Phospholipase D protects ECV304 cells against TNFα-induced apoptosis

AbstractTumor necrosis factor α (TNFα), a pleiotropic cytokine, activates both apoptotic and pro-survival signals depending on the cell model. Using ECV304 cells, which can be made TNFα-sensitive by cycloheximide (CHX) co-treatment, we evaluated the potential roles of ceramide and phospholipase D (PLD) in TNFα-induced apoptosis. TNFα/CHX induced a robust increase in ceramide levels after 16h of treatment when cell death was maximal. PLD activity was increased at early time point (1h) whereas both PLD activity and PLD1 protein were strongly decreased after 24h. TNFα/CHX-induced cell death was significantly lowered by exogenous bacterial PLD and phoshatidic acid, and in cells overexpressing PLD1. Conversely, cells depleted in PLD proteins by small interference RNA (siRNA) treatment exhibited higher susceptibility to apoptosis. These results show that PLD exerts a protective role against TNFα-induced cell death

The cAMP-specific Phosphodiesterase PDE4D3 Is Regulated by Phosphatidic Acid Binding CONSEQUENCES FOR cAMP SIGNALING PATHWAY AND CHARACTERIZATION OF A PHOSPHATIDIC ACID BINDING SITE

Hormones and growth factors induce in many cell types the production of phosphatidic acid (PA), which has been proposed to play a role as a second messenger. We have previously shown in an acellular system that PA selectively stimulates certain isoforms of type 4 cAMP-phosphodiesterases (PDE4). Here we studied the effect of endogenous PA on PDE activity of transiently transfected MA10 cells overexpressing the PA-sensitive isoform PDE4D3. Cell treatment with inhibitors of PA degradation, including propranolol, induced an accumulation of endogenous PA accompanied by a stimulation of PDE activity and a significant decrease in both cAMP levels and protein kinase A activity. Furthermore, in FRTL5 cells, which natively express PDE4D3, pretreatment with compounds inducing PA accumulation prevented both cAMP increase and cAMP-responsive element-binding protein phosphorylation triggered by thyroid-stimulating hormone. To determine the mechanism of PDE stimulation by PA, endogenous phospholipids were labeled by preincubating MA10 cells overexpressing PDE4D3 with [(32)P]orthophosphate. Immuno- precipitation experiments showed that PA was specifically bound to PDE4D3, supporting the hypothesis that PDE4D3 activation occurs through direct binding of PA to the protein. PA binding site on PDE4D3 was characterized by engineering deletions of selected regions in the N-terminal regulatory domain of the enzyme. Deletion of amino acid residues 31-59 suppressed both PA-activating effect and PA binding, suggesting that this region rich in basic and hydrophobic residues contains the PA binding site. These observations strongly suggest that endogenous PA can modulate cAMP levels in intact cells, through a direct activation of PDE4D3

The Mechanism of Docosahexaenoic Acid-induced Phospholipase D Activation in Human Lymphocytes Involves Exclusion of the Enzyme from Lipid Rafts

Docosahexaenoic acid (DHA), an n-3 polyunsaturated fatty acid that inhibits T lymphocyte activation, has been shown to stimulate phospholipase D (PLD) activity in stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). To elucidate the mechanisms underlying the DHA-induced PLD activation, we first characterized the PLD expression pattern of PBMC. We show that these cells express PLD1 and PLD2 at the protein and mRNA level and are devoid of oleate-dependent PLD activity. DHA enrichment of PBMC increased the DHA content of cell phospholipids, which was directly correlated with the extent of PLD activation. The DHA-induced PLD activation was independent of conventional protein kinase C but inhibited by brefeldin A, which suggests ADP-ribosylation factor (ARF)-dependent mechanism. Furthermore, DHA enrichment dose-dependently stimulated ARF translocation to cell membranes. Whereas 50% of the guanosine 5'-3-O-(thio)triphosphate plus ARF-dependent PLD activity and a substantial part of PLD1 protein were located to the detergent-insoluble membranes, so-called rafts, of non-enriched PBMC, DHA treatment strongly displaced them toward detergent-soluble membranes where ARF is present. Collectively, these results suggest that the exclusion of PLD1 from lipid rafts, due to their partial disorganization by DHA, and its relocalization in the vicinity of ARF, is responsible for its activation. This PLD activation might be responsible for the immunosuppressive effect of DHA because it is known to transmit antiproliferative signals in lymphoid cells

Microdomaines lipidiques et régulation de la PLD du lymphocyte humain (rôle de l'acide docosahexaénoïque)

