomycosis agents were isolated. This was the first study to use padlock probe based on RCA for environmental detection of F. pedrosoi DNA in plants. In addition, the low development and the oligotrophic nature of the pathogenic species may limit the isolation by conventional techniques. In conclusion, the padlock probe based on RCA is an additional tool for these agents studies and contributes to elucidate the infection routes of chromoblastomycosis and environmental occurrence of these pathogens. Key-words: Black yeasts. Padlock Probe. Evironmental detection. Chaetothyriales, Chromoblastomycosis

Isolation of <i>Beauveria</i> Strains and Their Potential as Control Agents for <i>Lema bilineata</i> Germar (Coleoptera: Chrysomelidae)

Lema bilineata Germar (Coleoptera: Chrysomelidae) was recently reported to damage Physalis peruviana crops in Brazil. Given the potential for inflicting damage on other Solanaceae species and the lack of alternatives for controlling this pest, we assessed the pathogenicity of 15 Beauveria isolates against L. bilineata adults in vitro. In addition, three of these isolates were tested for their ovicidal effect against L. bilineata eggs. Fungal strains were isolated from mummified corpses of L. bilineata collected in a non-commercial field in Paraná, Brazil. The isolates were identified as Beauveria bassiana using molecular markers. Lema bilineata adults were susceptible to conidial suspensions of all these isolates at a concentration of 108 conidia mL−1. Deaths caused by fungal extrusion were confirmed. Three strains were found to be more virulent against L. bilineata adults and showed ovicidal effects. This is the first study on entomopathogenic fungi isolated from dead insects collected from P. peruviana crops and tested against L. bilineata carried out in Brazil. The results obtained in the laboratory indicate the high potential of the use of three B. bassiana strains against L. bilineata as a biocontrol agent

INCIDÊNCIA DE BACTÉRIAS ENTEROPATOGÊNICAS EM FEZES DE MORCEGOS NO MUNICÍPIO DE JOAÇABA, SC

Morcegos são animais que se adaptam facilmente aos ambientes urbanos. A interação de animais silvestres com humanos é responsável pela crescente incidência de zoonoses, bem como permite a disseminação de patógenos típicos dos humanos e animais domésticos na fauna silvestre. O fluxo de contaminação ocorre pelo contato direto com animais contaminados ou pela transmissão indireta, por meio de vetores invertebrados ou resíduos de fezes. O estudo avaliou a incidência de enterobactérias patogênicas ao homem, isoladas a partir das fezes de morcegos capturados em um fragmento florestal antropizado, no Município de Joaçaba, SC. O período de coleta foi de agosto de 2013 a maio de 2014, totalizando oito meses de esforço amostral. Foram analisadas 23 amostras fecais provenientes de 29 espécimes diferentes de morcegos: Sturnira lilium, Nyctinomops laticaudatus, Molossus molossus, Arthibeus lituratus, Eptesicus brasiliensis, Eptesicus furinalis e Histiotus velatus. As coproculturas foram realizadas empregando três protocolos de isolamento. O primeiro consistiu no isolamento direto a partir das fezes. Estas foram diluídas em 10 mL de água peptonada tamponada e, posteriormente, semeadas em ágar MacConckey. O segundo protocolo consistiu no pré-enriquecimento das fezes em água peptonada tamponada seguido de enriquecimento seletivo em Caldo Muller Kaufmann Tetrationato e isolamento em ágar MacConckey. No terceiro protocolo buscou-se o isolamento de salmonelas móveis empregando o meio semissólido Rappaport Vassiliadis como meio seletivo após o pré-enriquecimento em água peptonada tamponada. A identificação bioquímica foi realizada com kits de identificação bioquímica (EMP/MIO/Lisina/Citrato de Simmons/Rhamnose). De um total de 359 culturas isoladas, 25,35% pertencem ao gênero Citrobacter, sendo este o mais frequente, seguido de Serratia sp. 22,01%, Escherichia coli 13,09%, Klebsiella sp. 11,98%, Providencia sp. 11,98%, Morganella morganii 6,41%, Proteus sp. 4,46%, Enterobacter sp. 2,79%, Yersinia sp. 0,84%, Shigella sp. 0,56%, Salmonella arizonae 0,28%, Salmonella spp. 0,28%. As enterobactérias identificadas no estudo atuam como parte da microbiota intestinal comum de mamíferos, porém são potencialmente patogênicas ao homem, podendo atuar como oportunistas causadoras de infecção, de interesse para a saúde pública.Palavras-chave: Zoonoses. Urbanização. Animais silvestres. Doença Bacter

