Circulating autoreactive proteinase 3(+) B cells and tolerance checkpoints in ANCA-associated vasculitis

BACKGROUND: Little is known about the autoreactive B cells in antineutrophil cytoplasmic antibody–associated (ANCA-associated) vasculitis (AAV). We aimed to investigate tolerance checkpoints of circulating antigen-specific proteinase 3–reactive (PR3(+)) B cells. METHODS: Multicolor flow cytometry in combination with bioinformatics and functional in vitro studies were performed on baseline samples of PBMCs from 154 well-characterized participants of the RAVE trial (NCT00104299) with severely active PR3-AAV and myeloperoxidase-AAV (MPO-AAV) and 27 healthy controls (HCs). Clinical data and outcomes from the trial were correlated with PR3(+) B cells (total and subsets). RESULTS: The frequency of PR3(+) B cells among circulating B cells was higher in participants with PR3-AAV (4.77% median [IQR, 3.98%–6.01%]) than in participants with MPO-AAV (3.16% median [IQR, 2.51%–5.22%]) and participants with AAV compared with HCs (1.67% median [IQR, 1.27%–2.16%], P < 0.001 for all comparisons), implying a defective central tolerance checkpoint in patients with AAV. Only PBMCs from participants with PR3-AAV contained PR3(+) B cells capable of secreting PR3-ANCA IgG in vitro, proving they were functionally distinct from those of participants with MPO-AAV and HCs. Unsupervised clustering identified subtle subsets of atypical autoreactive PR3(+) memory B cells accumulating through the maturation process in patients with PR3-AAV. PR3(+) B cells were enriched in the memory B cell compartment of participants with PR3-AAV and were associated with higher serum CXCL13 levels, suggesting an increased germinal center activity. PR3(+) B cells correlated with systemic inflammation (C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate, P < 0.05) and complete remission (P < 0.001). CONCLUSION: This study suggests the presence of defective central antigen-independent and peripheral antigen-dependent checkpoints in patients with PR3-AAV, elucidating the selection process of autoreactive B cells. TRIAL REGISTRATION: ClinicalTrials.gov NCT00104299. FUNDING: The Vasculitis Foundation, the National Institute of Allergy and Infectious Diseases of the NIH, and the Mayo Foundation for Education and Research

Caractérisation des lymphocytes B auto-réactifs dans le syndrome de Sjögren

B cells play a central role in primary Sjögren's syndrome (pSS), but little is known about the autoreactive B cells that secrete autoantibodies against the autoantigen SSA. Here, we aimed to characterize the circulating SSAspecific B cells (SSA+ B cells), in order to better understand the mechanisms leading to the breakdown of self-tolerance in patients with pSS.Using a flow-cytometry-based method, we detected and phenotypically characterized SSA+ B cells among peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from patients with pSS and from healthy controls (HCs). We tested their ability to secrete SSA-specific immunoglobulins in vitro following stimulation. Then, we performed a first experience of transcriptional profiling of these cells by single-cell RNA seq to understand further the characteristics of these autoreactive B cells in healthy subjects.Phenotype analysis showed an expansion of a CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ naïve B-cell subset with a downregulated B cell receptor in pSS patients.SSA+ B cells were also enriched within the IgMlow unswitched memory B-cell subset in patients, as well as in double negative (IgD-CD27-) and switched memory B cells of the different isotypes. Sorted SSA+ B cells from HCs were able to secrete in vitro IgM but not IgG anti-SSA immunoglobulins contrary to SSA+ B cells from pSS patients, that were able to secrete IgG autoantibodies. From the scRNA-seq analysis in a healthy subject, we obtained 6 clusters with 2 enriched in SSA+ B cells. DEG from clusters enriched with SSA+ B cells, showed upregulation of HLA genes implicated in the antigen presentation and negative regulation of BCR.Our results show that autoreactive SSA+ B cells in pSS patients maturate and reach the memory compartment, suggesting that they escape to the different layers of peripheral tolerance checkpoints and differentiate in vivo into anti-SSA antibody-secreting cells.Les LB jouent un rôle central dans le syndrome de Sjögren primitif (SSp), cependant très peu d’études ont été réalisées sur les caractéristiques des LB auto-réactifs qui sécrètent des autoanticorps contre l'auto-antigène SSA.Nous avons cherché à caractériser les LB circulants spécifiques de la SSA (LB SSA+), afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la rupture de la tolérance chez les patients atteints du SSp.En utilisant une méthode de cytométrie en flux, basée sur la spécificité du BCR, nous avons détecté et caractérisé phénotypiquement les LB SSA+ circulants chez des patients atteints de SSp et chez des contrôles sains (HCs). Nous avons testé leur capacité à sécréter des immunoglobulines spécifiques de la SSA in vitro après stimulation. Ensuite, nous avons réalisé une première expérience de profilage transcriptionnel de ces cellules par RNA seq unicellulaire afin de mieux comprendre le rôle des LB auto-réactifs chez les sujets sains.L'analyse du phénotype a montré une expansion d'un sous-ensemble de LB naïfs CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ avec un BCR régulé à la baisse chez les patients atteints de SSp.Les LB SSA+ étaient également enrichis parmi les LB mémoires non commutés IgMlow chez les patients, ainsi que dans les LB mémoires DN (IgD-CD27-) et commutés des différents isotypes. Les LB SSA+ triés, provenant d'un sujet sain, étaient capables de sécréter in vitro des immunoglobulines IgM mais pas IgG anti-SSA, contrairement aux LB SSA+ provenant de patients atteints de SSp, qui sont capables de sécréter des autoanticorps IgG spécifiques de SSA. Sur le plan transcriptomtique, les DEG du cluster enrichi en LB SSA+ ont montré une régulation positive des gènes HLA impliqués dans la présentation de l'antigène ainsi qu’une régulation négative du BCR par la surexpression de CD72.Nos résultats suggèrent que les LB SSA+ auto-réactifs, chez les patients atteints de SSP, sont enrichis dans le compartiment mémoire, ce qui suggère qu'ils échappent aux différents points de contrôle de la tolérance périphérique et se différencient in vivo encellules sécrétant des anticorps anti-SSA