L'acide docosahexaénoïque (DHA), un acide gras polyinsaturé de la famille n-3, a été décrit comme capable d'inhiber l'activation du lymphocyte aussi bien in vitro qu'in vivo. Cette inhibition s'accompagne d'une activation de la phospholipase D (PLD). Afin d'élucider les mécanismes mis en jeu lors de l'activation de la PLD par le DHA dans les cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC), nous avons tout d'abord caractérisé les isoformes de PLD exprimées dans ces cellules ainsi que leur mode de régulation. Les PBMC expriment deux isoformes de PLD, PLD1 et PLD2, aussi bien au niveau des ARN messagers que des protéines, mais sont dépourvues de PLD oléate-sensible. L'activité PLD révélée lors de la stimulation mitogénique après enrichissement en DHA, s'est avérée indépendante des PKC, mais dépendante des petites protéines-G ARF, suggérant une implication de PLD1 principalement. Nous avons également pu mettre en évidence que PLD1 est liée à des structures particulières de la membrane, riches en cholestérol et sphingomyéline, les microdomaines lipidiques ou "rafts". PLD2 en revanche en est exclue. Après enrichissement des membranes cellulaires en DHA et stimulation par la concanavaline A, la PLD1 est délocalisée hors des "rafts", de même que certaines protéines de signalisation telles que les protéines tyrosine kinases Lck ou les protéines ARF. Le traitement des PBMC par des molécules capables de modifier le contenu membranaire des cellules en cholestérol (filipine, méthyl-b-cyclodextrine) ou en sphingomyéline (sphingomyélinase bactérienne), et donc de perturber sélectivement l'organisation des rafts, stimule fortement l'activité PLD et cette activation s'accompagne d'une délocalisation de la protéine PLD1. Parallèlement ces molécules inhibent la réponse lymphoproliférative aux mitogènes. L'ensemble de nos résultats montre que la déstabilisation partielle des microdomaines membranaires provoque la délocalisation de protéines de signalisation ainsi que de la PLD1 hors des microdomaines. La relocalisation de PLD1 dans un environnement lipidique et protéique diffèrent apparaît comme un nouveau mécanisme régulateur, de l'activation de l'enzyme. L'émission d'un signal anti-mitogénique par la PLD pourrait expliquer au moins partiellement l'effet immunosuppresseur du DHA.The inhibition of the lymphoproliferative response by docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3) is accompanied by the activation of phospholipase D. To elucidate the mechanisms involved, we characterized the different PLD isoforms of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC). These cells express PLD1 and PLD2, both at the m-RNA and protein levels, but they are devoid of oleate-sensitive PLD. PLD activity induced by the mitogenic stimulation of DHA-enriched cells was independent of PKC but dependent of the small G-proteins ARF, indicating that PLD1 was mainly involved. We also pointed out that PLD1 was associated to cholesterol and sphingomyelin-enriched lipid microdomains or "rafts". In contrast, PLD2 was excluded from these structures. After enrichment of the cellular membranes with DHA and stimulation, PLD1 as well as the protein tyrosine kinase Lck and ARF were delocalised out of the rafts. The treatment of cellular membranes by molecules able to modify their cholesterol or shingomyelin contents and to disturb selectively raft organization, strongly stimulated PLD activity and was accompanied by a delocalisation of the PLD1 protein. In parallel, the lymphoproliferative response to mitogenes was decreased. These results show that the partial destabilization of the rafts delocalises signalling proteins and PLD1 out of the rafts. The relocalization of the PLD1 in a different lipid and protein environment appears as a new regulatory mechanisms of PLD activation. Because PLD activation is known to convey antiproliferative signals, this could partially explain the immunosuppression effect of DHA.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des huiles d'argan, de poisson et d'olive (effets comparés de leurs acides gras)

