Next generation sequencing in medicine

In recent decades, there has been immense progress in DNA sequencing technologies. One domain where these techniques are undoubtedly transformative is medicine. Understanding the underlying genomic and genetic factors in diseases is important in diagnosis, treatment, and identification of at-risk family members. In this regard, cancer genome analysis provides a better understanding of the underlying tumorigenic mechanisms and gives hope of finding genetic events that contribute to metastasis, recurrence, and therapeutic resistance, which are the most common causes of cancer fatality. In the first part of this thesis, we focus on uncovering the genetic predisposition factors in familial pancreatic cancer. By applying whole exome sequencing (WES) to 109 familial pancreatic cases and performing a filter-based candidate gene approach focused on DNA repair genes, we propose FAN1, NEK1 and RHNO1 as the strongest candidates. In the second part, we investigate the mechanisms underlying resistance to chemotherapy in Triple-negative breast cancer (TNBC). WES- and RNA-seq analysis on serial tumor biopsies during chemotherapy suggests that there are two major factors associated with chemotherapy: RAD21 gene amplification and presence of immune response. The results of this study suggest that RAD21 may be both a marker and a target to overcome drug resistance in TNBCs, and combination of chemotherapy and immunotherapy (anti-PD-1/PD-L1 monoclonal antibody therapies) would improve outcomes of TNBC patients, especially PD-L1-positive patients with low tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in tumors.Furthermore, motivated by accurately identifying pathogenic variants from WES data, I developed an improved ensemble machine learning method, ClinPred, to predict in silico and select pathogenic variants in large-scale sequencing studies. Through rigorous testing, while avoiding problems common in machine learning, such as overfitting and circularity, I showed that ClinPred outperforms all currently available prediction methods, achieving the highest Area Under the Curve (AUC) score and increasing both the specificity and sensitivity in different test datasets. It also obtained the best performance according to various other metrics. Together, our work demonstrates the value of next generation sequencing techniques as powerful tools for understanding the mechanisms of various diseases and their subsequent implications for the clinical arena.Au cours des dernières décennies, d'immenses progrès ont été réalisés dans les technologies de séquençage de l'ADN. Un domaine où ces techniques sont sans aucun doute transformatrices est la médecine. Comprendre les facteurs génomiques et génétiques sous-jacents des maladies est important dans le diagnostic, le traitement et l'identification des membres de la famille du patient à risque. À cet égard, l'analyse de la génomique du cancer permet une meilleure compréhension des mécanismes tumorigéniques sous-jacents et nous donne espoir de trouver les événements génétiques qui mènent aux métastases, à la réapparition du cancer et à la résistance aux traitements thérapeutiques, qui sont les causes les plus fréquentes de décès par le cancer. Dans la première partie de cette thèse, nous nous concentrons sur la découverte des facteurs de prédisposition génétique au niveau du cancer du pancréas familial. En appliquant le séquençage de l'exome entier (WES) à 109 cas pancréatiques familiaux et en utilisant une approche, qui filtre les résultats du séquençage, basée sur des gènes candidats de la réparation de l'ADN, nous proposons FAN1, NEK1 et RHNO1 comme étant les candidats les plus forts. Dans la deuxième partie, nous étudions les mécanismes sous-jacents à la résistance à la chimiothérapie du cancer du sein triple négatif. L'analyse du séquençage de l'exome entier et séquençage haut débit d'ARN des biopsies sur la tumeur lors de plusieurs étapes de la chimiothérapie, suggère qu'il y a deux facteurs majeurs associés à la chimiothérapie : l'amplification du gène RAD21 et la présence d'une réponse immunitaire. Les résultats de cette étude suggèrent que RAD21 pourrait être à la fois un indicateur et une cible pour vaincre la pharmacorésistance du cancer du sein triple négatif, et qu'une combinaison de chimiothérapie et d'immunothérapie (anti-PD-1 / PD-L1) améliorerait les résultats des patients atteints du cancer du sein triple négatif, en particulier les patients atteints de tumeurs PD-L1-positifs / faibles enTILs.De plus, motivée par l'identification précise des variantes pathogènes obtenus à partir des données du séquençage de l'exome entier, j'ai développé une méthode d'apprentissage automatique d'ensemble améliorée, ClinPred, pour prédire in silico et sélectionner des variantes pathogènes dans des études de séquençage à grande échelle. Grâce à des tests rigoureux dans lesquels sont évités les problèmes communs en apprentissage automatique, comme le surapprentissage ou la circularité, j'ai démontré que ClinPred surpasse toutes les méthodes de prédiction actuellement disponibles, en obtenant le score le plus élevé pour la superficie sous la courbe et en ayant plus de spécificité et sensibilité lors de différentes analyses. ClinPred a obtenu les meilleures performances en fonction de divers autres indicateurs.Ensemble, nos travaux démontrent la valeur des techniques de séquençage de nouvelle génération en tant qu'outils puissants pour comprendre les mécanismes de diverses maladies et leurs implications subséquentes pour l'arène clinique