INCIDÊNCIA DE BACTÉRIAS ENTEROPATOGÊNICAS EM FEZES DE MORCEGOS NO MUNICÍPIO DE JOAÇABA, SC.

Morcegos são animais que se adaptam facilmente em ambientes urbanos. A interação de animais silvestres com humanos é responsável pela crescente incidência de zoonoses, bem como afeta a propagação de patógenos na fauna silvestre. A contaminação ocorre pelo contato direto com animais contaminados ou pela transmissão indireta, através de vetores invertebrados ou animais domésticos. O estudo avalia a incidência de bactérias consideradas patogênicas ao homem, isoladas a partir das fezes de morcegos capturados em um fragmento florestal antropizado, localizado no município de Joaçaba, Santa Catarina. O período de coleta foi de agosto de 2013 a maio de 2014, totalizando oito meses de esforço amostral. Foram analisadas 15 amostras fecais provenientes de 15 espécimes diferentes de morcegos, sendo estas Sturnira lilium, Nyctinomos platicaudatus, Molossus molossus, Arthibeus lituratus, Eptesicus brasiliensis e Histiotus velatus. O método utilizado para o isolamento de enterobactérias foi o de Coprocultura, com a utilização de Ágar MacConckey, sendo identificados seis gêneros e duas espécies da família Enterobacteriaceae por meio de 10 provas bioquímicas. De um total de 171 cepas isoladas, 23,39% pertencem ao gênero Citrobacter, sendo este o mais frequente, seguido de Klebsiella (19,88%), Serratia (19,29%), Escherichia coli (13,45%), Providencia (11,11%), Morganella morganii (8,77%), Proteus (2,33%) e Enterobacter (1,75%). As Enterobactérias identificadas no estudo atuam como parte da microbiota intestinal comum de mamíferos, porém, são potencialmente patogênicas ao homem, podendo atuar como oportunistas causadores de infecção, de interesse para a saúde pública.Palavras-chave: Zoonoses. Urbanização. Animais Silvestres. Doença Bacteriana

Environmental prospecting of black yeast-like agents of human disease using culture-independent methodology

Contains fulltext : 230385.pdf (publisher's version ) (Open Access

Environmental Screening of Fonsecaea Agents of Chromoblastomycosis Using Rolling Circle Amplification

Chromoblastomycosis is a chronic, cutaneous or subcutaneous mycosis characterized by the presence of muriform cells in host tissue. Implantation disease is caused by melanized fungi related to black yeasts, which, in humid tropical climates, are mainly members of the genus Fonsecaea. In endemic areas of Brazil, F. pedrosoi and F. monophora are the prevalent species. The current hypothesis of infection is traumatic introduction via plant materials, especially by plant thorns. However, isolation studies have demonstrated a low frequency of the agents in environmental substrates. The present study aimed to detect F. pedrosoi and F. monophora in shells of babassu coconuts, soil, plant debris, and thorns from endemic areas of chromoblastomycosis in Maranh&atilde;o state, northern Brazil, using Rolling Circle Amplification (RCA) with padlock probes as a new environmental screening tool for agents of chromoblastomycosis. In addition to molecular screening, the environmental samples were analyzed by fungal isolation using mineral oil flotation. The limit of detection of the RCA method was 2.88 &times; 107 copies of DNA per sample for the used padlock probes, indicating that this represents an efficient and sensitive molecular tool for the environmental screening of Fonsecaea agents. In contrast, with isolation from the same samples using several selective methods, no agents of chromoblastomycosis were recovered