Caractérisation des lymphocytes B auto-réactifs dans le syndrome de Sjögren

B cells play a central role in primary Sjögren's syndrome (pSS), but little is known about the autoreactive B cells that secrete autoantibodies against the autoantigen SSA. Here, we aimed to characterize the circulating SSAspecific B cells (SSA+ B cells), in order to better understand the mechanisms leading to the breakdown of self-tolerance in patients with pSS.Using a flow-cytometry-based method, we detected and phenotypically characterized SSA+ B cells among peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from patients with pSS and from healthy controls (HCs). We tested their ability to secrete SSA-specific immunoglobulins in vitro following stimulation. Then, we performed a first experience of transcriptional profiling of these cells by single-cell RNA seq to understand further the characteristics of these autoreactive B cells in healthy subjects.Phenotype analysis showed an expansion of a CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ naïve B-cell subset with a downregulated B cell receptor in pSS patients.SSA+ B cells were also enriched within the IgMlow unswitched memory B-cell subset in patients, as well as in double negative (IgD-CD27-) and switched memory B cells of the different isotypes. Sorted SSA+ B cells from HCs were able to secrete in vitro IgM but not IgG anti-SSA immunoglobulins contrary to SSA+ B cells from pSS patients, that were able to secrete IgG autoantibodies. From the scRNA-seq analysis in a healthy subject, we obtained 6 clusters with 2 enriched in SSA+ B cells. DEG from clusters enriched with SSA+ B cells, showed upregulation of HLA genes implicated in the antigen presentation and negative regulation of BCR.Our results show that autoreactive SSA+ B cells in pSS patients maturate and reach the memory compartment, suggesting that they escape to the different layers of peripheral tolerance checkpoints and differentiate in vivo into anti-SSA antibody-secreting cells.Les LB jouent un rôle central dans le syndrome de Sjögren primitif (SSp), cependant très peu d’études ont été réalisées sur les caractéristiques des LB auto-réactifs qui sécrètent des autoanticorps contre l'auto-antigène SSA.Nous avons cherché à caractériser les LB circulants spécifiques de la SSA (LB SSA+), afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la rupture de la tolérance chez les patients atteints du SSp.En utilisant une méthode de cytométrie en flux, basée sur la spécificité du BCR, nous avons détecté et caractérisé phénotypiquement les LB SSA+ circulants chez des patients atteints de SSp et chez des contrôles sains (HCs). Nous avons testé leur capacité à sécréter des immunoglobulines spécifiques de la SSA in vitro après stimulation. Ensuite, nous avons réalisé une première expérience de profilage transcriptionnel de ces cellules par RNA seq unicellulaire afin de mieux comprendre le rôle des LB auto-réactifs chez les sujets sains.L'analyse du phénotype a montré une expansion d'un sous-ensemble de LB naïfs CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ avec un BCR régulé à la baisse chez les patients atteints de SSp.Les LB SSA+ étaient également enrichis parmi les LB mémoires non commutés IgMlow chez les patients, ainsi que dans les LB mémoires DN (IgD-CD27-) et commutés des différents isotypes. Les LB SSA+ triés, provenant d'un sujet sain, étaient capables de sécréter in vitro des immunoglobulines IgM mais pas IgG anti-SSA, contrairement aux LB SSA+ provenant de patients atteints de SSp, qui sont capables de sécréter des autoanticorps IgG spécifiques de SSA. Sur le plan transcriptomtique, les DEG du cluster enrichi en LB SSA+ ont montré une régulation positive des gènes HLA impliqués dans la présentation de l'antigène ainsi qu’une régulation négative du BCR par la surexpression de CD72.Nos résultats suggèrent que les LB SSA+ auto-réactifs, chez les patients atteints de SSP, sont enrichis dans le compartiment mémoire, ce qui suggère qu'ils échappent aux différents points de contrôle de la tolérance périphérique et se différencient in vivo encellules sécrétant des anticorps anti-SSA