L'huile d'argan est extraite de l'arganier "Argania spinosa". Cette huile est caractérisée par sa composition lipidique unique et sa richesse en acides oléique et linoléique. Alors qu'elle suscite un intérêt croissant pour ses effets bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires, son rôle potentiel sur les fonctions immunitaires n'est pas connu. C'est pourquoi, nous avons réalisé une étude nutritionnelle visant à comparer l'effet immunomodulateur d'un régime enrichi en huile d'argan (HA) à ceux des régimes riches enhuiles de poisson (HP), d'olive (HO), de noix de coco (HC) et de tournesol (HT), administrés pendant quatre semaines chez le rat. Nos résultats ont montré que les différents régimes induisent des changements dans la composition en acides gras des triglycérides et des phospholipides plasmatiques, et à un degré moindre dans les phospholipides des thymocytes. Les thymocytes des rats nourris avec un régime enrichi en huile de coco ont une réponse proliférative significativement diminuée par rapport aux autres groupes, alors que les réponses les plus fortes sont observées chez les animaux des groupes poisson et tournesol. De plus, une corrélation positive a été établie entre la réponse proliférative aux mitogènes et la proportion de 18:2n-6 dans les phospholipides cellulaires, quel que soit le régime. Cette réponse proliférative est aussi corrélée négativement avec l'activité phospholipase D (PLD) thymocytaire. Les résultats de Western blotting indiquent que les variations d'activités PLD induites par les différents régimes reflètent essentiellemnt les variations d'expression de la protéine PLD2. Parallèlement, des travaux ont été réalisés in vitro afin de vérifier les effets des acides gras majeurs des différentes huiles sur la prolifération et l'activité PLD. Nous avons mis en évidence une corrélation négative entre la réponse proliférative aux mitogènes et l'activité PLD. L'ensemble de nos résultats indique que l'huile d'argan est dépourvue d'effets majeurs sur la prolifération lymphocytaire et que son profil immunomodulateur est proche de celui de l'huile d'olive. L'huile d'argan s'étant montrée par ailleurs plus efficace dans la prévention des maladies cardiovasculaires, sa consommation peut être recommandée sans restriction puisqu'elle est dépourvue d'effets secondaires au niveau du sytème immunitaire.Argan oil is rich in unsaturated fatty acids especially oleic acids. This oil is receiving increasing attention due to its potential health benefits in the prevention of cardiovascular risk, but no information to date about its possible effect on immune cells and functions. To address this issue male rats were fed one of five diets that contained either fish oil, olive oil, coconut oil or sunflower oil for 4 wk. Our results showed that the various diets induced significant changes in the fatty acid composition of plasma triacylglycerols and phospholips and thymocyte phosphlipids. Furthermore, a significant positive linear relationship was found between thymocyte proliferation and the 18:2n-6 proportion of thymocyte phospholipids whatever the diet. The proliferation response of thymcytes to mitogenic activation was also inversely correlated to the phospholipase D (PLD) activity measured in intact thymocytes. In parallel, an in vitro study was performed to investigate the effects of the major fatty acids of the various oils on the proliferation and PLD activity of rat thymocytes. On the whole, the present study shows that the effects of argan oil on immune cells are very are very similar to those of olive, and that, as a consequence, argan oil can be used as a balanced dietary supply without marked adverse effects on immune cell function.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceMoroccoFRM

Adhésion des lymphocytes à l'endothélium vasculaire (mécanismes impliqués dans la production de prostacycline induite)