Whole-exome sequencing as a diagnostic tool: current challenges and future opportunities

<p>Whole-exome sequencing (WES) represents a significant breakthrough in the field of human genetics. This technology has largely contributed to the identification of new disease-causing genes and is now entering clinical laboratories. WES represents a powerful tool for diagnosis and could reduce the ‘diagnostic odyssey’ for many patients. In this review, we present a technical overview of WES analysis, variants annotation and interpretation in a clinical setting. We evaluate the usefulness of clinical WES in different clinical indications, such as rare diseases, cancer and complex diseases. Finally, we discuss the efficacy of WES as a diagnostic tool and the impact on patient management.</p

Evaluation of exome filtering techniques for the analysis of clinically relevant genes.

A significant challenge facing clinical translation of exome sequencing is meaningful and efficient variant interpretation. Each exome contains ∼500 rare coding variants; laboratories must systematically and efficiently identify which variant(s) contribute to the patient\u27s phenotype. In silico filtering is an approach that reduces analysis time while decreasing the chances of incidental findings. We retrospectively assessed 55 solved exomes using available datasets as in silico filters: Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), Orphanet, Human Phenotype Ontology (HPO), and Radboudumc University Medical Center curated panels. We found that personalized panels produced using HPO terms for each patient had the highest success rate (100%), while producing considerably less variants to assess. HPO panels also captured multiple diagnoses in the same individual. We conclude that custom HPO-derived panels are an efficient and effective way to identify clinically relevant exome variants. Hum Mutat 2018 Feb; 39(2):197-201

Candidate DNA repair susceptibility genes identified by exome sequencing in high-risk pancreatic cancer

The genetic basis underlying the majority of hereditary pancreatic adenocarcinoma (PC) is unknown. Since DNA repair genes are widely implicated in gastrointestinal malignancies, including PC, we hypothesized that there are novel DNA repair PC susceptibility genes. As germline DNA repair gene mutations may lead to PC subtypes with selective therapeutic responses, we also hypothesized that there is an overall survival (OS) difference in mutation carriers versus non-carriers. We therefore interrogated the germline exomes of 109 high-risk PC cases for rare protein-truncating variants (PTVs) in 513 putative DNA repair genes. We identified PTVs in 41 novel genes among 36 kindred. Additional genetic evidence for causality was obtained for 17 genes, with FAN1, NEK1 and RHNO1 emerging as the strongest candidates. An OS difference was observed for carriers versus non-carriers of PTVs with early stage (≤IIB) disease. This adverse survival trend in carriers with early stage disease was also observed in an independent series of 130 PC cases. We identified candidate DNA repair PC susceptibility genes and suggest that carriers of a germline PTV in a DNA repair gene with early stage disease have worse survival