Caractérisation des lymphocytes B auto-réactifs dans le syndrome de Sjögren

B cells play a central role in primary Sjögren's syndrome (pSS), but little is known about the autoreactive B cells that secrete autoantibodies against the autoantigen SSA. Here, we aimed to characterize the circulating SSAspecific B cells (SSA+ B cells), in order to better understand the mechanisms leading to the breakdown of self-tolerance in patients with pSS.Using a flow-cytometry-based method, we detected and phenotypically characterized SSA+ B cells among peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from patients with pSS and from healthy controls (HCs). We tested their ability to secrete SSA-specific immunoglobulins in vitro following stimulation. Then, we performed a first experience of transcriptional profiling of these cells by single-cell RNA seq to understand further the characteristics of these autoreactive B cells in healthy subjects.Phenotype analysis showed an expansion of a CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ naïve B-cell subset with a downregulated B cell receptor in pSS patients.SSA+ B cells were also enriched within the IgMlow unswitched memory B-cell subset in patients, as well as in double negative (IgD-CD27-) and switched memory B cells of the different isotypes. Sorted SSA+ B cells from HCs were able to secrete in vitro IgM but not IgG anti-SSA immunoglobulins contrary to SSA+ B cells from pSS patients, that were able to secrete IgG autoantibodies. From the scRNA-seq analysis in a healthy subject, we obtained 6 clusters with 2 enriched in SSA+ B cells. DEG from clusters enriched with SSA+ B cells, showed upregulation of HLA genes implicated in the antigen presentation and negative regulation of BCR.Our results show that autoreactive SSA+ B cells in pSS patients maturate and reach the memory compartment, suggesting that they escape to the different layers of peripheral tolerance checkpoints and differentiate in vivo into anti-SSA antibody-secreting cells.Les LB jouent un rôle central dans le syndrome de Sjögren primitif (SSp), cependant très peu d’études ont été réalisées sur les caractéristiques des LB auto-réactifs qui sécrètent des autoanticorps contre l'auto-antigène SSA.Nous avons cherché à caractériser les LB circulants spécifiques de la SSA (LB SSA+), afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la rupture de la tolérance chez les patients atteints du SSp.En utilisant une méthode de cytométrie en flux, basée sur la spécificité du BCR, nous avons détecté et caractérisé phénotypiquement les LB SSA+ circulants chez des patients atteints de SSp et chez des contrôles sains (HCs). Nous avons testé leur capacité à sécréter des immunoglobulines spécifiques de la SSA in vitro après stimulation. Ensuite, nous avons réalisé une première expérience de profilage transcriptionnel de ces cellules par RNA seq unicellulaire afin de mieux comprendre le rôle des LB auto-réactifs chez les sujets sains.L'analyse du phénotype a montré une expansion d'un sous-ensemble de LB naïfs CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ avec un BCR régulé à la baisse chez les patients atteints de SSp.Les LB SSA+ étaient également enrichis parmi les LB mémoires non commutés IgMlow chez les patients, ainsi que dans les LB mémoires DN (IgD-CD27-) et commutés des différents isotypes. Les LB SSA+ triés, provenant d'un sujet sain, étaient capables de sécréter in vitro des immunoglobulines IgM mais pas IgG anti-SSA, contrairement aux LB SSA+ provenant de patients atteints de SSp, qui sont capables de sécréter des autoanticorps IgG spécifiques de SSA. Sur le plan transcriptomtique, les DEG du cluster enrichi en LB SSA+ ont montré une régulation positive des gènes HLA impliqués dans la présentation de l'antigène ainsi qu’une régulation négative du BCR par la surexpression de CD72.Nos résultats suggèrent que les LB SSA+ auto-réactifs, chez les patients atteints de SSP, sont enrichis dans le compartiment mémoire, ce qui suggère qu'ils échappent aux différents points de contrôle de la tolérance périphérique et se différencient in vivo encellules sécrétant des anticorps anti-SSA