Le but de cette étude était de déterminer les mécanismes impliqués dans l'induction de la synthèse de prostacyline (PGI2) endothéliale par le contact avec des lymphocytes (L) humains in vitro. La coincubation des cellules endothéliales de veine de cordon ombilical (HUVEC) avec des lymphocytes augmente de 2,5 fois la production basale de PGI2 dans des HUVEC incubées seules. Cette augmentation est observée lors de la coincubation des cellules dans un milieu dépourvu en sérum avec un rapport L/HUVEC de 9:1. La synthèse de PGI2 est maximale après 4 h. de coincubation. Cet effet est spécifique des lymphocytes car la réponse n'est pas observée lorsque les HUVEC sont coincubées avec d'autres cellules sanguines ou avec des billes de latex. Le contact des lymphocytes aux HUVEC est capable d'activer ces dernières et d'induire l'expression des molécules d'adhésion endothéliales (ECAMs), telles que la sélectine-E, VCAM-1 et ICAM-1. L'effet des lymphocytes sur la production de PGI2 par des HUVEC préalablement incubées avec des anticorps anti-ECAMs n'est pas modifié, indiquant que ces ECAMs ne sont pas impliquées dans le mécanisme. En revanche, l'inhibition de tyrosines kinases du type Src bloque totalement l'effet inducteur des lymphocytes. La participation de p42/p44MAPK dans la cascade de signalisation est fortement suggérée par la présence de sa forme phosphorylée dès la première heure de coincubation. L'enrichissement des phospholipides cellulaires en acides gras w-3, assuré par la culture des cellules dans un milieu contenant EPA ou DHA avant la coincubation, est sans effet sur l'induction de PGI2. Néanmoins, l'effet inhibiteur de ces acides gras sur l'adhésion lymphocytaire à l'endothélium est constaté par la moindre adhésion de lymphocytes marqués au 51Cr préalablement enrichis à des HUVEC également enrichies en EPA ou DHA. Ces résultats suggèrent que la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes pourrait constituer un mécanisme de défense contre l'accumulation excessive de leucocytes sur la paroi vasculaire, situation physiopathologique qui survient durant l'atherogenèse.Prostacyclin (PGI2), regulates haemostasis, vascular tone, as well as the proliferation of smooth muscle cells. We have previously reported that human peripheral blood lymphocyte (L) contact to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) enhances PGI2 output involving a cPLA2 pathway. Here, we demonstrate the specificity of lymphocytes in switching-on this response. PGI2 synthesis during coincubation of L/HUVEC was maximal at 4 h, reaching a plateau thereafter for up to 20 h. L/HUVEC coincubated in serum-free medium, at a ratio of 9:1, under static or dynamic conditions, enhanced the basal (HUVEC alone) PGI2 output by 2.5-fold. Preactivation of either cell is not required but the mechanism depends on a specific contact with lymphocytes shown by the absence of effect when HUVEC were coincubated with resting neutrophils, platelets or latex beads at a ratio of 9:1. Blocking endothelial cell adhesion molecules (ECAM) E-selectin, VCAM-1 or ICAM-1 did not modify the L/HUVEC effect. However, 51Cr-labeled L adhesion was significantly decreased with anti-ICAM-1. Contrariwise, tyrosine proteins kinases of the Scr family show to be essential. Moreover, phosphorylation of p42/p44MAPK evidenced by western-blot occurred as early as 1 h of coincubation remaining up to 4 h. Furthermore, the lymphocyte-induced PGI2-output was totally abolished when inhibiting MAPKK by using PD98059, 25 moles/L, a concentration well known to restrain p42/p44MAPK phosphorylation. Changes in fatty acid composition of membrane phospholipids (PL) induced by incubation for 3 days with eicosapentaenoic or docosahexaenoic acids resulted in less basal PGI2 output and adhesion of 51Cr- labeled lymphocytes whilst the lymphocyte-induced PGI2 output was not modified. This lymphocyte-induced PGI2 synthesis which does not primarily involves ECAM pathway is independent of PL fatty acid composition and signals through the p42/p44MAPK cascade. This physiological response might serve as a switch-on step for operation of host defense against atherogenesis.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

Adhésion des lymphocytes à l'endothélium vasculaire (mécanismes impliqués dans la production de prostacycline induite)