Caractérisation des lymphocytes B auto-réactifs dans le syndrome de Sjögren

B cells play a central role in primary Sjögren's syndrome (pSS), but little is known about the autoreactive B cells that secrete autoantibodies against the autoantigen SSA. Here, we aimed to characterize the circulating SSAspecific B cells (SSA+ B cells), in order to better understand the mechanisms leading to the breakdown of self-tolerance in patients with pSS.Using a flow-cytometry-based method, we detected and phenotypically characterized SSA+ B cells among peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from patients with pSS and from healthy controls (HCs). We tested their ability to secrete SSA-specific immunoglobulins in vitro following stimulation. Then, we performed a first experience of transcriptional profiling of these cells by single-cell RNA seq to understand further the characteristics of these autoreactive B cells in healthy subjects.Phenotype analysis showed an expansion of a CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ naïve B-cell subset with a downregulated B cell receptor in pSS patients.SSA+ B cells were also enriched within the IgMlow unswitched memory B-cell subset in patients, as well as in double negative (IgD-CD27-) and switched memory B cells of the different isotypes. Sorted SSA+ B cells from HCs were able to secrete in vitro IgM but not IgG anti-SSA immunoglobulins contrary to SSA+ B cells from pSS patients, that were able to secrete IgG autoantibodies. From the scRNA-seq analysis in a healthy subject, we obtained 6 clusters with 2 enriched in SSA+ B cells. DEG from clusters enriched with SSA+ B cells, showed upregulation of HLA genes implicated in the antigen presentation and negative regulation of BCR.Our results show that autoreactive SSA+ B cells in pSS patients maturate and reach the memory compartment, suggesting that they escape to the different layers of peripheral tolerance checkpoints and differentiate in vivo into anti-SSA antibody-secreting cells.Les LB jouent un rôle central dans le syndrome de Sjögren primitif (SSp), cependant très peu d’études ont été réalisées sur les caractéristiques des LB auto-réactifs qui sécrètent des autoanticorps contre l'auto-antigène SSA.Nous avons cherché à caractériser les LB circulants spécifiques de la SSA (LB SSA+), afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la rupture de la tolérance chez les patients atteints du SSp.En utilisant une méthode de cytométrie en flux, basée sur la spécificité du BCR, nous avons détecté et caractérisé phénotypiquement les LB SSA+ circulants chez des patients atteints de SSp et chez des contrôles sains (HCs). Nous avons testé leur capacité à sécréter des immunoglobulines spécifiques de la SSA in vitro après stimulation. Ensuite, nous avons réalisé une première expérience de profilage transcriptionnel de ces cellules par RNA seq unicellulaire afin de mieux comprendre le rôle des LB auto-réactifs chez les sujets sains.L'analyse du phénotype a montré une expansion d'un sous-ensemble de LB naïfs CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ avec un BCR régulé à la baisse chez les patients atteints de SSp.Les LB SSA+ étaient également enrichis parmi les LB mémoires non commutés IgMlow chez les patients, ainsi que dans les LB mémoires DN (IgD-CD27-) et commutés des différents isotypes. Les LB SSA+ triés, provenant d'un sujet sain, étaient capables de sécréter in vitro des immunoglobulines IgM mais pas IgG anti-SSA, contrairement aux LB SSA+ provenant de patients atteints de SSp, qui sont capables de sécréter des autoanticorps IgG spécifiques de SSA. Sur le plan transcriptomtique, les DEG du cluster enrichi en LB SSA+ ont montré une régulation positive des gènes HLA impliqués dans la présentation de l'antigène ainsi qu’une régulation négative du BCR par la surexpression de CD72.Nos résultats suggèrent que les LB SSA+ auto-réactifs, chez les patients atteints de SSP, sont enrichis dans le compartiment mémoire, ce qui suggère qu'ils échappent aux différents points de contrôle de la tolérance périphérique et se différencient in vivo encellules sécrétant des anticorps anti-SSA

Characterisation of autoreactives B cells in Sjögren's syndrome

Les LB jouent un rôle central dans le syndrome de Sjögren primitif (SSp), cependant très peu d’études ont été réalisées sur les caractéristiques des LB auto-réactifs qui sécrètent des autoanticorps contre l'auto-antigène SSA.Nous avons cherché à caractériser les LB circulants spécifiques de la SSA (LB SSA+), afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la rupture de la tolérance chez les patients atteints du SSp.En utilisant une méthode de cytométrie en flux, basée sur la spécificité du BCR, nous avons détecté et caractérisé phénotypiquement les LB SSA+ circulants chez des patients atteints de SSp et chez des contrôles sains (HCs). Nous avons testé leur capacité à sécréter des immunoglobulines spécifiques de la SSA in vitro après stimulation. Ensuite, nous avons réalisé une première expérience de profilage transcriptionnel de ces cellules par RNA seq unicellulaire afin de mieux comprendre le rôle des LB auto-réactifs chez les sujets sains.L'analyse du phénotype a montré une expansion d'un sous-ensemble de LB naïfs CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ avec un BCR régulé à la baisse chez les patients atteints de SSp.Les LB SSA+ étaient également enrichis parmi les LB mémoires non commutés IgMlow chez les patients, ainsi que dans les LB mémoires DN (IgD-CD27-) et commutés des différents isotypes. Les LB SSA+ triés, provenant d'un sujet sain, étaient capables de sécréter in vitro des immunoglobulines IgM mais pas IgG anti-SSA, contrairement aux LB SSA+ provenant de patients atteints de SSp, qui sont capables de sécréter des autoanticorps IgG spécifiques de SSA. Sur le plan transcriptomtique, les DEG du cluster enrichi en LB SSA+ ont montré une régulation positive des gènes HLA impliqués dans la présentation de l'antigène ainsi qu’une régulation négative du BCR par la surexpression de CD72.Nos résultats suggèrent que les LB SSA+ auto-réactifs, chez les patients atteints de SSP, sont enrichis dans le compartiment mémoire, ce qui suggère qu'ils échappent aux différents points de contrôle de la tolérance périphérique et se différencient in vivo encellules sécrétant des anticorps anti-SSA.B cells play a central role in primary Sjögren's syndrome (pSS), but little is known about the autoreactive B cells that secrete autoantibodies against the autoantigen SSA. Here, we aimed to characterize the circulating SSAspecific B cells (SSA+ B cells), in order to better understand the mechanisms leading to the breakdown of self-tolerance in patients with pSS.Using a flow-cytometry-based method, we detected and phenotypically characterized SSA+ B cells among peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from patients with pSS and from healthy controls (HCs). We tested their ability to secrete SSA-specific immunoglobulins in vitro following stimulation. Then, we performed a first experience of transcriptional profiling of these cells by single-cell RNA seq to understand further the characteristics of these autoreactive B cells in healthy subjects.Phenotype analysis showed an expansion of a CD19+IgD+CD27-CD21low/-CD11c-SSA+ naïve B-cell subset with a downregulated B cell receptor in pSS patients.SSA+ B cells were also enriched within the IgMlow unswitched memory B-cell subset in patients, as well as in double negative (IgD-CD27-) and switched memory B cells of the different isotypes. Sorted SSA+ B cells from HCs were able to secrete in vitro IgM but not IgG anti-SSA immunoglobulins contrary to SSA+ B cells from pSS patients, that were able to secrete IgG autoantibodies. From the scRNA-seq analysis in a healthy subject, we obtained 6 clusters with 2 enriched in SSA+ B cells. DEG from clusters enriched with SSA+ B cells, showed upregulation of HLA genes implicated in the antigen presentation and negative regulation of BCR.Our results show that autoreactive SSA+ B cells in pSS patients maturate and reach the memory compartment, suggesting that they escape to the different layers of peripheral tolerance checkpoints and differentiate in vivo into anti-SSA antibody-secreting cells

Caractérisation des lymphocytes B autoréactifs en physiologie et au cours des maladies auto-immunes

International audienc

Study of functional orientation of B cells in physiology and Sjögren’s syndrome.

International audienc

Study of functional orientation of B cells in physiology and Sjögren’s syndrome.

International audienc

Innate B Cells: the Archetype of Protective Immune Cells

International audienceThe innate B cell (IBC) population is heterogeneous and involved in the primary immune response. IBC functions include a high ability to produce natural antibodies with IgM isotype, the elimination of apoptotic cells, and a capacity to be cognate help to T cells. Among IBC subsets, B-1 cells and marginal zone B cells are the main producers of IgM, act as rapid immune responders that may relocate to follicular lymphoid and differentiate to cytokine and antibody-secreting cells shortly after infection. IBCs functions are highly dependent on their localization site and the nature of their B cell receptor repertoire, suggesting a high plasticity range of different immune responses. In this review, we will describe the nature and functions of the different innate-like B cell subsets, first in mice and then in humans. Besides this, we will emphasize the strong ability of these cells to undertake different protective functions from the first line of defense against pathogens to the regulatory role of the broader immune response