Le but de cette étude était de déterminer les mécanismes impliqués dans l'induction de la synthèse de prostacyline (PGI2) endothéliale par le contact avec des lymphocytes (L) humains in vitro. La coincubation des cellules endothéliales de veine de cordon ombilical (HUVEC) avec des lymphocytes augmente de 2,5 fois la production basale de PGI2 dans des HUVEC incubées seules. Cette augmentation est observée lors de la coincubation des cellules dans un milieu dépourvu en sérum avec un rapport L/HUVEC de 9:1. La synthèse de PGI2 est maximale après 4 h. de coincubation. Cet effet est spécifique des lymphocytes car la réponse n'est pas observée lorsque les HUVEC sont coincubées avec d'autres cellules sanguines ou avec des billes de latex. Le contact des lymphocytes aux HUVEC est capable d'activer ces dernières et d'induire l'expression des molécules d'adhésion endothéliales (ECAMs), telles que la sélectine-E, VCAM-1 et ICAM-1. L'effet des lymphocytes sur la production de PGI2 par des HUVEC préalablement incubées avec des anticorps anti-ECAMs n'est pas modifié, indiquant que ces ECAMs ne sont pas impliquées dans le mécanisme. En revanche, l'inhibition de tyrosines kinases du type Src bloque totalement l'effet inducteur des lymphocytes. La participation de p42/p44MAPK dans la cascade de signalisation est fortement suggérée par la présence de sa forme phosphorylée dès la première heure de coincubation. L'enrichissement des phospholipides cellulaires en acides gras w-3, assuré par la culture des cellules dans un milieu contenant EPA ou DHA avant la coincubation, est sans effet sur l'induction de PGI2. Néanmoins, l'effet inhibiteur de ces acides gras sur l'adhésion lymphocytaire à l'endothélium est constaté par la moindre adhésion de lymphocytes marqués au 51Cr préalablement enrichis à des HUVEC également enrichies en EPA ou DHA. Ces résultats suggèrent que la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes pourrait constituer un mécanisme de défense contre l'accumulation excessive de leucocytes sur la paroi vasculaire, situation physiopathologique qui survient durant l'atherogenèse.Prostacyclin (PGI2), regulates haemostasis, vascular tone, as well as the proliferation of smooth muscle cells. We have previously reported that human peripheral blood lymphocyte (L) contact to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) enhances PGI2 output involving a cPLA2 pathway. Here, we demonstrate the specificity of lymphocytes in switching-on this response. PGI2 synthesis during coincubation of L/HUVEC was maximal at 4 h, reaching a plateau thereafter for up to 20 h. L/HUVEC coincubated in serum-free medium, at a ratio of 9:1, under static or dynamic conditions, enhanced the basal (HUVEC alone) PGI2 output by 2.5-fold. Preactivation of either cell is not required but the mechanism depends on a specific contact with lymphocytes shown by the absence of effect when HUVEC were coincubated with resting neutrophils, platelets or latex beads at a ratio of 9:1. Blocking endothelial cell adhesion molecules (ECAM) E-selectin, VCAM-1 or ICAM-1 did not modify the L/HUVEC effect. However, 51Cr-labeled L adhesion was significantly decreased with anti-ICAM-1. Contrariwise, tyrosine proteins kinases of the Scr family show to be essential. Moreover, phosphorylation of p42/p44MAPK evidenced by western-blot occurred as early as 1 h of coincubation remaining up to 4 h. Furthermore, the lymphocyte-induced PGI2-output was totally abolished when inhibiting MAPKK by using PD98059, 25 moles/L, a concentration well known to restrain p42/p44MAPK phosphorylation. Changes in fatty acid composition of membrane phospholipids (PL) induced by incubation for 3 days with eicosapentaenoic or docosahexaenoic acids resulted in less basal PGI2 output and adhesion of 51Cr- labeled lymphocytes whilst the lymphocyte-induced PGI2 output was not modified. This lymphocyte-induced PGI2 synthesis which does not primarily involves ECAM pathway is independent of PL fatty acid composition and signals through the p42/p44MAPK cascade.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

Phospholipase D2 regulates endothelial permeability through cytoskeleton reorganization and occludin downregulation.: PLD2 and endothelial permeability

International audienceEndothelial permeability is controlled by adhesive strengths which connect cells to each other through interendothelial junctions and by contractile forces associated with cytoskeleton reorganization. Phospholipase D (PLD) activation resulting in the generation of phosphatidic acid (PA) is increasingly recognized as a key event in the initiation of various cell responses. In human umbilical vein endothelial cells (HUV-EC), enhancement of intracellular PA by a variety of approaches increased the permeability of endothelial cell monolayers and induced stress fibre formation. Using adenovirus-mediated overexpression and siRNA silencing, we showed that PLD2 but not PLD1 was involved in the enhancement of basal permeability through cytoskeleton reorganization. Furthermore, PLD2 overexpression induced ERK1/2 activation and downregulated the expression of occludin, a major component of tight junctions. A substantial part of PLD2 protein was associated with the low-density caveolin-rich fractions isolated on sucrose gradients. The Raf-1 specific inhibitor GW-5074 drastically reduced hyperpermeability induced by PLD2 overexpression, and inhibited PA-mediated increase of endothelial permeability and ERK1/2 activation. On the whole, the present results demonstrate the selective role of PLD2 isoform in the control of endothelial permeability through a mechanism involving both stress fibre formation and contraction, and occludin downregulation, possibly resulting from PA-mediated activation of Raf-1

Phorbol ester-induced differentiation of L6 myogenic cells involves phospholipase D activation

TPA, a potent PKC activator, inhibits myogenic differentiation and activates phospholipase D (PLD). We evaluated the involvement of PLD in the TPA effects on L6 myoblasts differentiation. TPA, at concentrations inhibiting differentiation of L6 cells, induced a strong, though transient, PLD activation. Surprisingly, at nanomolar concentration, TPA induced both myogenic differentiation and sustained activation of PLD. Differential effect of TPA can be ascribed to PKC downregulation induced by highest TPA concentrations. TPA-induced differentiation was inhibited by 1-butanol, confirming the involvement of PLD in this effect. These data suggest that prolonged elevation of PLD activity is required for myogenic differentiation. (C) 2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Federation of European Biochemical Societies